CN116077675A - 双亲性喜树碱前药及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种透明质酸‑喜树碱前药及其制备方法和应用。本发明选择分子量均一、结构明确的透明质酸寡糖片段与喜树碱类药物进行偶联，偶联位置选择了透明质酸的还原端，减少了对透明质酸链的结构破坏，保持了其靶向作用和糖链受体结合能力，连接臂中包含了可在体内断裂的化学键，特别是对氧化还原敏感的二硫键，在肿瘤微环境高浓度谷胱甘肽作用下，二硫键会迅速断裂，快速释放喜树碱，提高了喜树碱类药物递送的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明涉及化学药物技术领域，具体涉及一种透明质酸-喜树碱前药及其制备方法。
背景技术
喜树碱(Camptothecin,CPT)是一种从中国特有的药用植物喜树中分离得到的天然化合物，其为吡咯喹啉细胞毒性生物碱。早在20世纪60年代就已知该化合物具有很强的抗癌活性，但因其水溶性差、毒副作用大，制成水溶性钠盐后抗肿瘤活性降低等原因，使其应用受到限制。喜树碱是以拓扑异构酶(Topo I)为作用靶点抑制DNA的合成而发挥抗癌作用的。由于Topo I在癌细胞中的含量要比正常细胞高得多，这一抗癌机理的发现表明，从喜树碱及其衍生物或类似物中可能筛选出对癌细胞有选择性杀灭作用而对正常细胞的影响不大、高效低毒的新药。
前药可以改善药物的生物利用度、代谢稳定性和靶向性，降低药物毒副作用并减少给药量。因此，设计一种新型喜树碱前药递送系统具有一定意义。
传统前药纳米药物递送系统，通常采用聚合物材料(例如聚乙二醇)以化学键的方式连接药物，该策略可以有效提高制剂稳定性，但同时聚合物材料的高分子量也导致药物递送系统结构复杂、合成困难、载药量低，药物释放后，还需考虑聚合物材料自身消化及代谢对生理的影响。因此仍然需要寻找效果更佳的喜树碱前药。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种透明质酸-喜树碱前药及其制备方法和应用。
本发明提供了一种透明质酸-喜树碱前药的制备方法，所述的透明质酸-喜树碱前药制备包括如下反应路线：
其中：
R选自：单键、季戊四醇残基、甘油残基或聚甘油残基；
X选自：单键、-S-S-、-S-、-S-S-S-、-Se-、-Se-Se-、-NHN＝CH-、-OCO-或-COO-，优选地，X为-S-S-；
CPT为喜树碱类衍生物；
CPT'为喜树碱类衍生物的残基；
a为2或3，优选地，a为2；
b为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，优选地，b为3；
c为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，c为1；
d为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，优选地，d为3；
e为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，e为1或2；
f为0或1；
g为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，g为2；
h为0或1，优选地，h为1；
i为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，i为2。
进一步地，所述的步骤(A1)包括：将CPT、二元羧酸Ⅰ、催化剂A1和脱水剂A1在溶剂A1中进行反应，得到喜树碱中间体Ⅱ。
进一步地，所述的CPT选自如下结构：
优选地，所述的CPT为
在本发明的一个实施例中，所述的CPT为
进一步地，所述的CPT'选自如下结构：
优选地，所述CPT'为
进一步地，所述的二元羧酸I的结构中X为单键或-S-S-，g为2或3，h为0或1，i为2或3。
进一步地，所述的二元羧酸I选自：3,3’-二硫代二丙酸或4,4’-二硫代二丁酸。
进一步地，所述的二元羧酸I选自：辛二酸或己二酸。
优选地，所述的二元羧酸I为辛二酸或3,3’-二硫代二丙酸。
更优选地，所述的二元羧酸I为3,3’-二硫代二丙酸。
在本发明的一个实施例中，所述的二元羧酸I为3,3’-二硫代二丙酸。
在本发明的另一个实施例中，所述的二元羧酸I为辛二酸。
进一步地，所述的喜树碱中间体Ⅱ的结构中CPT'为
X为单键或-S-S-，g为2或3，h为0或1，i为2或3。
优选地，所述的喜树碱中间体Ⅱ的结构中CPT'为
X为-S-S-，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的喜树碱中间体Ⅱ的结构中CPT'为
X为单键，g为3，h为0，i为3。
在本发明的一个实施例中，所述的喜树碱中间体Ⅱ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的喜树碱中间体Ⅱ的结构如下式所示：
进一步地，所述的催化剂A1选自：DMAP、N,N二甲基苯胺、1-羟基苯并三氮唑、4-吡咯烷基吡啶、哌啶或三乙胺，优选地，所述的催化剂A1为DMAP。
进一步地，所述的脱水剂A1选自：EDCI、DIC、DCC或NHS，优选地，所述的脱水剂A1为EDCI。
进一步地，所述的溶剂A1选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A1为二氯甲烷/四氢呋喃。
进一步地，所述的步骤(A1)的反应温度为20-30℃，例如室温。
进一步地，所述的步骤(A1)的反应时间为12-48小时，例如24小时。
进一步地，所述的步骤(A1)中还包括除去溶剂和纯化的步骤。
进一步地，所述的除去溶剂的方法为真空减压下除去溶剂。
进一步地，所述的纯化的方法为硅胶柱层析。
进一步地，所述的步骤(A2)包括：将所述的喜树碱中间体Ⅱ与炔基-PEG衍生物Ⅲ、催化剂A2和脱水剂A2在溶剂A2中进行反应，得到炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ。
在本发明的一些实施例中，R为单键。
在本发明另一些实施例中，R为季戊四醇残基，例如
进一步地，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ的结构中R为单键或季戊四醇残基；c为1；d为3；e为1或2；f为0或1。
优选地，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ的结构中R为单键，c为1，d为3，e为1，f为0，即所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ为2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇。
优选地，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ的结构中R为季戊四醇残基，c为1，d为3，e为2，f为1，即所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ为二(2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙基季戊四醇。
在本发明的一个实施例中，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ的结构如下式所示：
进一步地，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构中CPT'为
R为单键或季戊四醇残基，X为单键或-S-S-，c为1，d为3，e为1或2，f为0或1，g为2或3，h为0或1，i为2或3。
优选地，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构中CPT'为
R为单键，X为-S-S-，c为1，d为3，e为1，f为0，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构中CPT'为
R为季戊四醇残基，X为-S-S-，c为1，d为3，e为2，f为1，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构中CPT'为
R为单键，X为单键，c为1，d为3，e为1，f为0，g为3，h为0，i为3。
在本发明的一个实施例中，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ的结构如下式所示：
进一步地，所述的催化剂A2选自：DMAP、N,N二甲基苯胺、1-羟基苯并三氮唑、4-吡咯烷基吡啶、哌啶或三乙胺，优选地，所述的催化剂A2为DMAP。
进一步地，所述的脱水剂A2选自：EDCI、DIC、DCC或NHS，优选地，所述的脱水剂A2为EDCI。
进一步地，所述的溶剂A2选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A2为DMF。
进一步地，所述的步骤(A2)的反应温度为20-30℃，例如室温。
进一步地，所述的步骤(A2)的反应时间为12-48小时，例如24小时。
进一步地，所述的步骤(A2)中还包括除去溶剂和纯化的步骤。
进一步地，所述的除去溶剂的方法为真空减压下除去溶剂。
进一步地，所述的纯化的方法为硅胶柱层析。
进一步地，所述的步骤(A3)包括：将所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ与透明质酸中间体Ⅴ和铜催化剂在溶剂A3中混合，在惰性气体保护下反应，得到透明质酸-喜树碱前药Ⅵ。
进一步地，所述的透明质酸中间体Ⅴ的结构中a为2或3，b为3。
优选地，所述的透明质酸中间体Ⅴ的结构中a为2，b为3。
在本发明的一个实施例中，所述的透明质酸中间体Ⅴ的结构如下式所示：
