CN116067924A - 一种检测l-乳酸的荧光传感器及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程和生物检测技术领域，具体涉及一种检测L‑乳酸的荧光传感器及其构建方法和应用。本发明利用荧光共振能量转移技术和特异性转录调控因子LldR开发能检测L‑乳酸的荧光传感器，其具体是由青色荧光蛋白mTFP、来源于鼠伤寒沙门氏菌的特异性转录调控因子LldR和黄色荧光蛋白Venus构成，具有灵敏度高、特异性好、制备简单、成本较低、成分简单，且易于操作并能够实现高通量检测等优点，能够广泛应用于食品、医药、化工中众多与L‑乳酸相关领域，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种检测L-乳酸的荧光传感器及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物检测技术领域，具体涉及一种检测L-乳酸的荧光传感器及其构建方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

乳酸具有两种立体异构体：L-乳酸和D-乳酸。人体内产生的乳酸主要是L-乳酸。有研究表明，高的L-乳酸水平表现为严重的临床状况，如败血症、心脏骤停和肝功能衰竭等。L-乳酸水平同样也是影响多种食品，例如葡萄酒、乳制品、风味饮料、酸奶等的风味或质量的重要参数。此外，光学纯L-乳酸已被广泛应用于可降解生物塑料聚乳酸的合成，且目前L-乳酸主要是通过微生物发酵途径进行生产。因此，对于L-乳酸的持续监测对于人体动态健康评估、食品工业和发酵生产至关重要。

L-乳酸的传统检测方法包括比色法、分光光度计法、荧光法、高效液相色谱法和液相-质谱联用法等。然而，其中的一些方法如液相-质谱联用存在检测成本高、耗时长、操作复杂、无法实现高通量等局限性。生物传感器作为一种有前景的分析工具，因其在化合物定量中表现出的高灵敏度和特异性、便携性、低成本等优势备受关注。目前，已有多种电化学生物传感器被开发用于L-乳酸的定量检测。

除电化学转导信号外，光学转导信号的方法也被广泛用于生物传感器的构建。例如Laconic、GEM-IL、Green Lindoblum、eLACCO1.1、LARS、LiLac等多种荧光传感器已被开发用于乳酸的定量检测。这些荧光传感器以细菌的别构转录因子、周质结合蛋白、G蛋白偶联受体或趋化蛋白作为识别元件来检测乳酸。然而，已报道的乳酸荧光传感器的识别元件不具有立体选择性，检测的是L-乳酸和D-乳酸。因此，亟需一种具有高度立体选择性的L-乳酸荧光传感器满足L-乳酸定量检测的需要。

发明内容

为了克服上述技术问题，本发明提供一种检测L-乳酸的荧光传感器及其构建方法和应用。具体的，本发明基于荧光能量共振转移技术和来源于鼠伤寒沙门氏菌的特异性转录调控因子LldR开发一种用于检测L-乳酸的荧光传感器，其具有灵敏度高、特异性好、制备简单、成本较低、成分简单，且易于操作并能够实现高通量检测等优点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白至少包括一个L-乳酸特异性的转录调控因子，以及，分别与所述L-乳酸特异性的转录调控因子两端连接的至少两个荧光蛋白。

其中，所述L-乳酸特异性的转录调控因子为来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Typhimurium LT2)ATCC 14028的特异性转录调控因子LldR；其是发明人发现的能够特异性响应于L-乳酸的转录调控因子。

其中，所述融合蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)其它基因编码的与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到50％或50％以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。

本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述融合蛋白。

本发明的第三个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述核酸分子。

本发明的第四个方面，提供一种转化细胞，所述转化细胞含有上述核酸分子、含有上述重组表达载体或能够表达上述融合蛋白。

本发明的第五个方面，提供上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或转化细胞在制备检测L-乳酸的荧光传感器中的应用。

本发明的第六个方面，提供一种检测L-乳酸的荧光传感器，所述荧光传感器包含上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或转化细胞。

本发明的第七个方面，提供上述检测L-乳酸的荧光传感器的构建方法，所述构建方法至少包含融合蛋白的构建，具体步骤如下：

合成特异性转录调控因子LldR的编码基因lldR插入质粒中获得重组质粒，将重组质粒转入转化细胞中进行表达即得。

本发明的第八个方面，提供一种检测L-乳酸的方法，所述方法包括：将待测样品与所述融合蛋白或荧光传感器共孵育，根据荧光蛋白荧光发射强度比值变化，检测分析L-乳酸的浓度或有无。

