KR20230089336A - 사독 및 pdrn을 함유하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질염 및 요실금 예방 및 치료에 있어서 사독 및 PDRN을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 1) 사독을 증류수에 혼입한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 불순물을 제거한다. 2) 여과한 사독을 동결건조를 통하여 사독 분말을 제공한다. 3) 상기 사독과 PDRN을 유효성분으로 함유하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 사용되는 유효성분인 사독과 PDRN은 질염의 원인이 되는 진균류와 일반 세균에 우수한 항균 활성이 우수하여 질염 예방 및 치료용으로 사용하기에 적합하다. 또한, 요실금 치료용 조성물은 생체내로 주입될 경우, 특히 질내에 주입될 경우, 효과적으로 요실금을 치료할 수 있으며, 기존의 수술법에 비교하여 수술 후 합병증을 최소화할 수 있으며, 아주 짧은 시간의 통원 치료에 의해 요실금을 치료할 수 있다.

Description

사독 및 PDRN을 함유하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating vaginitis and urinary incontinence containing snake venom and PDRN.}

본 발명은 질염 및 요실금 치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뱀에게서 추출한 사독과 연어에서 추출한 PDRN을 유효성분으로 하는 질염 및 요실금 개선을 위한 예방 및 치료용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

중국 코브라에서 채취한 뱀독(Naja naja atra venom, 이하 ‘NNAV’라 한다.) 및 NNAV에서 분리한 단일성분인 코브로톡신(Cobrotoxin, 이하 ‘CTX’라 한다.)은 항염증반응, 면역반응조절, 진통작용 등을 통해 여러 염증 및 면역관련 질환 개선에 효과가 있다.

폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotide, 이하 'PDRN'이라 한다.)은 조직재생물질로 알려져 있는데 PDRN은 연어 정액으로부터 추출한 DNA로 제조하고 있다.

PDRN은 피부이식으로 인한 상처의 치료 및 조직수복에 사용하고 있지만, 마땅한 치료법이 없는 일부 조직재생이나 염증치료에도 의료진 판단에 따라 사용되고 있으며, 또한 피부재생 신호전달체인 A2 수용체를 자극해 각종 성장인자 분비촉진, VEGF(혈관내피세포증식인자)에 의한 모세혈관의 생성, 혈액순환 개선, 항염증 작용 및 모세혈관 누출 방지 기능을 하는 성분으로 알려져 있다.

한편, 요실금(urinary incontinence)은 모든 여성의 10-40% 정도에 이르며, 전 세계적으로 약 2억 명 이상의 여성이 요실금으로 고통받고 있다. 이 중 복압성 요실금(stress urinary incontinence)은 여성 요실금의 가장 흔한 형태로 모든 요실금의 약 50% 정도를 차지한다. 복압성 요실금은 갑작스러운 복압의 증가에 의하여 방광의 수축 없이 소변이 요도 밖으로 누출되는 질환으로 45세에서 49세 사이의 여성에서 최고조에 다다르며(약 65%), 많은 여성에게 사회적인 또한 위생적인 문제를 야기한다.

이런 복압성 요실금은 발병 기전에 따라 요도의 과운동성(urethral hypermobiliy)의한 해부학적 요실금(anatomic incontinence)과 내인성 요도괄약근 기능 부전(intrinsic sphincter deficiency; ISD)으로 나누어진다. 해부학적 요실금은 복부 또는 질을 통한 방광 경부 현수술(bladder neck suspension)이나 테이프를 이용한 중간요도 슬링 수술법(midurethral sling operation)이 시행되고 있으며, 내인성 요도 괄약근 기능 부전에는 슬링 수술과 자가 지방, 테프론, 콜라겐, 실리콘 등의 요도 점막하 주사치료 또는 인공 요도 괄약근 삽입술 등이 시행되고 있으나, 모든 요실금에 사용될 수 있는 완벽한 치료법은 아직 없는 것이 실정이다.