进一步地，所述的透明质酸中间体Ⅴ的制备包括如下反应路线：
其中：
R1为C1-6烷基(如甲基)；
R2为羟基保护基团(如乙酰基)；
表示步骤(B6)是任选的(a＞2时存在)(可存在或不存在)。
进一步地，所述的步骤(B1)包括：化合物V1分别与醇、羟基保护剂反应，得到化合物V2。
进一步地，所述醇可以为C1-3的醇，例如甲醇、乙醇。
进一步地，所述羟基保护剂可以依据R1进行适当选择，例如，R1为乙酰基时，所述羟基保护剂可以为乙酰氯、乙酸酐。
进一步地，所述的步骤(B2)包括：(在溶剂B1中)化合物V2与DMAPA混合，在惰性气体保护下反应，得到化合物V3。
进一步地，所述溶剂B1为THF。
进一步地，所述惰性气体为氩气。
进一步地，所述的步骤(B2)中所述反应温度为20-30℃，例如室温。
进一步地，所述的步骤(B2)中所述反应时间为0.5-6小时，例如1小时。
进一步地，所述的步骤(B3)包括：(在溶剂B2中)化合物V3与三氯乙腈、碱混合，在惰性气体保护下反应，得到化合物V4。
进一步地，所述溶剂B2为二氯甲烷。
进一步地，所述碱为有机强碱，例如1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)。
进一步地，所述惰性气体为氩气。
进一步地，所述的步骤(B3)中所述反应温度为20-30℃，例如室温。
进一步地，所述的步骤(B3)中所述反应时间为0.5-6小时，例如2小时。
进一步地，所述的步骤(B4)包括：(在溶剂B3中)将化合物V4和化合物
混合，在酸存在下，在惰性气体保护下反应，得到化合物V6。
进一步地，所述溶剂B3为二氯甲烷。
进一步地，所述酸为有机强酸，例如三氟甲磺酸。
进一步地，所述惰性气体为氩气。
进一步地，所述的步骤(B4)中所述反应温度为20-30℃，例如室温。
进一步地，所述的步骤(B4)中所述反应时间为6-18小时，例如12小时。
进一步地，所述的步骤(B5)可采用任何合适的脱保护步骤，例如，将化合物V6与过氧化氢溶液、LiOH混合，0℃下反应然后室温反应，加入甲醇、NaOH溶液，室温下反应，得到化合物V7。
所述的步骤(B6)可存在或不存在，例如，a＝2时，步骤(B6)不存在；a＝3时，步骤(B6)的反应路线为：
如果需要的话(a＞2)，所述的步骤(B6)包括：将化合物V1作为起始底物，通过添加糖核苷酸和GlcA-transferase(GA-T)与GlcNAc-transferase(GN-T)，制备得到所需的V。
进一步地，所述酶法反应体系包括：MgCl2、缓冲液(例如Tris-HCl)、GN-T/GA-T。
进一步地，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构中CPT'为
R为单键或季戊四醇残基，X为单键或-S-S-，a为2或3，b为3，c为1，d为3，e为1或2，f为0或1，g为2或3，h为0或1，i为2或3。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构中CPT'为
R为单键，X为-S-S-，a为2，b为3，c为1，d为3，e为1，f为0，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构中CPT'为
R为季戊四醇残基，X为-S-S-，a为2，b为3，c为1，d为3，e为2，f为1，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构中CPT'为
R为单键，X为单键，a为2，b为3，c为1，d为3，e为1，f为0，g为3，h为0，i为3。
在本发明的一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ的结构如下式所示：
进一步地，所述的铜催化剂选自：四氟硼酸四乙腈铜、硫酸铜、溴化铜或碘化铜，优选地，所述的铜催化剂为四氟硼酸四乙腈铜。
进一步地，所述的溶剂A3选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A3为水/二氯甲烷。
进一步地，所述的惰性气体为氩气。
进一步地，所述的步骤(A3)的反应温度为30-45℃，例如37℃。
进一步地，所述的步骤(A3)的反应时间为12-48小时，例如18、24、36小时。
进一步地，所述的步骤(A3)中还包括除去溶剂、萃取和纯化的步骤。
进一步地，所述的除去溶剂的方法为真空减压下除去溶剂。
进一步地，所述的萃取所用的萃取剂为EDTA水溶液和二氯甲烷。
进一步地，所述的纯化的方法为HPLC。
在本发明的一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的制备方法的步骤如下：
步骤1：将3,3’-二硫代二丙酸溶于四氢呋喃中，加入DMAP和EDCI，0℃下反应2小时后，加入喜树碱和二氯甲烷，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(100:1至20:1,二氯甲烷:甲醇)纯化，得到喜树碱中间体；
步骤2：0℃下，将喜树碱中间体、DMAP和EDCI溶于无水DMF中反应2小时后，加入2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1:3至1:4,石油醚:乙酸乙酯)纯化，得到炔丙基-PEG3-SS-喜树碱(PSC)；
步骤3：室温下，将炔丙基-PEG3-SS-喜树碱与化合物20溶于水和二氯甲烷中，氩气保护，加入四氟硼酸四乙腈铜后于37℃下搅拌18小时，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶(聚丙烯酰胺凝胶)纯化，得到HA4-PSC(HSC)前药。
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的制备方法的步骤如下：
步骤1：将辛二酸溶于四氢呋喃中，加入DMAP和EDCI，冰浴下反应2小时后，加入喜树碱和二氯甲烷，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(40:1,二氯甲烷:甲醇)纯化，得到喜树碱中间体；
步骤2：0℃下，将喜树碱中间体、DMAP和EDCI溶于无水DMF中，加入2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1:2至1:3.5,石油醚:乙酸乙酯)纯化，得到炔丙基-PEG3-CC-喜树碱(PCC)；
步骤3：室温下，将炔丙基-PEG3-CC-喜树碱与化合物20溶于水和二氯甲烷中，氩气保护，加入四氟硼酸四乙腈铜后于37℃下搅拌18小时，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶纯化，得到HA4-PCC(HCC)前药。
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的制备方法的步骤如下：
步骤1：将3,3’-二硫代二丙酸溶于四氢呋喃中，加入DMAP和EDCI，0℃下反应2小时后，加入喜树碱和二氯甲烷，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(100:1至20:1,二氯甲烷:甲醇)纯化，得到喜树碱中间体；
步骤2：0℃下，将喜树碱中间体、DMAP和EDCI溶于无水DMF中，加入二(2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙基季戊四醇，室温下反应24小时，真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1:3至1:4,石油醚:乙酸乙酯)纯化，得到双炔丙基-双PEG3-SS-喜树碱(P2SC)和双炔丙基-双PEG3-双SS-双喜树碱(P2SC2)；
步骤3：室温下，将双炔丙基-双PEG3-SS-喜树碱与化合物20溶于水和二氯甲烷中，氩气保护，加入四氟硼酸四乙腈铜后于37℃下搅拌24小时，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶纯化，得到2HA4-P2SC(2HSC)前药。
本发明还提供了一种透明质酸-喜树碱前药，所述的透明质酸-喜树碱前药具有通式(Ⅵ)的结构：
其中：
R选自：单键、季戊四醇残基、甘油残基或聚甘油残基；
X选自：单键、-S-S-、-S-、-S-S-S-、-Se-、-Se-Se-、-NHN＝CH-、-OCO-或-COO-，优选地，X为-S-S-；
CPT'为喜树碱类衍生物的残基；
a为2或3，优选地，a为2；
b为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，优选地，b为3；
c为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，c为1；
d为1-10的整数(具体如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)，优选地，d为3；
e为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，e为1或2；
f为0或1；
g为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，g为2；
h为0或1，优选地，h为1；
i为1-6的整数(具体如1、2、3、4、5、6)，优选地，i为2。
进一步地，所述的CPT'选自如下结构：
优选地，所述CPT'为
进一步地，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构中CPT'为