本发明的第九个方面，提供上述融合蛋白、荧光传感器和/或上述检测方法在食品、医药、化工等领域中的应用。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：

(1)上述技术方案提供的L-乳酸荧光传感器以来源于鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028的特异性转录调控因子LldR为识别元件，利用LldR与L-乳酸结合后自身构象发生改变的特点，结合荧光能量共振转移技术，可将L-乳酸的浓度转换为荧光发射强度比值进行输出，两个荧光蛋白的荧光发射强度比值大小与样品中L-乳酸浓度有关；

(2)上述技术方案提供的L-乳酸荧光传感器是将特异性转录调控因子LldR插入青色荧光蛋白mTFP和黄色荧光蛋白Venus间组成的融合蛋白，检测体系中仅包含L-乳酸荧光传感器与缓冲液，灵敏度高、特异性好、制备简单、成分简单、成本较低、易于操作、可实现高通量检测；

(3)上述技术方案提供的L-乳酸荧光传感器适用于对微生物发酵液、食品如酵素和酸奶等生物样品中L-乳酸的浓度进行定量，定量结果与理论浓度的一致性较高，在各种生物样品的L-乳酸检测中具有广阔的应用前景。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中LldR表达纯化的SDS-PAGE验证。泳道M，Marker分子量；泳道1，表达LldR的粗提物；泳道2，纯化的LldR。

图2为本发明实施例1中FILLac_0N0C对L-乳酸的剂量-响应曲线。

图3为本发明实施例2中FILLac_10N0C对L-乳酸的剂量-响应曲线。

图4为本发明实施例3中FILLac_10N0C的pH稳定性分析。

图5为本发明实施例3中FILLac_10N0C的光谱学性质分析。

图6为本发明实施例3中FILLac_10N0C的特异性分析。

图7为本发明实施例3中FILLac_10N0C的温度敏感性分析。

图8为本发明实施例4中FILLac_10N0C与高效液相色谱检测L-乳酸结果的一致性分析。

图9为本发明实施例4中FILLac_10N0C与SBA-40D型生物传感自动分析仪检测L-乳酸结果的一致性分析。

图10为本发明实施例5中FILLac_10N0C对微生物发酵液中L-乳酸的定量结果。

图11为本发明实施例6中FILLac_10N0C对酵素和酸奶中L-乳酸的定量结果；A中待测样品为酵素，B中待测样品为酸奶。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

如前所述，目前已有的乳酸生物传感器如Laconic、eLACCO1.1、LiLac等虽能够用于监测细胞内乳酸代谢，但这些传感器不具备立体选择性，无法实现对L-乳酸的选择性检测。

基于荧光能量共振转移技术的荧光传感器是由生物识别元件和一对供、受体荧光蛋白对组成。该类荧光生物传感器已被广泛应用于检测各种小分子代谢物及研究单细胞或亚细胞区室中各种生理活动。细菌的别构转录因子由一个与特异性DNA操纵序列结合的DNA结合结构域和一个感应配体的配体结合结构域组成。已有多种别构转录因子被作为识别元件用于荧光传感器的构建。待测物与生物识别元件结合导致其构象改变，影响生物识别元件两端所融合的供、受体荧光蛋白的相对距离与空间取向，导致荧光蛋白间的荧光发射强度比值发生变化，该变化可用作相关代谢物检测的定量指标。

有鉴于此，本发明利用荧光共振能量转移技术和来源于鼠伤寒沙门氏菌的特异性转录调控因子LldR开发能检测L-乳酸的荧光传感器。

具体的，本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白至少包括一个L-乳酸特异性的转录调控因子，以及，分别与所述L-乳酸特异性的转录调控因子两端连接的至少两个荧光蛋白。

其中，所述L-乳酸特异性的转录调控因子为来源于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenterica serovar Typhimurium LT2)ATCC 14028的特异性转录调控因子LldR；所述LldR其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。其是发明人发现的能够特异性响应于L-乳酸的转录调控因子。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述融合蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)其它基因编码的与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到50％或50％以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白。