또한, 질염은 질 분비물, 냄새, 작열감, 소양감, 성교통, 배뇨통 등의 증상을 특징으로 하는 질의 감염 또는 염증상태로 가장 흔한 부인과 질환이다. 가임기 여성에서 발생하는 질염의 90% 이상은 세균성 질염, 칸디다성 질염, 트리코모나스 질염 등이다. 가임기 연령에서 발생하는 질염 중에 가장 흔한 세균성 질염은 40~50%를 차지하고, 그 다음이 칸디다성 질염 20~25%, 트리코모나스 질염 15~20% 순이고 비 감염성 질염 등도 있다. 질 내에는 많은 종류의 정상 세균군이 있고 이중 호기성 세균인 락토바릴러스(lactobacillus)가 가장 많은 비율을 차지하고 있다. 이 세균은 과산화수소를 분비하여 질 내를 산성 상태로 유지해주고 유기체들 사이에 균형을 유지하며 병균에 대한 저항성을 지니게 하는데 저항 세균군의 변화를 초래하는 상황에서는 감염의 기회가 증가하게 된다.

질염의 치료법을 보면 세균성 질염은 메트로니다졸(metronidazole)과 클린다마이신(clindamycin) 등의 약물을 사용하게 되는데 겔을 질 안에 주입하는 방법과 경구로 투여하는 방법이 있다. 임신 중에서도 약물 치료를 하여 야 하지만 메트로니다졸은 태아에 대한 악영향이 가능하기 때문에 임신초기에는 치료를 금해야 하고 임신 중기 이상에서부터 치료하게 된다. 다른 방법으로는 클린다마이신 등을 경구 투여하는 방법이 있다.

칸디다성 질염의 경우 아졸(azole) 계통의 항진균제를 사용하게 되는데, 국소 요법에 사용되는 항진균제로는 부토코나졸(butoconazole), 클로트리마졸(clotrimazole), 미코나졸(miconazole), 나이스타틴(nystatin), 티코나졸(ticonazole), 테르모나졸(terconazole) 등이며, 경구요법에 사용되는 항진균제의 종류로는 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 케토코나졸(ketoconazole) 등이 있다.

트리코모나스 질염의 경우에는 메트로니다졸을 경구로 투여하게 되며, 임신 초기에는 메트로니다졸 치료를 금해야 하고, 임신 중기 이상에서부터 치료가 가능하게 된다. 또한, 재발하여 치료가 실패할 경우 메트로니다졸에 대한 항생제 감수성 검사를 실시하여야 한다.

질염 치료에 사용되는 메트로니다졸(metronidazole)과 클린다마이신(clindamycin) 등의 약물은 항생물질의 부작용과 장기 치료에 따른 내성균에 의한 치료의 어려움이 있으며, 더욱이 임신 초기에는 태아에 대한 악영향이 가능하기 때문에 임신 치료의 어려움 등이 발생하게 된다.

따라서, 본 발명에서는 오랜 기간 동안 한약재로서 사용되어온 뱀독과, 천연 유래의 추출물을 함유하여 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없는 질염 및 요실금의 예방 및 치료용 조성물을 발명하고자 하였다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 사독과 같은 천연물을 사용하여 질염 및 요실금 치료 시 발생할 수 있는 인체에 대한 부작용이 감소시킬 수 있고, 항염 및 피부재생 효과를 지닌 PDRN을 함께 조성하여 치료 효과를 높일 수 있는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 사독 및 PDRN을 유효성분으로 포함하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은

1) 사독을 증류수에 혼입한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 불순물을 제거한다.

2) 여과한 사독을 동결건조를 통하여 사독 분말을 제공한다.

3) 상기 사독과 PDRN을 유효성분으로 함유하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 유효성분인 사독과 PDRN은 질염의 원인이 되는 진균류와 일반 세균에 우수한 항균 활성이 우수하여 질염 예방 및 치료용으로 사용하기에 적합하다. 또한, 요실금 치료용 조성물은 생체내로 주입될 경우, 특히 질내에 주입될 경우, 효과적으로 요실금을 치료할 수 있으며, 기존의 수술법에 비교하여 수술 후 합병증을 최소화할 수 있으며, 아주 짧은 시간의 통원 치료에 의해 요실금을 치료할 수 있다. 여러 제형으로 제조될 수 있는 제형 우수성이 뛰어나 환자의 취향과 편리성에 따른 제품화가 가능하다.

도 1은 PDRN-V를 처리한 자궁근종 세포의 MTT assay 결과 및 자궁근종세포의 칠피 추출물 처리시간 별 IC50값을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 PDRN-V의 처리에 따른 세포 생존률을 확인한 결과이다.