R为单键或季戊四醇残基，X为单键或-S-S-，a为2或3，b为3，c为1，d为3，e为1或2，f为0或1，g为2或3，h为0或1，i为2或3。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构中CPT'为
R为单键，X为-S-S-，a为2，b为3，c为1，d为3，e为1，f为0，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构中CPT'为
R为季戊四醇残基，X为-S-S-，a为2，b为3，c为1，d为3，e为2，f为1，g为2，h为1，i为2。
优选地，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构中CPT'为
R为单键，X为单键，a为2，b为3，c为1，d为3，e为1，f为0，g为3，h为0，i为3。
在本发明的一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构如下式所示：
在本发明的另一个实施例中，所述的透明质酸-喜树碱前药的结构如下式所示：
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述透明质酸-喜树碱前药以及一种或多种药学上可接受的辅料。
进一步地，所述的药学上可接受的辅料是指药学领域常规的药物辅料，例如，稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；吸收促进剂如季铵化合物等；表面活性剂如十六烷醇等；吸附载体如高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。另外，还可以在药物组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
进一步地，所述的药物组合物适于胃肠给药或非胃肠给药，如通过静脉内、肌内、皮内和皮下途径给药，因此，优选的，所述的药物组合物还包括抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，和使制剂与接受者的血液等渗的溶质，以及含水和非水的无菌悬浮剂，其可包含助悬剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。
进一步地，所述的药物组合物可以为片剂(包括糖衣片剂、膜包衣片剂、舌下片剂、口腔崩解片、口腔片剂等等)、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂(包括软胶囊、微胶囊)、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂、控制释放制剂(例如，瞬时释放制剂、缓释制剂、缓释微囊)、气雾剂、膜剂(例如，口服崩解膜剂、口腔粘膜-粘附膜剂)、注射剂(例如，皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)、静脉滴注剂、透皮吸收制剂、软膏剂、洗剂、粘附制剂、栓剂(例如，直肠栓剂、阴道栓剂)、小药丸、鼻制剂、肺制剂(吸入剂)、眼睛滴剂等等。
本发明还提供了一种透明质酸-喜树碱前药在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。
进一步地，所述的肿瘤为恶性肿瘤，其包括但不限于：淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜细胞肉瘤、神经内分泌肿瘤、类癌肿瘤、胃泌素瘤、胰岛细胞癌、间皮瘤、神经鞘瘤、听神经瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、腺癌肺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、梅克尔细胞癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈部癌，等等。
优选地，所述的肿瘤选自：肺癌、胃癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病、肝癌或头颈部癌。
本发明利用结构均一明确的透明质酸四糖与喜树碱进行偶联，克服了传统前药结构的不均一性及批次差异性。偶联位置选择了透明质酸的还原端以避免传统偶联方式对透明质酸羧基的破坏问题。连接臂中包含了氧化还原敏感的二硫键，在肿瘤微环境高浓度谷胱甘肽作用下，二硫键会迅速断裂，快速释放喜树碱，有望提高喜树碱药物传递的安全性和有效性。
该前药选择透明质酸四糖作为亲水端和靶向配体，喜树碱作为疏水端和药物模型，可以利用双亲性实现自组装，兼具高载药能力和高选择性释药能力的双重优势，可以高效向肿瘤部位递送药物喜树碱，进一步提高喜树碱药物传递的安全性和有效性。
本发明具有如下有益效果：
(1)将喜树碱与透明质酸寡糖偶联并制备纳米颗粒，充分利用了纳米颗粒的EPR效应下的被动靶向性和透明质酸与受体结合的主动靶向性特点。将有效提高药物在体内的稳定转运，靶向递送和定位释放，降低药物的毒副作用，提高治疗效果；
(2)选择分子量均一、结构明确的透明质酸寡糖片段进行偶联反应，所得前药结构性质明确，无批次差异，具有完全的可重复性，能够深入阐述糖链长度和糖链结构对药物活性的影响关系；
(3)发展糖链簇效应，实现了两个透明质酸二糖单元连接一分子药物，较传统的透明质酸载体具有更高的透明质酸利用率，载药量高，更是大于传统脂质体的载药量；
(4)选择透明质酸还原端进行偶联反应，减少对透明质酸链的结构破坏，保持其靶向作用和糖链受体结合能力；
(5)在药物与透明质酸寡糖偶联中选择了氧化还原敏感的二硫键将药物制成前药，利用肿瘤细胞特殊的微环境进行释药，降低了对正常细胞的毒副作用；
(6)该前药具有联合用药的潜在价值，可以按照1:1的摩尔比释放两种抗肿瘤药物，发挥协同治疗效果。
附图说明
图1所示为CPT、HCC、HSC以及2HSC对A549的细胞毒性。
图2所示为CPT、HCC、HSC以及2HSC处理后A549的共聚焦成像
图3所示为HSC和2HSC共聚焦成像的显著性差异。
图4所示为不同浓度HA下HSC对A549的细胞毒性。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明中，术语“烷基”指的是直链或支链的且不含不饱和键的烃链自由基，且该烃链自由基以单键与分子其它部分连接。在本文中，C1-6烷基是指含有1至6(例如1、2、3、4、5、6)个碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。
在本发明中，存在“保护基团”的描述，当多官能基有机化合物进行反应时，为使反应只发生在所希望的基团处，而避免其他基团遭受影响，此反应前将其他基团加以保护，当反应完成后再恢复，为使基团受到保护，而在该基团上引入的取代基称为“保护基团”。例如，“羟基保护基团”是指与羟基相连的阻止或保护羟基官能团的取代基，示例性的羟基保护基团包括但不限于烷基醚或取代的烷基醚例如甲基、烯丙基、苄基、取代的苄基、甲硅烷基醚例如三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、t-丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)等，缩醛或缩酮，例如四氢吡喃(THP)，酯例如甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯等，碳酸酯、磺酸酯例如甲磺酸酯(甲磺酸酯)、苄基磺酸酯。针对保护基团的一般描述及其用途，参见T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley&Sons,New York,1991。能保护某种基团的试剂称为该基团的保护剂。例如，MsCl可作为羟基的保护剂，相应的羟基保护基团为Ms。
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
实施例中所用的试剂和溶剂的缩写如下：DIC：二异丙基碳二亚胺；DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺；EDCI：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基丁二酰亚胺；DMAP：4-二甲氨基吡啶；DMAPA：3-二甲氨基丙胺；C2Cl3N：三氯乙腈；DBU：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯；THF：四氢呋喃；DCM：二氯甲烷；EtOAc：乙酸乙酯；MeOH：甲醇；TEA：三乙胺；TsCl：对甲苯磺酰氯；TfOH：三氟甲磺酸。
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：炔丙基-PEG3-SS-喜树碱(Propargyl-PEG3-SS-CPT，PSC)的合成
首先将三乙二醇(TEG，化合物1，1.0g，6.66mmol，1.0eq.)溶于无水DMF(10mL)中，然后加入无水K2CO3(1.38g，9.98mmol，1.5eq.)。60℃下搅拌12h后过滤除去不溶物。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1∶1，乙酸乙酯/石油醚)纯化残余物，得到所需产物化合物2(1.01g，81％)。化合物2：1H NMR(600MHz，CDCl3)δ：4.22(d，J＝2.2Hz，2H，-CH2C≡CH)，3.76-3.64(m，10H，-OCH2)，3.63-3.59(m，2H，-CH2OH)，2.41(t，J＝2.2Hz，1H，-C≡CH)；13CNMR(150MHz，CDCl3)δ：79.6，74.7，72.5，70.6，70.4，70.3，69.1，61.7，58.3.