其中，所述(a2)中，所述一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加一般为不超过15个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述(a1)–(a3)中所示蛋白质可以人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达获得。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述荧光蛋白为一类可视化的报告基因编码蛋白，包括但不限于青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白；在本发明中，第一荧光蛋白可以为青色荧光蛋白(如青色荧光蛋白mTFP)，第二荧光蛋白可以为黄色荧光蛋白(如黄色荧光蛋白Venus)。当L-乳酸存在时，L-乳酸与转录调控因子LldR结合诱导LldR构象改变，进而改变其两端连接的两个荧光蛋白的荧光发射强度比值改变，从而实现对L-乳酸的检测。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种核酸分子，所述核酸分子能够编码上述融合蛋白。

具体的，所述核酸分子具有(b1)–(b4)中任一所述核苷酸序列：

(b1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；

(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有50％或50％以上的同一性，且编码所述融合蛋白的核酸分子；

(b4)在严格条件下能够与如(b1)–(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。

需要说明的是，术语“同一性”指与天然氨基酸或核苷酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述50％以上同一性，可以为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％以上的同一性。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述核酸分子。

所述重组表达载体通过上述核酸分子有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体包括病毒载体(包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体)、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体(包括细菌人工染色体BAC、噬菌体P1衍生的载体PAC、酵母人工染色体YAC或哺乳动物人工染色体MAC)；作为优选的，所述表达载体为质粒；更为优选的，所述质粒为pETDuet-1。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种转化细胞，所述转化细胞含有上述核酸分子、含有上述重组表达载体或能够表达上述融合蛋白。

所述细胞包括细菌细胞或真菌细胞；

所述细菌可以为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述细菌为大肠杆菌(如BL21(DE3))、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或荧光假单胞菌。

所述真菌包括酵母菌(如解脂耶氏酵母)。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或转化细胞在制备检测L-乳酸的荧光传感器中的应用。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种检测L-乳酸的荧光传感器，所述荧光传感器包含上述融合蛋白、核酸分子、重组表达载体和/或转化细胞。

所述荧光传感器还可以包含其他用于L-乳酸检测的试剂、装置和/或设备，本领域技术人员可根据实际情况做选择使用。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述试剂可以包含反应缓冲液(如荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4)。

在实际应用时，所述荧光传感器在实际应用时可包装为试剂盒产品使用。作为一个示例，所述试剂盒可以包含上述融合蛋白、反应缓冲液以及使用说明书等。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述检测L-乳酸的荧光传感器的构建方法，所述构建方法至少包含融合蛋白的构建，具体步骤如下：

合成特异性转录调控因子LldR的编码基因lldR插入质粒中获得重组质粒，将重组质粒转入转化细胞中进行表达即得。

其中，所述质粒为已经转入荧光蛋白编码基因的质粒，具体的，可以通过全基因合成青色荧光蛋白mTFP和黄色荧光蛋白Venus的目的基因，将其分别顺序插入质粒pETDuet-1中，即获得质粒pETDuet-mTFP-Venus。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述方法包括：

PCR扩增来源于鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028的特异性转录调控因子LldR的编码基因lldR，并插入质粒pETDuet-mTFP-Venus中，获得重组质粒；将重组质粒转入大肠杆菌中，诱导表达，纯化即得。

所述大肠杆菌可以为大肠杆菌BL21(DE3)；所述诱导表达可以采用IPTG进行，所述纯化可以采用镍柱进行亲和层析进行。

本发明中，将采用上述方法获得融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)进而构建获得的荧光传感器命名为L-乳酸荧光传感器FILLac_0N0C；

为进一步提高荧光传感器对L-乳酸的响应幅度；本发明对特异性转录调控因子LldR的N末端和/或C末端氨基酸进行截短处理；优选的，所述LldR截短变体为N末端截短10个氨基酸的LldR截短变体，此时获得的所述重组质粒为pETDuet-mTFP-lldR_10N0C-Venus，使用该重组质粒纯化获得的融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)进而构建获得的荧光传感器命名为L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供一种检测L-乳酸的方法，所述方法包括：将待测样品与所述融合蛋白或荧光传感器共孵育，根据荧光蛋白荧光发射强度比值变化，检测分析L-乳酸的浓度或有无。

