CN116077493A - 一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途及其软膏与制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途及其软膏与制备方法，属于生物医学技术领域。本发明确定了Fatostatin及制备的药物在治疗特应性皮炎方面具有的有效的治疗作用；由于SREBP1是促进特应性皮炎发病的关键分子，药物中活性成分Fatostatin能够抑制SREBP1的活化过程及SREBP1调控的脂代谢基因的表达，因此能够治疗特应性皮炎。同时本发明制备含有Fatostatin的软膏用于治疗特应性皮炎，该软膏药效稳定、保质期长、常温下不易失效，为今后特应性皮炎治疗药物的研发奠定基础。

Description

一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途及其软膏与制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途及其软膏与制备方法。

背景技术

特应性皮炎(AD，atopic dermatitis)是临床常见的一类炎症性皮肤病，具有慢性、易反复、瘙痒等特点，常伴随着食物过敏、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等其他过敏性疾病。特应性皮炎影响全球约15％-25％的儿童及2.0％-17.6％的成年人。近年来，我国特应性皮炎发病率逐年升高，现代饮食方式大大增加了肥胖的患病率的同时，也显著促进了特应性皮炎的发生、发展。流行病学数据表明，肥胖的患者特应性皮炎的发病率更高、炎症更重、传统的治疗方法效果欠佳。由于我国人口基数大，肥胖和特应性皮炎的绝对人口多，给患者家庭及社会带来极大程度的经济负担，因此需要寻找能够预防和治疗特应性皮炎尤其对肥胖人群有效的药物和方法。

特应性皮炎发病机制主要是遗传易感、免疫异常、皮肤屏障功能障碍、皮肤菌群紊乱等，轻度特应性皮炎可通过外用药物改善，但中重度特应性皮炎通常需要联合系统药物治疗，包括系统糖皮质激素及免疫抑制剂(如环孢素、甲氨蝶呤、雷公藤多苷等)，使用糖皮质激素会存在一些不良反应，如皮肤的萎缩性改变，具体表现为皮肤萎缩、皮肤脆性增加、紫癜、星状假瘢痕、毛细血管扩张和溃疡，使用糖皮质激素不良反应较多而限制药物使用，影响患者病情控制。如果特应性皮炎患者和儿童(尤其2岁以下)大面积或采用封包疗法使用强效或超强效激素容易发生系统吸收，会导致系统性副作用的发生，包括内分泌副作用：柯兴氏综合征、抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴；代谢性副作用：股骨头无菌性坏死、抑制生长和高血糖；肾功或电解质异常：高血压、低血钙和外周性水肿，以及白内障和青光眼等。儿童的体表面积/体重的比值比成人大，因此儿童发生系统性吸收的风险较大，儿童的副作用还包括线性生长速率降低。

特应性皮炎重度患者目前所推荐的系统治疗，包括针对IL-4、IL-13单抗以及针对JAK-STAT的小分子药物，在特应性皮炎的不同发展阶段，主导的细胞因子并不相同，例如急性期以Th2型细胞因子升高为主，慢性期以Th17型细胞因子升高为主，而老年患者以中性粒细胞升高为主。在临床应用中，不能区分免疫类型的情况下，贸然选择靶向一种细胞因子的生物制剂有诱发免疫异常的风险。另外，目前研究证明针对IL-4、IL-13的单抗对肥胖患者治疗无效。JAK-STAT途径是多种细胞因子和生长因子的主要信号通路，表达广泛，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡。这些细胞事件对于造血、免疫发育、乳腺发育和泌乳、脂肪形成、两性生长等均具有重要作用，理论上，抑制JAK会引起多种潜在风险。

因此，迫切需要探索更有效、更安全的药物以用于治疗特应性皮炎，以解决治疗特应性皮炎时风险高、效果不理想的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目是提供一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途及其软膏与制备方法，制备的药物用于治疗特应性皮炎，该软膏药效稳定、保质期长、常温下不易失效，为今后特应性皮炎治疗药物的研发奠定基础。