将3，3’-二硫代二丙酸(DTPA，3.0g，14.27mmol，5.0eq.)溶于四氢呋喃(40mL)中。加入DMAP(363mg，2.98mmol，1.0eq.)和EDCI(912mg，4.76mmol，1.6eq.)。0℃下搅拌2h后加入喜树碱(CPT，化合物3，1.0g，2.87mmol，1.0eq.)和二氯甲烷(200mL)，继续在室温下搅拌24h。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(100∶1至20∶1，二氯甲烷/甲醇)纯化残余物，得到所需产物化合物4(1.28g，83％)。化合物4：1H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ：12.33(s，1H，COOH)，8.70(s，1H，＝CH)，8.16(d，J＝8.4Hz，1H，Ph)，8.14(d，J＝8.2Hz，1H，Ph)，7.89-7.85(m，1H，Ph)，7.74-7.71(m，1H，Ph)，7.19(s，1H，＝CH-)，5.54-5.47(m，2H，-OCH2-)，5.35-5.28(m，2H，-NCH2-)，3.03-2.89(m，6H)，2.60(t，J＝6.9Hz，2H)，2.20-2.13(m，2H)，0.93(t，J＝7.4Hz，3H，-CH3).
0℃下，将化合物4(1.50g，2.78mmol，1.0eq.)、EDCI(1.07g，5.56mmol，2.0eq.)和DMAP(170mg，1.39mmol，0.5eq.)溶于无水DMF(10mL)中搅拌2h。加入2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(化合物2)(1.04g，5.56mmol，2.0eq.)后继续在室温下反应24h。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1∶3至1∶4，石油醚：乙酸乙酯)纯化残余物，得到所需化合物5(1.44g，73％)。化合物5：1H NMR(600MHz，CDCl3)δ：8.40(s，1H，＝CH-)，8.23(d，J＝8.5Hz，1H，Ph)，7.95(d，J＝8.1Hz，1H，Ph)，7.84(t，J＝7.7Hz，1H，Ph)，7.69-7.66(m，1H，Ph)，7.26(s，1H，＝CH-)，5.69(d，J＝17.1Hz，1H)，5.41(d，J＝17.1Hz，1H)，5.30(s，3H)，4.22-4.19(m，4H)，3.71-3.62(m，10H)，2.99-2.89(m，6H)，2.74(t，J＝7.2Hz，2H)，2.43(t，J＝2.4Hz，1H)，2.33-2.26(m，1H)，2.21-2.14(m，1H)，0.99(t，J＝7.5Hz，3H，CH3)；13C NMR(150MHz，CDCl3)δ：171.6，170.7，167.3，157.3，152.3，148.9，146.3，145.7，131.2，130.7，129.7，128.5，128.2，128.0，120.2，96.1，79.6，76.3，74.5，70.6，70.5，70.4，69.1，69.0，67.1，63.9，58.4，50.0，34.0，33.8，33.0，32.4，31.8，7.6。
实施例2：炔丙基-PEG3-CC-喜树碱(Propargyl-PEG3-CC-CPT，PCC)的合成
将辛二酸(2.02g，11.59mmol，4.8eq.)溶于四氢呋喃(40mL)中，加入DMAP(294mg，2.41mmol，1.0eq.)和EDCI(739mg，3.85mmol，1.6eq.)。将混合物在冰浴中搅拌2h，然后加入喜树碱(CPT，化合物3，840mg，2.411mmol，1.0eq.)和二氯甲烷(200mL)，混合物在室温下继续搅拌24h。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(40:1,二氯甲烷/甲醇)纯化残余物，得到所需产物化合物6(1.03g，85％)。
0℃下，将化合物6(400mg，0.79mmol，1.0eq.)、EDCI(373mg，1.98mmol，2.0eq.)和DMAP(77mg，0.63mmol，0.8eq.)加入无水DMF(10mL)中，加入2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(化合物2)(400mg，0.79mmol，1.0eq.)后继续在室温下反应24h。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1:2至1:3.5,石油醚:乙酸乙酯)纯化残余物，得到所需化合物7(428mg，80％)。化合物7：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.40(s,1H,＝CH–),8.22(d,J＝8.5Hz,1H,Ph),7.94(d,J＝8.0Hz,1H,Ph),7.85-7.83(m,1H,Ph),7.68-7.66(m,1H,Ph),7.22(s,1H,＝CH–),5.67(d,J＝17.0Hz,1H),5.41(d,J＝17.0Hz,1H),5.28(d,J＝2.8Hz,2H),4.20-4.17(m,4H),3.71-3.65(m,10H),2.54-2.44(m,3H),2.31-2.26(m,3H),2.19-2.13(m,1H),1.68-1.63(m,2H),1.61-1.56(m,2H),1.40-1.29(m,4H),0.98(t,J＝7.5Hz,3H,CH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:173.6,172.6,167.6,157.4,152.4,148.9,146.2,146.0,131.3,130.7,129.6,128.5,128.3,128.2,128.0,120.3,96.0,79.7,75.7,74.6,70.6,70.5,70.4,69.2,69.1,67.1,63.4,58.4,49.9,34.0,33.7,31.9,28.7,28.6,24.6,24.4,7.6。
实施例3：双炔丙基-双PEG3-单/双SS-单/双喜树碱(dPropargyl-dPEG3-s/dSS-s/dCPT，P2SC/P2SC2)的合成
将化合物2(1.0g，5.31mmol，1.0eq.)溶于二氯甲烷(15mL)中。0℃下加入TEA(1.48mL，10.63mmol，2.0eq.)和TsCl(1.32g，6.91mmol，1.3eq.)，反应液于室温下继续搅拌6h。通过硅胶柱色谱(12:1至3:1,石油醚:乙酸乙酯)纯化残余物，得到所需化合物8(1.75g，96％)。化合物8：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.81(d,2H,J＝8.1Hz,Ph),7.35(d,2H,J＝8.1Hz,Ph),4.20(d,2H,J＝2.2Hz,–CH2C≡CH),4.17(t,2H,J＝4.8Hz,–CH2OTs),3.71-3.67(m,4H,–OCH2),3.65-3.62(m,2H,–OCH2),3.58-3.60(m,4H,–OCH2),2.46(s,3H,PhCH3),2.43(t,1H,J＝2.2Hz,–CH2C≡CH)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:144.9,133.2,130.00,128.1,79.8,74.7,70.9,70.7,70.6,69.4,69.2,68.9,58.6,21.8。
0℃下，将化合物8(840mg，2.456mmol，3.0eq.)滴加到化合物9(200mg，0.819mmol，1.0eq.)和NaH(82mg，2.047mmol，2.5eq.)在THF中的混合物中。将所得混合物在60℃下回流16h。用1M HCl中和反应。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(8:1至2:3,石油醚/乙酸乙酯)纯化残余物，得到化合物10(342mg，74％)。化合物10：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:7.48-7.46(m,2H,Ph),7.38-7.32(m,3H,Ph),5.42(s,1H,PhCH),4.21-4.19(m,4H),4.09(d,J＝11.8Hz,2H),3.90(d,J＝11.8Hz,2H),3.78(s,2H),3.72-3.62(m,22H),3.58-3.54(m,2H),3.31(s,2H),2.44(t,J＝2.4Hz,2H,–C≡CH)。