本发明的一个或多个具体实施方式中，所述待测样品可以为任意含有L-乳酸或怀疑含有L-乳酸的生物样品或环境样品，所述生物样品包括但不限于微生物发酵液；所述微生物可以为天然产乳酸菌株或经人工改造的产乳酸工程菌。

本发明的一个或多个具体实施方式中，提供上述融合蛋白、荧光传感器和/或上述检测方法在食品(如酵素和酸奶等)、医药、化工等领域中的应用。特别的，在应用或含有L-乳酸且需要检测L-乳酸的领域，本发明的技术方案均可发挥作用，因此应用前景广阔。

以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。下述实施例中，使用的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Typhimurium LT2)ATCC 14028购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；使用的表达载体pETDuet-1购自诺维信(Novagen)公司；其他所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法。

实施例1：L-乳酸荧光传感器FILLac_0N0C的构建

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

LB培养基：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％NaCl；

结合缓冲液：20mM Na₂HPO₄，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4；

洗脱缓冲液：20mM Na₂HPO₄，500mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4；

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

(1)L-乳酸荧光传感器FILLac表达质粒的构建

以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028的基因组为模板，使用lldR正向引物和lldR反向引物通过PCR扩增LldR的编码基因lldR，使用限制性内切酶BamHI和HindIII对pET28a质粒双酶切使其线性化，通过T5核酸外切酶组装方法将lldR基因片段插入上述质粒，获得重组质粒pET28a-lldR。其中，所述扩增lldR基因片段的引物序列为：

lldR-正向引物

CAAATGGGTCGCGGATCCATGATTGTGATGCCAAAACGCC(SEQ ID NO.6)；

lldR-反向引物

CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCATGATTTATTCTCCCTGG(SEQ ID NO.7)。

以重组质粒pET28a-lldR为模板，使用lldR_0N0C正向引物和lldR_0N0C反向引物通过PCR扩增LldR_0N0C的编码基因lldR_0N0C，使用限制性内切酶SacI和SalI对前期构建的pETDuet-mTFP-Venus质粒双酶切使其线性化，通过T5核酸外切酶组装方法将lldR_0N0C基因片段插入至上述质粒，获得重组质粒pETDuet-mTFP-lldR_0N0C-Venus。其中，所述扩增lldR_0N0C基因片段的引物序列为：

lldR_0N0C-正向引物

TTCGCCTTTACTCACCATGTCGACTGATTTATTCTCCCTGGTCAT(SEQ ID NO.8)；

lldR_0N0C-反向引物

GGACGAGCTGTACAAGGAGCTCATGATTGTGATGCCAAAACGCC(SEQ ID NO.9)。

(2)L-乳酸荧光传感器表达条件的优化

将重组质粒pET28a-lldR和pETDuet-mTFP-lldR_0N0C-Venus通过热激转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，加入适量LB培养基在37℃条件下复苏1小时，涂布在含有50μg/mL卡那霉素或100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基，在37℃条件下培养12小时后，挑取单克隆进行培养基菌液PCR验证。

将验证正确的单克隆在LB培养基中活化两代后，以2％的接种量接种至含有氨苄青霉素抗性(100μg/mL)的500mL LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm为0.6～0.8时，向培养基中加入1mM IPTG，23℃、160rpm诱导12小时；于6000rpm离心10分钟收集菌体，使用结合缓冲液洗涤菌体两次后重悬至OD_600nm为20，同时加入1mM PMSF和10％甘油。使用高压破碎仪在800Pa压力下破碎菌体，破碎四次；将破碎液于4℃、12,000rpm离心50分钟以去除细胞碎片，所得上清液经过0.22μm的滤头过滤后，用体积为5mL的镍柱进行纯化，采用不同浓度的洗脱缓冲液洗脱获得纯化的LldR，其基因序列长度为777个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。使用SDS-PAGE检测LldR的纯度，结果如附图1。L-乳酸荧光传感器FILLac_0N0C的表达纯化方法如上述步骤，其基因序列长度为2214个碱基，核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