一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途。

Fatostatin是一种小分子的非固醇类二芳基噻唑衍生物，其化学名是4-[4-(4-甲基苯基)-2-噻唑基]-2-丙烷基-吡啶，氢溴酸盐，最初是由一个化学实验室合成，用来阻止胰岛素诱导的脂肪生成的化学抑制剂。它能在一个不同于固醇结合位点的区域与SCAP直接结合，阻断SCAP从内质网的输出和SREBPs从内质网到高尔基体的转运，从而抑制SREBP的活化过程及其调控的脂代谢基因，是SREBP通路的一种化学抑制剂。申请者研究团队发现特应性皮炎及肥胖患者皮肤均高表达SREBP1，且SREBP1的活化增多。Fatostatin通过抑制SREBP1的活化发挥抑制特应性皮炎的作用，表明SREBP1是促进特应性皮炎发病的关键分子，因此Fatostatin是治疗特应性皮炎的潜在药物。

进一步，所述用途包括治疗肥胖特应性皮炎患者中的用途。

进一步，所述药物包含Fatostatin药学上可以接受的载体和/或赋型剂，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或外用剂型，外用剂型，如乳膏或擦剂等。

一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的软膏，所述软膏包括活性成分Fatostatin。

进一步，所述软膏中还包括软膏辅料。

进一步，所述软膏包括以下原料：

0.004-0.01重量份Fatostatin、0.5-3重量份胆固醇、4-7重量份DOTAP、2-6重量份海藻糖、12-14重量份硬脂酸甘油酯、5-10重量份吐温80、20-32重量份凡士林、10-20重量份透明质酸钠、6-12重量份丙二醇、0.1-0.5重量份的0.1mol/L柠檬酸钠溶液。

一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的软膏的制备方法，具体制备步骤如下：

(1)将胆固醇、DOTAP、Fatostatin混合溶解形成混合溶液A，20-25℃旋转蒸发形成均匀薄膜；将海藻糖与0.1mol/L柠檬酸钠溶液混合形成混合溶液B，加入薄膜、吐温80混合，水浴超声并旋转蒸发至胶态，形成脂质体混悬液；

(2)将硬脂酸甘油酯、凡士林混合，不断搅拌下加热至90-98℃，制得油相；将透明质酸钠和丙二醇溶于58-62℃水中，制得水相，将油相逐步加入水相中，水浴温度保持在58-62℃，在磁力搅拌下充分混合，待其冷却至37-43℃时加入脂质体混悬液，混合均匀后继续冷却至室温即制得软膏。

Fatostatin作为软膏的活性成分，使制备的药膏通过涂抹外用的方式用于治疗特应性皮炎，但是Fatostatin一般在-20℃下保存，有效期为2年，如果溶入溶剂后-20℃保质期为一个月。因此在制备软膏的过程中，要延长Fatostatin的保存期限。先用胆固醇、DOTAP、Fatostatin、海藻糖、柠檬酸钠、吐温80制成脂质体混悬液，脂质体对皮肤具有强大的亲和力和相容性，它的脂双层可以和细胞膜融合，从而将Fatostatin递送到体内，其中的胆固醇可调节双层膜的流动性，使膜通透性降低，减少药物渗漏，同时可使脂膜维持一定柔韧性，增强脂质体囊泡抗击外部条件变化的能力，脂质体混悬液中的海藻糖和柠檬酸钠可形成一种稳定的非吸湿性保护层，性质稳定，能够减小温度对Fatostatin的影响，同时也能防止外界氧气进入和软膏发生氧化作用。

将硬脂酸甘油酯、凡士林混合制得油相；将透明质酸钠和丙二醇溶于水中制得水相，将油相逐步加入水相中，再加入脂质体混悬液，制得的软膏的结构为内层的活性物质提供了更为封闭的内环境，有效降低了外部环境因素如氧气、温度、光等对包埋物的影响，能有效控制释放和稳定脂溶性活性成分，从而减轻了外界环境对Fatostatin的影响，软膏的保质期延长，不易失效。

进一步，所述步骤(1)中旋转蒸发至胶态时的温度为30-40℃。

有益效果：

(1)本发明确定了Fatostatin在治疗特应性皮炎方面的治疗作用。

(2)本发明还提供了利用Fatostatin制备的治疗特应性皮炎的软膏，该软膏安全性好，在治疗时不会引起刺激症状，克服了糖皮质激素及免疫抑制剂由于不良反应较多、引起系统吸收而限制其在特应性皮炎中的应用的难题。

(3)Fatostatin在一个不同于固醇结合位点的区域与SCAP直接结合，阻断SCAP从内质网的输出和SREBPs从内质网到高尔基体的转运，抑制SREBP1的活化，为特应性皮炎的治疗提供了安全、有效的药物。