将化合物10(300mg，0.532mmol)在MeOH(10mL)中溶解，用浓盐酸调节至pH＝1。将所得混合物在室温下搅拌10h。反应完成后在减压下除去溶剂。通过硅胶柱色谱(100:1至50:1，乙酸乙酯/甲醇)纯化粗产物，得到化合物11(233mg，92％)。化合物11：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:4.16-4.14(m,4H),3.66-3.56(m,28H),3.47(s,4H),2.42-2.40(m,2H,–C≡CH)。
0℃下，将化合物4(如实施例1制备)(100mg，0.185mmol，2.0eq.)、EDCI(72mg，0.371mmol，4.0eq.)和DMAP(23mg，0.185mmol，3.0eq.)溶于无水DMF(5mL)中搅拌2h。加入化合物11(45mg，0.093mmol，1.0eq.)后继续在室温下反应24h。真空减压下除去溶剂后，通过硅胶柱色谱(1:3至1:4,石油醚:乙酸乙酯)纯化残余物，得到所需化合物12(28.3mg，30％)和化合物13(30.1mg，21％)。化合物12：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.41(s,1H,＝CH–),8.23(d,J＝8.5Hz,1H,Ph),7.95(d,J＝8.0Hz,1H,Ph),7.87-7.83(m,1H,Ph),7.70-7.66(m,1H,Ph),7.26(s,1H,＝CH–),5.68(d,J＝17.1Hz,1H),5.41(d,J＝17.1Hz,1H),5.30(m,2H),4.20(d,J＝2.4Hz,4H),4.13(s,2H),3.71-3.54(m,26H),3.49-3.43(m,4H),3.01-2.89(m,6H),2.72(t,J＝7.1Hz,2H),2.44(t,J＝2.4Hz,2H),2.33-2.26(m,1H),2.21-2.14(m,1H),0.99(t,J＝7.5Hz,3H,CH3)；化合物13：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:8.39(s,1H,＝CH–),8.23-8.21(m,2H,Ph),7.95-7.93(m,2H,Ph),7.86,-7.82(m,2H,Ph),7.68-7.65(m,2H,Ph),7.25(s,1H,＝CH–),5.68(d,J＝17.0Hz,2H),5.40(d,J＝17.0Hz,2H),5.29-5.27(m,4H),4.19(d,J＝2.4Hz,4H),4.09-4.06(m,4H),3.70-3.56(m,20H),3.54-3.50(m,4H),3.40-3.39(m,4H),3.00-2.86(m,12H),2.69(t,J＝7.1Hz,4H),2.44(t,J＝2.4Hz,2H),2.32-2.25(m,2H),2.20-2.13(m,2H),0.99(t,J＝7.5Hz,6H,CH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:171.2,170.7,167.3,157.3,152.3,148.8,146.3,145.6,131.2,130.7,129.6,128.5,128.2,128.1,128.0,120.1,96.1,79.7,76.3,74.6,71.1,70.6,70.6,70.4,70.3,69.5,69.1,67.1,63.5,58.4,50.0,43.6,33.9,33.7,32.9,32.3,31.8,7.6。
实施例4：化合物20的合成
将1.4L无水甲醇加入圆底烧瓶中，放入-20℃冰箱中完全冷却后取出，加入12mL乙酰氯，在4℃条件下缓慢搅拌。在此溶液中加入10g多糖混合物14，继续在4℃条件下搅拌3天。待溶液从淡黄色变为深红色后，加入Na2CO3调节pH为中性，滤除沉淀，蒸干溶剂，得到深红色固体。
将上一步所得的深红色固体加入圆底烧瓶中，加入83.2mL吡啶，氩气保护，0℃条件下将41.6mL乙酸酐于30min内逐滴加入上述混合物中，缓慢升至室温并搅拌20h。TLC监测(CH2Cl2:EtOAc:MeOH,1:1:0.2)反应结束后将反应体系降至0℃，加入16.8mL甲醇搅拌20min淬灭反应。蒸干溶剂，加入320mL EtOAc稀释后继续搅拌20min，滤除沉淀，蒸干滤液，用硅胶柱层析纯化(CH2Cl2:EtOAc:MeOH,1:1:0.08至1:1:0.12,包含0.1％ Et3N)，得化合物15，其为α/β构型的混合物(1.2g)。化合物15：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:7.84(d,J＝9.2Hz,2H),7.75(d,J＝9.0Hz,1H),7.43(d,J＝9.3Hz,3H),5.77(d,J＝3.7Hz,2H),5.54(d,J＝8.3Hz,1H),5.27(t,J＝9.5Hz,3H),5.06(t,J＝9.3Hz,1H),4.97(dt,J＝9.3,5.1Hz,4H),4.91-4.78(m,9H),4.70(t,J＝9.3Hz,1H),4.66-4.47(m,8H),4.30(d,J＝10.0Hz,6H),4.22(dd,J＝12.6,4.0Hz,3H),4.14-3.99(m,9H),3.98-3.89(m,6H),3.89-3.78(m,19H),3.76-3.68(m,4H),3.64(s,9H),3.51(s,3H),2.18(s,6H),2.05-1.95(m,50H),1.95-1.89(m,33H),1.89-1.84(m,19H)。
将化合物15(3.0g,2.4mmol,1.0eq.)氩气保护下溶于30mL THF中，分5次加入DMAPA(615μL，4.9mmol,2.0eq.)，每次间隔30min。室温下反应1h，TLC(CH2Cl2:EtOAc:MeOH,1:1:0.2)监测反应结束后，加入1M盐酸溶液淬灭反应，加入300mL CH2Cl2稀释反应液，用饱和NaHCO3溶液及饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，滤除干燥剂蒸干有机相，用硅胶柱层析纯化(CH2Cl2:EA:MeOH,1:1:0.08至1:1:0.2)，得化合物16。
将化合物16在冰浴条件下溶于30mL干燥的CH2Cl2溶液中，加入三氯乙腈(1.9mL，19.2mmol,8.0eq.)及DBU(72μL，0.48mmol,0.2eq.)，氩气保护室温下反应2h，TLC(CH2Cl2:EtOAc:MeOH,1:1:0.2)监测反应结束后蒸干溶剂，用硅胶柱层析纯化(CH2Cl2:EA:MeOH,1:1:0.07至1:1:0.1)，得化合物17(1.25g,39％,从化合物15到17)。化合物17：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.80(s,1H),6.21(d,J＝3.8Hz,1H),5.90(d,J＝7.7Hz,1H),5.81(d,J＝9.6Hz,1H),5.19(t,J＝9.3Hz,1H),5.14-5.04(m,3H),4.90-4.86(m,1H),4.81-4.72(m,4H),4.64-4.55(m,2H),4.39(t,J＝9.6Hz,1H),4.27(dd,J＝12.4,4.4Hz,1H),4.16(dd,J＝12.4,4.3Hz,1H),4.13-3.99(m,6H),3.96(d,J＝10.0Hz,1H),3.91-3.83(m,1H),3.82(s,3H),3.70(s,3H),3.63(ddd,J＝9.9,4.4,2.4Hz,1H),3.16(d,J＝9.0Hz,1H),2.08-1.96(m,40H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:171.2,171.0,170.8,170.2,169.9,169.8,169.7,169.3,169.2,169.1,168.0,167.0,160.2,100.9,100.0,98.8,95.3,90.8,75.8,74.8,72.3,72.1,71.8,71.7,71.6,70.1,69.4,68.0,67.7,61.8,61.7,60.4,57.6,53.4,53.0,52.7,51.8,23.6,23.4,23.2,21.1,20.8,20.7,20.7,20.6,20.5,20.5,20.4。