이하 본 발명에서 사용하는 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “질염”은 질 분비물, 냄새, 작열감, 소양감, 성교통, 배뇨통 등의 증상을 특징으로 하는 질의 감염 또는 염증상태로 가장 흔한 부인과 질환을 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 “치료” 및 “개선”은 본 발명품의 조성물 투여로 질염 및 요실금 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 염증성 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 1) 사독을 증류수에 혼입한 후 0.45 μm 필터로 여과하여 불순물을 제거하는 단계. 2) 상기 단계 1)의 사독은 액상이거나 통상의 동결건조 방법으로 건조하여 분말형태일 수 있다.

상기 단계 1)의 여과는 0.45 μm 필터를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 본 발명자들은 사독의 질염 및 요실금의 치료 및 개선효과를 알아보기 위하여 HaCaT 세포에서 세포 독성 시험을 수행하였다.

따라서, 본 발명의 사독은 질염 및 요실금 치료 및 개선효과가 뛰어남을 확인함으로써 상기 사독을 함유하는 질염 및 요실금 치료 및 개선에 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 예를 들어, 주사제, 정제, 연고제, 드레싱제, 밴드(bandage), 거즈(gauze), 마이크로니들 패치(microniddle patch)와 같은 통상의 의약제형을 의미한다.

본 발명의 사독으로부터 분리된 사독 정제물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 사독은 1일 10 마이크로그램 내지 2 밀리그램, 바람직하게는 20 마이크로그램 내지 1 밀리그램, 보다 바람직하게는 30 마이크로그램 내지 1 밀리그램의 투여량으로, 바람직하게는 마이크로니들 패치 사용이 가능하나, 상기 투여량, 투여횟수 및 투여방법은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 사독 및 PDRN은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 직장 또는 정맥, 근육, 피내, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 마이크로니들 패치에 의해 투여될 수 있다.

실시예 1: PDRN-V의 자궁근종 세포의 생존 및 사멸에 미치는 효과 확인(MTT assay)

1-1:　자궁근종 세포의 준비

양성 자궁질환으로 자궁절제술 및 자궁근종 절제술을 시행하는 환자들에게 인체유래물 연구 동의서 및 연구 동의서를 취득한 후, 채취한 자궁근종 조직을 실험에 사용하였다. 본 발명과 관련하여 기관윤리위원회 (IRB) 승인을 받았다.

채취된 조직을 1% Anti-biotics/ anti-mycotic (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 가 함유된 인산완충용액(PBS, phosphate buffered saline pH 7.4)으로 세척하여 남아있는 혈액 등을 제거하였다. 배양 접시 위에서 멸균된 가위를 이용하여 조직을 1-2mm 의 크기로 잘게 자른 후 50mL conical tube 에 옮겼다. 여기에 2mg/mL 의 collagenase type Ⅰ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 과 0.2mg/mL 의 DNase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)가 함유된 Hank's balanced salt solution (HBSS) 를 처리하여 37°C 항온수조에서 3-4시간 동안 교반 배양하였다. 충분히 소화된 조직에 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco BRL)을 첨가하여 효소작용을 정지시키고 70μm 의 나일론 망 (cell strainer, SPL, KOREA)을 통과시켜 걸러낸 후 원심분리하여 상층액을 제거 하였다. 이것을 다시 PBS 로 씻어서 원심분리 하고 상층액을 제거한 후, 모아진 세포를 10% fetal bovine serum 이 첨가된 Dulbecco's modified eagle's medium/Nutrient mixture F-12 배양액 (Pan Biotech, Aidenbach, Germany) 배양액에 부유시킨 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하고 48시간 방치한 다음 2일에 한번 배양액을 교체하며 배양하였다. 배양된 세포는 Smooth muscle action에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 99% 이상의 순수한 근육세포를 확인 후 1~3세대 세포만을 실험에 사용하였다.

1-2: PDRN-V의 자궁근종 세포 항증식 효과 시험(MTT ASSAY)

PDRN-V가 자궁근종(myoma) 세포의 세포생존 및 사멸에 미치는 영향을 보기 위해, 96 well plate에 실시예 2-1의 자궁근종 세포를 1 × 10⁴ cells/well 의 밀도로 분주하고, 배양기에서 24시간 배양하였다.

상기 배양된 자궁근종 세포에 PDRN-V를 각각 20, 50, 100, 200, 400, 500 및 1,000 ug/ml의 농도로 처리한 후에 배양시간 24시간, 48시간, 및 72시간에서 MTT 분석을 시행하였다.