(3)荧光发射强度比值测定

使用荧光测定缓冲液稀释纯化的FILLac_0N0C至4/3μM，将FILLac_0N0C和待测样品以3:1的体积比混合于黑色的96微孔板中，总体积设置为100μL，每个样品设置三个复孔平行。孵育20分钟后，使用EnSight多功能微孔板检测仪(美国PerkinElmer公司)检测430nm激发时，485nm(mTFP)和528nm(Venus)处的荧光强度，将528nm处的荧光强度除以485nm处的荧光强度，获得FILLac_0N0C的荧光发射强度比值。

(4)L-乳酸荧光传感器FILLac_0N0C对L-乳酸的响应

使用荧光测定缓冲液配制梯度浓度的L-乳酸标准品溶液，根据上述(3)中所述的荧光发射强度比值测定方法，将FILLac_0N0C和含有不同浓度的L-乳酸标准品溶液混合孵育后，测定每个孔的荧光发射强度比值。将荧光发射强度比值与L-乳酸的浓度相对应，获得FILLac_0N0C的剂量响应曲线，结果如附图2所示，FILLac_0N0C的荧光发射强度比值以浓度依赖的方式响应于所添加的L-乳酸，L-乳酸的浓度越大，荧光发射强度比值越小。L-乳酸荧光传感器FILLac_0N0C的最大荧光比值变化ΔR_max为19.10±2.47％，亲和常数K_d为7.74±2.30μM。

实施例2：L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的构建

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

LB培养基：0.5％酵母粉、1％蛋白胨、1％NaCl；

结合缓冲液：20mM Na₂HPO₄，20mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4；

洗脱缓冲液：20mM Na₂HPO₄，500mM咪唑，500mM NaCl，pH 7.4；

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

(1)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C表达质粒的构建

对特异性转录调控因子LldR的N末端和/或C末端氨基酸进行截短，以提高荧光传感器对L-乳酸的响应幅度。PCR扩增LldR截短变体的基因片段，将其插入至质粒pETDuet-mTFP-Venus的酶切位点SacI和SalI中间，构建不同传感器变体的编码质粒。

按照实施例1中的方法将不同传感器变体的编码质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，对传感器变体进行表达与纯化，并测定传感器变体对L-乳酸的响应。以最大荧光比值变化ΔR_max为指标，对传感器变体进行筛选。当LldR的N末端截短10个氨基酸时，使用截短变体LldR_10N0C构建的传感器变体具备最大的荧光比值变化，将该传感器变体命名为FILLac_10N0C，基因序列长度为2184个碱基，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，对应的重组质粒为pETDuet-mTFP-lldR_10N0C-Venus。其中，所述扩增lldR_10N0C基因片段的引物序列为：

lldR_10N0C-正向引物

GGACGAGCTGTACAAGGAGCTCGAGATTGCCTCTCGCGTGCGG(SEQ ID NO.10)；

lldR_10N0C-反向引物同lldR_0N0C-反向引物

GGACGAGCTGTACAAGGAGCTCATGATTGTGATGCCAAAACGCC(SEQ ID NO.9)。

结果如附图3所示，FILLac_10N0C的荧光发射强度比值以浓度依赖的方式响应于所添加的L-乳酸，L-乳酸的浓度越大，荧光发射强度比值越小，最大荧光比值变化ΔR_max为33.47±1.91％，亲和常数K_d为6.33±0.79μM。

实施例3：L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的pH稳定性、光谱学性质、特异性和温度敏感性

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

(1)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的pH稳定性

配制pH为4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0的50mM Tris-HCl缓冲液，稀释L-乳酸至0μM、4μM、40μM和400μM；使用pH为7.4的50mM Tris-HCl缓冲液稀释纯化的FILLac_10N0C至4/3μM，按照实施例1中的方法测定L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C对不同pH L-乳酸的荧光发射强度比值。结果如附图4所示，在pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中，FILLac_10N0C检测0μM、1μM、10μM或100μM的L-乳酸时荧光比值基本不变，表明FILLac_10N0C对L-乳酸的检测不受样品pH的干扰。

(2)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的光谱学性质

使用荧光测定缓冲液稀释纯化的FILLac_10N0C至4/3μM，稀释L-乳酸至100μM，将稀释后的FILLac_10N0C分别与0μM和100μM的L-乳酸孵育处理，在430nm的激发光条件下，以2nm为步进，连续采集445–600nm的荧光发射值。结果如附图5所示，L-乳酸的添加导致FILLac_10N0C在492nm(mTFP)处荧光发射峰升高，而526nm(Venus)处的荧光发射峰降低，最终造成FILLac_10N0C中Venus与mTFP的荧光发射强度比值降低。