将化合物17(1.22g,0.92mmol,1.0eq.)及18(1.45g,8.27mmol,9.0eq.)溶于15mL干燥的CH2Cl2溶液中，加入三氟甲磺酸(8.8μL,0.1mmol,0.1eq.)，于氩气保护下室温反应过夜。TLC(CH2Cl2:EtOAc:MeOH,1:1:0.2)监测反应结束后蒸干溶剂，用硅胶柱层析纯化(CH2Cl2:EA:MeOH,1:1:0.07至1:1:0.1)，得化合物19(945mg,77％)。化合物19：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.28-6.22(m,1H),6.03(d,J＝7.3Hz,1H),5.17(t,J＝9.3Hz,1H),5.09(t,J＝9.6Hz,1H),5.04(t,J＝8.7Hz,1H),4.85(q,J＝8.8Hz,3H),4.79(t,J＝10.0Hz,4H),4.66(d,J＝7.9Hz,1H),4.58(d,J＝8.0Hz,1H),4.50(t,J＝9.9Hz,1H),4.30(dd,J＝12.6,4.5Hz,1H),4.25(t,J＝9.5Hz,1H),4.17(dd,J＝12.3,5.0Hz,1H),4.06(dt,J＝24.3,9.8Hz,2H),3.96(t,J＝11.1Hz,3H),3.89(d,J＝11.7Hz,1H),3.79(s,4H),3.75-3.65(m,17H),3.61(d,J＝8.7Hz,9H),3.43(qt,J＝13.0,5.7Hz,3H),2.99(q,J＝8.7Hz,1H),2.17-1.91(m,50H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:170.7,170.2,169.8,169.5,169.4,167.9,167.1,100.8,100.3,100.2,98.5,78.3,76.7,75.9,74.6,72.4,72.3,71.8,71.7,71.6,70.9,70.6,70.4,69.9,69.5,68.9,68.7,68.2,62.5,62.1,58.2,57.0,53.1,52.8,50.6,23.6,20.9,20.8,20.7,20.6,20.5。
将化合物19(400mg,0.3mmol)溶于4.8mL THF/H2O(3:1)中，冰浴条件下加入新鲜配制的0.75mL过氧化氢溶液(30wt％水溶液)及1.5mL LiOH(1M)，0℃条件下反应1h后继续室温反应15h。将反应体系降至0℃，加入1.5mL甲醇及3.75mL NaOH溶液(4M)，室温下反应10h，TLC监测反应结束后加入酸性阳离子树脂调节pH＝3，滤除树脂，蒸干溶剂，使用Bio-Gel P-2凝胶纯化得到化合物20(235mg,83％)。化合物20：1H NMR(600MHz,D2O)δ:4.50(dd,J＝8.5,6.2Hz,2H),3.93(ddd,J＝11.8,5.7,3.0Hz,1H),3.86(dd,J＝5.1,2.2Hz,1H),3.84(dd,J＝5.1,2.1Hz,1H),3.78(ddd,J＝10.3,8.5,2.9Hz,2H),3.73-3.59(m,17H),3.54-3.37(m,9H),3.32-3.23(m,2H),1.96(s,3H),1.95(s,3H).13C NMR(150MHz,D2O)δ:175.5,174.9,174.6,174.2,103.1,103.0,100.8,100.6,83.0,82.3,80.0,76.4,75.7,75.4,75.3,73.6,72.7,72.4,71.7,69.7,69.6,69.5,69.2,69.0,68.6,68.5,60.7,60.5,54.5,54.2,50.1,22.5,22.2。
实施例5：化合物22的合成
HA寡糖的模块化组装策略以化合物20作为起始底物，通过逐步添加糖核苷酸和GlcUA-transferase(GA-T)与GlcNAc-transferase(GN-T)，制备HA8寡糖(参考，例如，WeiJ,Deangelis P L.Dissection of the two transferase activities of thePasteurella multocida hyaluronan synthase:two active sites exist in onepolypeptide.[J].Glycobiology,2000(9):883-889.)。反应体系如表1所示：
表1HA寡糖合成体系
表2所用生物酶
反应均在30℃下反应12h，利用TLC(EA:MeOH:H2O:HAC,5:2:3:1)及ESI-MS监测反应进行情况。反应结束后100℃煮沸10min。12,000rpm离心10min除去蛋白。采用Bio-rad P6凝胶分离纯化获得目标产物。
通过酶法两步循环反应在化合物20的非还原端延伸两个GlcNAc-GlcA二糖重复单元，得到化合物22。化合物22：1H NMR(600MHz,D2O)δ:4.62-4.57(m,4H),4.51-4.48(m,4H),4.05-4.01(m,1H),3.96-3.92(m,4H),3.89-3.84(m,4H),3.83-3.70(m,24H),3.63-3.49(m,15H),3.41-3.33(m,4H),2.06-2.04(m,12H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ:175.5,175.0,174.7,174.2,174.2,103.2,103.1,103.0,100.9,100.6,100.5,83.0,82.5,82.5,82.3,80.0,79.94,79.9,76.4,76.3,75.7,75.4,75.4,75.4,75.3,73.6,73.6,72.7,72.5,72.5,71.7,69.7,69.6,69.5,69.2,69.1,68.6,68.5,68.4,60.7,60.6,60.5,59.4,54.5,54.3,54.3,50.1,22.5,22.3。
实施例6：HA4-PSC(HSC)前药的合成
室温下，将化合物20(如实施例4制备)(10mg,0.011mmol,1.0eq.)与化合物5(如实施例1制备)(38mg,0.054mmol,5.0eq.)溶于水(0.5mL)和二氯甲烷(0.5mL)中，氩气保护，加入(CH3CN)4CuBF4(0.9mg,0.25eq.)后于37℃下搅拌18h，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶纯化，得到了偶联产物化合物23(15.1mg,85％)。化合物23:1H NMR(600MHz,D2O)δ:8.04(s,1H,＝CH–),7.58(m,1H,Ph),7.43(m,1H,Ph),7.33(m,1H,Ph),7.10(m,1H,Ph),7.05(m,1H,＝CH–),6.90(m,1H),5.40(d,J＝14.9Hz,1H,–OCH2–),5.32(d,J＝14.9Hz,1H,–OCH2–),4.65(m,2H),4.6-4.54(m,4H),4.50-4.47(m,2H),4.28-4.27(m,2H),3.96-3.04(m,50H),2.89-2.86(m,2H),2.23-2.19(m,1H),2.13-2.11(m,1H),2.05(s,3H,–COCH3),2.00(s,3H,–COCH3),1.07(t,J＝6.8Hz,3H,–CH3)；13C NMR(150MHz,D2O)δ:175.47,174.93,174.50,174.12,173.74,172.04,169.58,156.44,149.94,147.43,146.43,144.55,143.91,131.20,130.98,127.61,127.31,127.06,126.61,125.32,118.11,103.14,103.00,100.83,100.58,83.10,82.44,80.02,76.87,76.37,75.72,75.39,75.30,73.60,72.71,72.45,71.70,69.74,69.66,69.60,69.56,68.98,68.74,68.60,68.53,68.44,64.14,63.11,60.71,60.53,54.43,54.22,49.96,33.81,32.68,32.56,32.03,30.43,22.50,22.23,7.30。
实施例7：HA4-PCC(HCC)前药的合成