(4)制备的Fatostatin软膏药效稳定、保质期长、常温下不易失效。

附图说明

图1为特应性皮炎患者皮损处高表达SREBP1及其下游分子的表达情况；

图2为Fatostatin抑制特应性皮炎及肥胖相关的特应性皮炎加重；

图3为Fatostatin通过抑制角质形成细胞SREBP1的成熟进而抑制TSLP的表达。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明进行详细说明：

实施例1：特应性皮炎患者皮损处高表达SREBP1及其下游分子的表达

从NCBI下载特应性皮炎患者皮损的RNAseq测序数据(GSE121212)，利用R语言进行分析。该数据包括6个特应性皮炎患者，其中包括6个特应性皮炎患者皮损样本，6个特应性皮炎患者的非皮损处皮损样本。图1展示了SREBP1及其下游分子SCD1、ACC、ACLY、FAS、ELOVL6的表达情况；

图1结果显示，在特应性皮炎患者皮损处以及非皮损处SREBP1以及其下游分子SCD1、ACC、ACLY、FAS、ELOVL6表达升高。

实施例2：Fatostatin对特应性皮炎以及由肥胖诱导、加重的特应性皮炎的抑制作用实验

1、实验分组：

选用16只6-8周的SPF级雄性C57BL/6小鼠，随机分成两组：肥胖组(Obese)、对照组(Lean)，其中Obese组小鼠给予60％kcal的高脂饲料饲养，Lean组小鼠给予饲养10％kcal的普通饲料饲养，连续饲养16周备用，16周后Obese组小鼠平均体重增长至40g左右，Lean组小鼠平均体重增长至30g左右，如图2-(A)所示；再将Lean组小鼠随机分成两组小鼠，为Lean的MC903组和MC903+Fatostatin组，将Obese组小鼠随机分成两组小鼠，为Obese的MC903组和MC903+Fatostatin组。

2、实验方法：

在Lean的MC903+Fatostatin组小鼠和Obese的MC903+Fatostatin组小鼠耳部皮肤分别涂抹30μL，浓度为100μM溶于玉米油的Fatostatin(Medchem express，Cat:#HY-N1362/CS-5614)，30分钟后再于耳部皮肤连续涂抹2nmol的卡泊三醇(Leo，Calcipotriol，MC903)；在Lean的MC903组小鼠和Obese的MC903组小鼠耳部皮肤分别涂抹30μL的玉米油，30分钟后再于耳部皮肤连续涂抹2nmol的MC903。

于第10天时给小鼠拍照，并取小鼠1mm×1cm大小耳部组织于福尔马林中浸泡后用于HE染色，结果如图2-(B)；统计30min内小鼠的搔抓次数，统计结果如图2-(C)所示；并测量各组小鼠的耳厚，得到的结果如图2-(D)；收集小鼠的外周血清用于检测TSLP以及IgE的水平，结果如图2-(E)所示；取小鼠1/4耳部组织用于RT-PCR，检测皮损中炎症分子的表达情况，结果如图2-(F)所示。

3、实验结果：

由图2结果表明：

(1)由图2-(B)所示，外用MC903后Lean组小鼠临床表现为小鼠耳部红肿伴有鳞屑，组织HE染色提示有炎细胞浸润，Obese组小鼠炎症表现更重，而外用Fatostatin后无论是Obese组小鼠或Lean组小鼠的MC903炎症表现均减轻。

(2)从图2-(C)中可以看出，外用MC903后计算小鼠搔抓次数，可见Lean组小鼠搔抓次数增加，Obese组小鼠组搔抓次数更多，而外用Fatostatin后搔抓减轻。

(3)测厚仪测量小鼠耳部厚度，统计数据得到图2-(D)，发现Obese组外用MC903耳厚较Lean组小鼠耳厚增厚，而外用Fatostatin后所有外用MC903组小鼠耳部厚度都明显减轻，镜下测量表皮厚度得到一致趋势。

(4)图2-(E)为Elisa检测小鼠外周血TSLP和IgE的表达，可以看到Obese组小鼠血清中TSLP水平升高，IgE无差别。外用MC903后，与Lean组小鼠相比，Obese组小鼠的TSLP及IgE均显著升高，其中Obese的MC903组最高。