구체적으로, 각 자궁근종 세포에 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 2mg/mL 의 농도로 처리하고 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응 시키고 상층액을 제거한 후, 각 세포에 DMSO 200μl를 첨가하여 용해시킨 후 교반기(shaker)를 이용하여 실온에서 5분간 잘 용해시킨 후 이어서 분광 광도계 마이크로 플레이트 리더 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 실험은 적어도 독립적으로 3번 수행되었다.

대조군은 자궁근종 세포에서 PDRN-V를 처리하지 않은 비처리군 이며, 통상적으로 불멸화된 암세포가 아닌 세포들을 세포 배양할 경우 일정 부분에서 세포 사멸이 동반되는 특징이 있고, 이를 고려하여 대조군을 임의로 100으로 산정하고 각 농도별로 대조군 (control)과 비교해 생존한 세포를 백분율로 나타내었다.

상기 PDRN-V를 처리한 세포의 MTT 분석 결과와 자궁근종세포의 PDRN-V 처리시간(24, 48, 72시간) 별 IC50값을 도 1에 나타냈다. 표 1은 PDRN-V의 농도별 자궁근종세포의 MTT assay 를 6회 반복 실험한 결과를 나타낸 것이며, 단위는 %이다.

그 결과, PDRN-V의 농도가 증가함에 따라 자궁근종 세포의 증식 억제 및 사멸율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 그래프 패드 프리즘 (GraphPad Prism, version 5.01; GraphPad Software, SanDiego, CA) 소프트웨어를 사용하여 분석한 PDRN-V의 자궁근종 세포의 증식 억제농도 (IC50, Inhibitorydose)는, 24, 48, 72시간에서 각각 343.1, 309.1, 261.9 ug/ml 이었다.

그 결과, PDRN-V 처리 시간이 증가할수록 IC50값이 감소하여, PDRN-V에 자궁근종 세포 항증식 효과가 있음을 알 수 있었다.

<실시예 2> 사독 여과 및 동결건조

본 발명자들은 사독을 하기와 같은 공정을 통하여 여과하였다.

구체적으로, 뱀(중국코브라, 살무사, 쇠살무사, 까치살무사)으로부터 채취한 사독 1 ml를 100 ml의 정제수를 이용하여 희석하였다. 희석된 사독을 0.45 μm 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 사독은 동결건조하여 200 mg을 얻었다. 동결 건조된 분말은 사용전까지 -20℃에 보관하였다.

<실험예 3> 본 발명의 사독 및 PDRN의 세포 독성 확인

본 발명의 시료가 피부 각질세포에서 세포독성이 있는지를 확인하고자 CCK-8(Cell Counting Kit-8) 어세이를 실시하였다. 96웰 플레이트(well plate)에서 HaCaT 세포에 시료를 농도별(50, 100 및 200㎍/㎖)로 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 배지에 CCK-8을 10% 농도로 첨가한 다음 2시간 동안 37℃에서 반응시킨 후, 마이크로플레이트 스펙트로미터(Biorad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 대조군과의 비교를 통해 상대적인 세포 생존율(%)을 계산하였다.

그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 사독 및 PDRN을 HaCaT 세포에 200㎍/㎖의 농도까지 처리하여도 세포독성이 거의 나타나지 않았다.

Claims (8)

1. 사독 및 PDRN 배합조성물을 유효성분으로 포함하는 질염 및 요실금 예방 및 치료용 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 사독이 중국 코브라(Naja naja atra), 살무사(Gloydius blomhoffi), 쇠살무사(Gloydius ussirensis) 또는 까치살무사(Gloydius intermedius)에서 채취한 사독을 특징으로 하는 예방 및 치료용 조성물.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 요실금이 복압성 요실금 혹은 절박성 요실금인 것을 특징으로 하는 예방 및 치료용 조성물.
   
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 조성물의 제형이 질내 주입용 주사제 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 1항에 있어서, 액제 또는 겔(Gel)제인 조성물.
   
6. 제 1항에 있어서, 상기 사독은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%를 포함하는 질염 예방 및 치료용 조성물.
   
7. 제 1항에 있어서, 사독 및 PDRN이 중량대비 1 : 10 ~ 1 의 배합비를 갖는 조성물.
   
8. 제 1항 혹은 6항에 있어서, 상기 사독은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 2급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 극성용매에 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.

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