(3)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的特异性

使用荧光测定缓冲液稀释纯化的FILLac_10N0C至4/3μM，稀释各化合物至200μM，按照实施例1中的方法检测FILLac_10N0C对不同化合物的荧光发射强度比值。结果如附图6所示，表明L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C具有很好的特异性。

(4)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的温度敏感性

使用荧光测定缓冲液分别稀释纯化的FILLac_10N0C至4/3μM和配制梯度浓度的L-乳酸标准品溶液，将FILLac_10N0C和含有不同浓度的L-乳酸标准品溶液混合在不同温度(25℃、28℃、31℃、34℃、37℃、40℃或45℃)孵育后，按照实施例1中的方法检测FILLac_10N0C在不同温度时的剂量响应曲线。结果如附图7所示，表明L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C对温度变化不敏感，其对L-乳酸的检测不受温度的干扰。

实施例4：L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C定量L-乳酸的性能分析

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

本实施例中，含有L-乳酸样品为使用荧光测定缓冲液配制不同浓度(2mM、4mM、20mM、40mM、100mM、160mM、200mM)L-乳酸标准品溶液。

本实施例中涉及样品检测方法包括L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C、商品化L-乳酸传感器SBA-40D型生物传感自动分析仪和高效液相色谱。

(1)高效液相色谱测定含有L-乳酸样品

使用装备有RID检测器和Aminex HPX-87H阴离子交换柱(300×7.8mm，Bio-Rad，USA)的LC-20AT液相色谱(Shimadzu，Japan)分析含有L-乳酸样品。流动相为10mM稀硫酸，流速为0.4mL/min。柱温为55℃，进样量为5μL，分析时间是35min。测定含有L-乳酸样品的峰面积，同时制备L-乳酸的标准曲线。将测定含有L-乳酸样品的峰面积代入L-乳酸的标准曲线中，获得峰面积所对应的具体的L-乳酸浓度，即为所述含有L-乳酸样品中L-乳酸的定量结果。

(2)SBA-40D型生物传感自动分析仪测定含有L-乳酸样品

SBA-40D型生物传感自动分析仪装备有L-乳酸氧化酶酶膜，能够测定L-乳酸浓度。使用超纯水稀释含有L-乳酸样品，保证待测样品中L-乳酸浓度在0–100mg/dL范围内，将测定结果除以2并乘以稀释倍数，获得对所述含有L-乳酸样品中L-乳酸的定量结果。

(3)L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C测定含有L-乳酸样品

按照实施例1中的方法测定L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C对L-乳酸样品的荧光发射强度比值，同时测定L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C在荧光测定缓冲液中对L-乳酸的剂量响应曲线。将L-乳酸样品的荧光发射强度比值代入L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C在荧光测定缓冲液中对L-乳酸的剂量响应曲线中，获得荧光发射强度比值所对应的具体的L-乳酸浓度，进一步将该结果乘以4及所稀释倍数，获得对所述含有L-乳酸样品中L-乳酸的定量结果。

比较所述三种L-乳酸定量检测方法的一致性。结果如附图8和附图9所示，FILLac_10N0C对L-乳酸的定量结果与高效液相色谱(HPLC)及SBA-40D型生物传感自动分析仪的定量结果均具有很高的一致性(R²>0.999)。

实施例5：L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C在检测含有L-乳酸的微生物发酵样品中的应用

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

乳酸菌培养基：MRS培养基；

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

本实施例中，含有L-乳酸的微生物发酵样品的制备方法为：

三种乳酸生产菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)ATCC334、植物乳杆菌(L.plantarum)ATCC14917和保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)ATCC11842分别在含有50mLMRS培养基和1％CaCO₃的100mL摇瓶中进行发酵培养。在37℃条件下静置培养24h。发酵结束后收集各菌株发酵液。取各菌株发酵液置于105℃金属浴中加热15min，于14,500rpm离心15分钟，收集上清液得到各菌株发酵样品，保存于–20℃冰箱备用。