(5)图2-(F)中为RT-PCR检测小鼠组织中炎症分子的表达。从结果看出与Lean组小鼠相比，Obese组小鼠耳部组织中的TSLP、IL-4、IL-5、IL-13的表达均显著升高。

实施例3：Fatostatin对HaCaT细胞的作用实验

1、实验方法

体外培养HaCaT细胞：将HaCaT细胞在超净工作台内复苏，培养于含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、体积分数5％的CO₂、97％湿度的细胞培养箱中培养，取生长对数期的HaCaT细胞以150000个细胞/孔的密度接种于细胞六孔板上培养；

血清饥饿处理：在细胞长至80％-90％密度时，吸尽培养基，37℃磷酸盐缓冲液冲洗1次。HaCaT细胞于不含血清的DMEM培养基中培养8h；

2、实验分组：将培养的HaCaT细胞分成两组，一组为Solvent组，另一组为Fatostatin组，Solvent组的HaCaT细胞添加Fatostatin的溶剂对照，Fatostatin组添加终浓度为1μM的Fatostatin；

再将Solvent组分成两组，一组不添加600μM的PA，为Control组；另一组添加600μM的PA(棕榈酸)刺激以模拟高脂环境，为PA组；

同样地，将Fatostatin组分成两组，一组不添加600μM的PA，为Control组，另一组添加600μM的PA刺激以模拟高脂环境，为PA组；

于无血清环境中培养48h后收集细胞，提取蛋白，利用western blotting检测细胞的TSLP和SREBP1成熟体的表达水平，得到的结果如图3所示。

3、实验结果

由图3说明，HaCaT细胞添加PA，Fatostatin组的PA组在添加PA前还给予外用Fatostatin(1μM)。当细胞处于高脂环境(PA刺激)中时，PA可以促进TSLP的产生，添加Fatostatin治疗组TSLP的表达显著下降，说明Fatostatin对TSLP有抑制作用。

实施例4：含Fatostatin的外用软膏的制备

本实施例以Fatostatin为活性成分，制备一种治疗特应性皮炎的外用软膏，软膏的具体制备步骤如下：

(1)将1.2g胆固醇、5g DOTAP(2，3-二油酰基-丙基)、0.007g Fatostatin混合溶解形成混合溶液A，20℃下旋转蒸发形成均匀薄膜；将4g海藻糖与0.3g的0.1mol/L柠檬酸钠溶液混合形成混合溶液B，加入薄膜、7g吐温80混合，水浴超声，在35℃下旋转蒸发至胶态，形成脂质体混悬液；

(2)将13g硬脂酸甘油酯、26g凡士林混合，不断搅拌下加热至95℃，制得油相；将15g透明质酸钠和9g丙二醇溶于60℃水中，制得水相，将油相逐步加入水相中，水浴温度保持在60℃，在磁力搅拌下充分混合，待其冷却至40℃时加入脂质体混悬液，混合均匀后继续冷却至室温即制得软膏。

对比例1：含Fatostatin的外用软膏的制备

本对比例与实施例4相比，其区别在于对比例1的步骤(1)中所用的原料缺少海藻糖、柠檬酸钠溶液，其余步骤和所用原料均相同，步骤(1)的制备过程如下：

(1)将1.2g胆固醇、5g DOTAP、0.007g Fatostatin混合溶解形成混合溶液A，20℃下旋转蒸发形成均匀薄膜；在4.5g水中加入薄膜、7g吐温80混合，水浴超声，在35℃下旋转蒸发至胶态，形成脂质体混悬液。

对比例2：含Fatostatin的外用软膏的制备

本对比例与实施例4相比，其区别在于对比例2的步骤(2)中所用的原料缺少凡士林和丙二醇，其余步骤和所用原料均相同，步骤(2)制备过程如下：

(2)将13g硬脂酸甘油酯不断搅拌下加热至95℃，制得油相；将15g透明质酸钠溶于60℃水中，制得水相，将油相逐步加入水相中，水浴温度保持在60℃，在磁力搅拌下充分混合，待其冷却至40℃时加入脂质体混悬液，混合均匀后继续冷却至室温即制得软膏。