室温下，将化合物20(如实施例4制备)(10mg,0.011mmol,1.0eq.)与化合物7(如实施例2制备)(36mg,0.054mmol,5.0eq.)溶于水(0.5mL)和二氯甲烷(0.5mL)中，氩气保护，加入(CH3CN)4CuBF4(0.9mg,0.25eq.)后于37℃下搅拌18h，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶纯化，得到了偶联产物化合物24(15.7mg,91％)。化合物24:1H NMR(600MHz,D2O)δ:7.92(s,1H),7.90(s,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.53-7.49(m,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,1H),7.06(s,1H),5.53(d,J＝16.3Hz,1H),5.42(d,J＝16.3Hz,1H),4.50-4.38(m,9H),4.28(d,J＝18.5Hz,1H),4.00-3.93(m,2H),3.86-3.23(m,40H),2.66-2.61(m,1H),2.59-2.54(m,1H),2.24-2.08(m,4H),1.96(s,3H,–COCH3),1.90(s,3H,–COCH3),1.63-1.58(m,2H),1.37-1.32(m,2H),1.26-1.18(m,4H),0.99(t,J＝7.3Hz,3H,CH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:176.10,175.48,174.93,174.81,174.49,174.13,170.24,157.35,150.40,147.36,146.73,145.18,143.82,131.99,130.95,128.07,128.01,127.83,127.47,125.27,118.62,103.13,102.99,100.81,100.59,97.37,83.09,82.38,80.03,76.41,76.37,75.70,75.39,75.30,73.60,72.71,72.43,71.70,69.63,69.54,69.51,68.96,68.91,68.70,68.59,68.53,68.34,66.73,63.61,63.04,60.70,60.53,54.42,54.22,49.91,33.49,33.20,30.67,27.96,27.92,24.10,24.00,22.49,22.21,7.09。
实施例8：2HA4-P2SC(2HSC)前药的合成
室温下，将化合物20(如实施例4制备)(10mg,0.011mmol,1.0eq.)与化合物12(如实施例3制备)(3.2mg,0.003mmol,0.3eq.)溶于水(0.5mL)和二氯甲烷(0.5mL)中，氩气保护，加入(CH3CN)4CuBF4(0.9mg,0.25eq.)后于37℃下搅拌24h，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并浓缩后以Bio-Gel P-2凝胶纯化，得到了偶联产物化合物25(15.1mg,73％)。化合物25:1H NMR(600MHz,D2O)δ:8.10(s,1H),8.03(s,2H),7.89(d,J＝8.4Hz,1H),7.69(m,2H),7.49(m,1H),7.29(s,1H),5.63(d,J＝16.4Hz,1H),5.51(d,J＝16.4Hz,1H),4.63-4.54(m,13H),4.49-4.47(m,4H),4.42-4.39(m,1H),3.96-3.06(m,96H),2.97(t,J＝6.7Hz,2H),2.78(t,J＝6.6Hz,2H),2.33-2.22(m,2H),2.05(s,6H,–COCH3),2.00(s,6H,–COCH3),1.10(t,J＝7.3Hz,3H,CH3)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ:181.4,175.5,174.9,174.5,174.1,173.6,172.4,170.0,157.3,150.6,147.2,147.0,145.3,143.9,132.1,131.1,128.1,127.9,127.6,125.4,118.5,103.1,103.0,100.8,100.6,97.8,83.1,82.4,80.0,77.0,76.4,75.7,75.4,75.3,73.6,72.7,72.5,71.7,70.4,69.7,69.6,69.6,69.5,69.5,69.2,69.0,68.9,68.7,68.6,68.5,63.5,63.1,60.7,60.5,60.5,57.4,54.4,54.2,50.0,48.9,44.2,33.6,33.0,32.5,32.2,30.6,23.2,22.5,22.2,16.8,7.2。
实施例9：HA8-PSC前药的合成
室温下，将化合物22(如实施例5制备)(5mg,1.0eq.)与化合物5(如实施例1制备)(11mg,5.0eq.)溶于表3所示的溶剂中，氩气保护，加入表3所示的一价铜试剂(0.25eq.)后于37℃下搅拌36h，真空减压下除去溶剂后，加入EDTA水溶液和二氯甲烷萃取，收集水相并以C18凝胶分离纯化，得到了偶联产物化合物26。化合物26：1H NMR(600MHz,D2O)δ:8.07(s,1H,＝CH–),7.55(m,1H,Ph),7.42(m,1H,Ph),7.31(m,1H,Ph),7.09(m,1H,Ph),7.04(m,1H,＝CH–),6.88(m,1H),5.38(d,J＝15.3Hz,1H,–OCH2–),5.30(d,J＝15.3Hz,1H,–OCH2–),4.68-4.57(m,6H),4.55-4.47(m,6H),4.28-4.27(m,2H),4.13-3.38(m,70H),2.89-2.86(m,2H),2.25-2.20(m,1H),2.13-2.11(m,1H),2.06-2.03(m,12H),1.09(t,J＝7.1Hz,3H,–CH3)。反应结果如表3所示。
表3点击化学反应结果
a：PMDETA:N,N,N',N,'N”-五甲基二亚乙基三胺
实施例10：细胞毒性实验
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞A549并将其制成单细胞悬液后，按照每孔3000个细胞的数量将其接种到96孔板中培养24h。待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的一系列不同浓度的CPT、HA4-PSC(HSC)(实施例6制备)、HA4-PCC(HCC)(实施例7制备)和2HA4-P2SC(2HSC)(实施例8制备)溶液200μL，使药物(以CPT计)的最终浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10μg/mL，未加药物的培养基作为空白对照。每个样品的每个浓度设立6个复孔，于孵箱中分别培养72h。达到孵育时间后，每个孔吸取上清并加100μL的PBS溶液洗两次，然后向每个孔中加入100μL的培养基和10μL的CCK8溶液，继续于培养箱中孵育30min，在酶标仪的450nm波长处测定每个孔吸光度，并计算每个孔的细胞存活率。
不同药物的细胞毒性结果如图1所示，随着CPT浓度的增加，CPT、HCC、HSC以及2HSC溶液都对非小细胞肺癌细胞A549的毒性显著增加，其中HSC相较HCC和2HSC毒性更强，表明HSC对非小细胞肺癌细胞A549具有更加显著的杀伤能力。
实施例11：超高分辨率激光共聚焦显微镜成像实验
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞A549并将其制成单细胞悬液后，按照每皿105个细胞的数量将其接种到培养皿中培养12h。待细胞贴壁后，吸取上清并加入1mL用培养基稀释的CPT、HSC、HCC和2HSC溶液，每个培养皿药物的最终浓度(以CPT计)均为10μg/mL。每个药品设立三个重复，于孵箱中分别培养4h。达到孵育时间后，每皿吸取上清并加入1mL的PBS溶液洗三次，然后向每个培养皿中加入1mL 4％的多聚甲醛并置于4℃下15min固定细胞。待细胞固定化后每个培养皿加入1mL的PBS溶液洗三次。然后在每个培养皿中加入1mL 20μM的碘化丙啶(PI)溶液，室温下静置30min，吸出碘化丙啶(PI)溶液并以PBS溶液洗三次。最后在每个培养皿中分别加入500μL的PBS溶液。