本实施例中涉及样品检测方法包括L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C和商品化L-乳酸传感器SBA-40D型生物传感自动分析仪。

按照实例4中所述SBA-40D型生物传感自动分析仪测定方法和L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C测定方法分别测定各菌株发酵样品中L-乳酸浓度。结果如附图10所示，L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的检测结果与SBA-40D型生物传感自动分析仪的检测结果无显著性差异(ns，no significant difference)，说明L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C可以像商品化的SBA-40D型生物传感自动分析仪一样用于发酵样品中L-乳酸的定量检测。

实施例6：L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C在检测食品中L-乳酸的应用

本实施例中所使用的培养基和试剂如下：

荧光测定缓冲液：50mM Tris-HCl，pH 7.4。

本实施例中，所述食品为三种酵素和三种酸奶，食品样品的制备方法为：

三种酸奶(酸奶A、酸奶B、酸奶C)和三种酵素(酵素A、酵素B、酵素C)购买自当地超市。取各酸奶和酵素置于105℃金属浴中加热15min，于14,500rpm离心15分钟，收集上清液得到各酸奶和酵素样品，保存于–20℃冰箱备用。

本实施例中涉及样品检测方法包括L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C和商品化L-乳酸传感器SBA-40D型生物传感自动分析仪。

按照实例4中所述SBA-40D型生物传感自动分析仪测定方法和L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C测定方法分别测定各酸奶和酵素样品中L-乳酸浓度。结果如附图11所示，L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C的检测结果与SBA-40D型生物传感自动分析仪的检测结果无显著性差异(ns，no significant difference)，进一步证明了L-乳酸荧光传感器FILLac_10N0C可以用于不同样品中L-乳酸的选择性检测。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白至少包括一个L-乳酸特异性的转录调控因子，以及，分别与所述L-乳酸特异性的转录调控因子两端连接的至少两个荧光蛋白；所述L-乳酸特异性转录调控因子为来源于鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028的特异性转录调控因子LldR。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白选自：

(a1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(a3)其它基因编码的与(a1)或(a2)所示的氨基酸序列组成具有同一性达到50％或50％以上并且具有与(a1)或(a2)所示的蛋白质具有相同功能的蛋白；

第一荧光蛋白为青色荧光蛋白(包括青色荧光蛋白mTFP)，第二荧光蛋白为黄色荧光蛋白(包括黄色荧光蛋白Venus)。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子能够编码权利要求1或2所述融合蛋白；

具体的，所述核酸分子具有(b1)–(b4)中任一所述核苷酸序列：

(b1)如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；

(b2)如(b1)所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失和/或添加形成的序列；

(b3)与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有50％或50％以上的同一性，且编码所述融合蛋白的核酸分子；

(b4)在严格条件下能够与如(b1)-(b3)中任一项所述核苷酸序列杂交并编码相同功能融合蛋白的核苷酸序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求3所述核酸分子。

5.一种转化细胞，其特征在于，所述转化细胞含有权利要求3所述核酸分子、含有权利要求4所述重组表达载体或能够表达权利要求1或2所述融合蛋白。

6.权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述重组表达载体和/或权利要求5所述转化细胞在制备检测L-乳酸的荧光传感器中的应用。

7.一种检测L-乳酸的荧光传感器，其特征在于，所述荧光传感器含有权利要求1或2所述融合蛋白、权利要求3所述核酸分子、权利要求4所述重组表达载体和/或权利要求5所述转化细胞；

所述荧光传感器还可以包含其他用于L-乳酸检测的试剂、装置和/或设备；

所述试剂包含反应缓冲液。

8.权利要求7所述检测L-乳酸的荧光传感器的构建方法，其特征在于，所述构建方法至少包含融合蛋白的构建，具体步骤如下：

合成特异性转录调控因子LldR的编码基因lldR插入质粒中获得重组质粒，将重组质粒转入转化细胞中进行表达即得。

9.一种检测L-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括：将待测样品与权利要求1或2所述融合蛋白或权利要求7所述荧光传感器共孵育，根据荧光蛋白荧光发射强度比值变化，检测分析L-乳酸的浓度或有无。

10.权利要求1所述融合蛋白、权利要求7所述荧光传感器和/或权利要求9所述检测方法在食品、医药、化工领域中的应用。

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