对比例3：含Fatostatin的外用软膏的制备

本对比例与实施例4相比，其区别在于对比例3的步骤(2)中所用的原料缺少硬脂酸甘油酯和透明质酸钠，其余步骤和所用原料均相同，步骤(2)的制备过程如下：

(2)将26g凡士林不断搅拌下加热至95℃，制得油相；将9g丙二醇溶于60℃水中，制得水相，将油相逐步加入水相中，水浴温度保持在60℃，在磁力搅拌下充分混合，待其冷却至40℃时加入脂质体混悬液，混合均匀后继续冷却至室温即制得软膏。

对比例4：含Fatostatin的外用软膏的制备

将30g硬脂酸甘油酯、52g凡士林混合，不断搅拌下加热至95℃熔融成液态，冷却至45℃加入0.007g Fatostatin，制得软膏。

试验1：

(1)实验组1：采用实施例4的方法制备软膏；

(2)对照组1-4：分别采用对比例1-4的方法制备软膏；

(3)实验方法：在2021年6月份进行试验，在常温下检测实验组1和对照组1-4制备的软膏中Fatostatin的含量，然后将软膏分别放置在烧杯中，每组10g，烧杯口用纱布包扎以防止空气中的杂质污染，15d后检测软膏中Fatostatin的含量，结果如表1所示：

表1

	实验组1	对照组1	对照组2	对照组3	对照组4
						初始含量(mg)	10.32	10.07	17.47	15.73	9.54
15d后含量(mg)	10.14	9.53	16.75	15.12	2.65

由表1对比制备的五种软膏，得到的结果如下：

(1)按照实验组1制备的软膏15天后降解量最小，仅降低了0.18mg。对照组1缺少海藻糖、柠檬酸钠溶液，不能形成有效的非吸湿性保护层，无法阻挡外界环境对软膏的影响，制备的软膏于15天后含量降为9.53mg。

(2)对照组2制备的软膏于15天后含量为16.75mg，对照组3制备的乳膏于15天后降解量为0.61mg，总体好于对照组1。其原因是未提供Fatostatin一个封闭的内环境，外部环境中的氧气、温度、光等会对包埋物尤其是Fatostatin造成较大的影响；对照组4制备的乳膏15天后含量降低了大约30％，可见，使用本发明制备的软膏能够受环境影响小，有效控制释放和稳定活性成分，从而减轻了外界环境对Fatostatin的影响，使软膏的保质期长，不易失效，效果好。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims (8)

1.一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途。

2.根据权利要求1所述的一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途，其特征在于，所述用途包括对伴有肥胖的特应性皮炎患者有效的用途。

3.根据权利要求1所述的一种采用Fatostatin作为治疗特应性皮炎的药物的用途，其特征在于，所述药物包含Fatostatin以及药学上可以接受的载体和/或赋型剂，按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型，或非口服给药的注射剂，或外用剂型。

4.一种治疗特应性皮炎的软膏，其特征在于，所述软膏包括活性成分Fatostatin。

5.根据权利要求4所述的一种治疗特应性皮炎的软膏，其特征在于，所述软膏中还包括药学上可接受的软膏辅料。

6.根据权利要求5所述的一种治疗特应性皮炎的软膏，其特征在于，所述软膏包括以下原料：

0.004-0.01重量份Fatostatin、0.5-3重量份胆固醇、4-7重量份DOTAP、2-6重量份海藻糖、12-14重量份硬脂酸甘油酯、5-10重量份吐温80、20-32重量份凡士林、10-20重量份透明质酸钠、6-12重量份丙二醇、0.1-0.5重量份的0.1mol/L柠檬酸钠溶液。

7.一种治疗特应性皮炎的软膏的制备方法，其特征在于，所述软膏的具体制备步骤如下：

(1)将胆固醇、DOTAP、Fatostatin混合溶解形成混合溶液A，20-25℃旋转蒸发形成均匀薄膜；将海藻糖与0.1mol/L柠檬酸钠溶液混合形成混合溶液B，加入薄膜、吐温80混合，水浴超声并旋转蒸发至胶态，形成脂质体混悬液；

(2)将硬脂酸甘油酯、凡士林混合，不断搅拌下加热至90-98℃，制得油相；将透明质酸钠和丙二醇溶于58-62℃水中，制得水相，将油相逐步加入水相中，水浴温度保持在58-62℃，在磁力搅拌下充分混合，待其冷却至37-43℃时加入脂质体混悬液，混合均匀后继续冷却至室温即制得软膏。

8.根据权利要求7所述的一种治疗特应性皮炎的软膏的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中旋转蒸发至胶态时的温度为30-40℃。

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