在超高分辨率激光共聚焦显微镜(LSM900)下观察每个培养皿，不同药物的共聚焦显微镜成像和荧光强度结果分别如图2和图3所示，CPT、HCC、2HSC以及HSC的荧光强度依次增加，表明HSC具有靶向非小细胞肺癌细胞A549的能力且相较CPT、HCC、2HSC靶向性更为显著。
实施例12：竞争抑制实验
用胰蛋白酶消化处于对数生长期的非小细胞肺癌细胞A549并将其制成单细胞悬液后，按照每孔3000个细胞的数量将其接种到96孔板中培养过夜。分别配制透明质酸(HA，11万Da)含量为0、20、100μg/mL的三种培养基。待细胞贴壁后，加入分别用三种培养基稀释的一系列不同浓度的HSC溶液200μL，使HSC的最终浓度为0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL，未加药物和透明质酸的培养基作为空白对照。每个样品的每个浓度设立6个复孔，于孵箱中分别培养72h。达到孵育时间后，每个孔吸取上清并加100μL的PBS溶液洗两次，然后向每个孔中加入100μL的培养基和10μL的CCK8溶液，继续培养30min，在酶标仪的450nm波长处测定每个孔吸光度，并计算每个孔的细胞存活率。
不同透明质酸含量和药物浓度的细胞毒性结果如图4所示，随着HA浓度的增加，HSC对非小细胞肺癌细胞A549的毒性显著降低，表明HA具有抑制HSC细胞毒性的作用，HSC具有潜在的靶向非小细胞肺癌细胞A549的能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。
Claims (10)
1.一种透明质酸-喜树碱前药的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸-喜树碱前药制备包括如下反应路线：
其中：
R选自：单键、季戊四醇残基、甘油残基或聚甘油残基；
X选自：单键、-S-S-、-S-、-S-S-S-、-Se-、-Se-Se-、-NHN＝CH-、-OCO-或-COO-，优选地，X为-S-S-；
CPT为喜树碱类衍生物；
CPT'为喜树碱类衍生物的残基；
a为2或3，优选地，a为2；
b为1-10的整数，优选地，b为3；
c为1-6的整数，优选地，c为1；
d为1-10的整数，优选地，d为3；
e为1-6的整数，优选地，e为1或2；
f为0或1；
g为1-6的整数，优选地，g为2；
h为0或1，优选地，h为1；
i为1-6的整数，优选地，i为2；
所述的步骤(A1)包括：将CPT、二元羧酸Ⅰ、催化剂A1和脱水剂A1在溶剂A1中进行反应，得到喜树碱中间体Ⅱ；
所述的步骤(A2)包括：将所述的喜树碱中间体Ⅱ与炔基-PEG衍生物Ⅲ、催化剂A2和脱水剂A2在溶剂A2中进行反应，得到炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ；
所述的步骤(A3)包括：将所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ与透明质酸中间体Ⅴ和铜催化剂在溶剂A3中混合，在惰性气体保护下反应，得到透明质酸-喜树碱前药Ⅵ。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的CPT选自如下结构：
优选地，所述的CPT为
所述的CPT'选自如下结构：
优选地，所述CPT'为
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R为单键、
优选地，所述的炔基-PEG衍生物Ⅲ具有如下结构：
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的二元羧酸I选自：3,3’-二硫代二丙酸、4,4’-二硫代二丁酸、辛二酸、己二酸；
优选地，所述的喜树碱中间体Ⅱ具有如下结构：
更优选地，所述的炔基-PEG-喜树碱中间体Ⅳ具有如下结构：
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(A1)中，
所述的催化剂A1选自：DMAP、N,N二甲基苯胺、1-羟基苯并三氮唑、4-吡咯烷基吡啶、哌啶或三乙胺，优选地，所述的催化剂A1为DMAP；
所述的脱水剂A1选自：EDCI、DIC、DCC或NHS，优选地，所述的脱水剂A1为EDCI；
所述的溶剂A1选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A1为二氯甲烷/四氢呋喃；
所述的步骤(A1)的反应温度为20-30℃。
6.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(A2)中，
所述的催化剂A2选自：DMAP、N,N二甲基苯胺、1-羟基苯并三氮唑、4-吡咯烷基吡啶、哌啶或三乙胺，优选地，所述的催化剂A2为DMAP；
所述的脱水剂A2选自：EDCI、DIC、DCC或NHS，优选地，所述的脱水剂A2为EDCI；
所述的溶剂A2选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A2为DMF；
所述的步骤(A2)的反应温度为20-30℃。
7.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(A3)中，
所述的铜催化剂选自：四氟硼酸四乙腈铜、硫酸铜、溴化铜或碘化铜，优选地，所述的铜催化剂为四氟硼酸四乙腈铜；
所述的溶剂A3选自：二氯甲烷、四氢呋喃、DMF、水、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、DMSO、氯仿、甲酰胺、乙腈、甲苯中的一种或多种的混合物，优选地，所述的溶剂A3为水/二氯甲烷；
所述的步骤(A3)的反应温度为30-45℃；
优选地，所述的透明质酸中间体Ⅴ的制备包括如下反应路线：
其中：
R1为C1-6烷基(如甲基)；
R2为羟基保护基团(如乙酰基)；
更优选地，所述的步骤(B1)包括：化合物V1分别与醇、羟基保护剂反应，得到化合物V2；
更优选地，所述的步骤(B2)包括：化合物V2与DMAPA混合，在惰性气体保护下反应，得到化合物V3；
更优选地，所述的步骤(B3)包括：化合物V3与三氯乙腈、碱混合，在惰性气体保护下反应，得到化合物V4；
更优选地，所述的步骤(B4)包括：(在溶剂B3中)将化合物V4和化合物
混合，在酸存在下，在惰性气体保护下反应，得到化合物V6；
更优选地，所述的步骤(B6)包括：将化合物V1作为起始底物，通过添加糖核苷酸和GlcA-transferase(GA-T)与GlcNAc-transferase(GN-T)，制备得到所需的V。
8.一种透明质酸-喜树碱前药，所述的透明质酸-喜树碱前药具有通式(Ⅵ)的结构：
其中：
R选自：单键、季戊四醇残基、甘油残基或聚甘油残基；
X选自：单键、-S-S-、-S-、-S-S-S-、-Se-、-Se-Se-、-NHN＝CH-、-OCO-或-COO-，优选地，X为-S-S-；
CPT'为喜树碱类衍生物的残基；
a为2或3，优选地，a为2；
b为1-10的整数，优选地，b为3；
c为1-6的整数，优选地，c为1；
d为1-10的整数，优选地，d为3；
e为1-6的整数，优选地，e为1或2；
f为0或1；
g为1-6的整数，优选地，g为2；
h为0或1，优选地，h为1；
i为1-6的整数，优选地，i为2；
优选地，所述的CPT'选自如下结构：
更优选地，所述CPT'为
9.根据权利要求8所述的透明质酸-喜树碱前药，其特征在于，所述的透明质酸-喜树碱前药Ⅵ具有如下结构：
10.一种如权利要求8或9所述的透明质酸-喜树碱前药在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述的肿瘤为恶性肿瘤，其包括但不限于：淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、滑膜细胞肉瘤、神经内分泌肿瘤、类癌肿瘤、胃泌素瘤、胰岛细胞癌、间皮瘤、神经鞘瘤、听神经瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌(如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)、腺癌肺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、肠癌、胰腺癌、胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、梅克尔细胞癌、食管癌、胆道肿瘤、头颈部癌。
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