CN116064794A - circRNA在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用 - Google Patents

circRNA在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及circRNA在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用。本发明通过研究发现，circRNA‑CREIT在乳腺癌组织中表达显著低于周围正常乳腺组织，在TNBC细胞系中的表达显著低于non‑TNBC，且circRNA‑CREIT过表达与乳腺癌患者的预后良好显著相关。在TNBC细胞系中过表达circRNA‑CREIT可以显著增强细胞对阿霉素化疗药物的敏感性。因此circRNA‑CREIT可以为增强TNBC的化疗敏感性提供新型治疗靶点，并为乳腺癌患者的预后判断提供新型预测因子，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

circRNA在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用
技术领域
本发明属于疾病诊治和分子生物学技术领域，具体涉及circRNA在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乳腺癌是全球女性发病率最高的癌症类型，近年来其诊断率仍呈升高趋势。根据雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)以及人表皮生长因子受体(HER-2)的表达，乳腺癌可分为三大类：Luminal型乳腺癌、HER-2阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌(triple-negative breastcancer，TNBC)。其中，TNBC是指ER、PR和HER-2表达均呈阴性的乳腺癌亚型，约占乳腺癌病例总数的15％。与Luminal型和HER-2阳性乳腺癌相比，TNBC具有更高的侵袭性和复发转移潜能，预后较差。由于上述受体的缺失，TNBC患者无法从传统的内分泌治疗和Her2靶向治疗中获益。到目前为止，化疗仍是TNBC患者主要的全身治疗手段。尽管与非三阴性乳腺癌(non-TNBC)相比，TNBC患者对蒽环类和紫杉醇类化疗药物具有更高的敏感性，但大部分患者在治疗过程中会出现化疗耐药的问题，最终造成疾病的复发转移。TNBC患者在诊断后3-5年的复发风险显著高于激素受体阳性患者。因此探究TNBC进展及化疗耐药的潜在机制，寻找有效的新型治疗靶点是亟待解决的临床难题。
环状RNA(circRNA)是一种新型内源性RNA分子，是由前体RNA经反向剪接形成的。与线性RNA相比，环状RNA没有5’端帽和3’多聚A尾，具有生物保守性好，稳定高及对核酸外切酶不敏感的特点。环状RNA可以通过多种机制影响基因表达，例如作为miRNA的内源性吸附海绵、与蛋白结合并调控蛋白质的稳定性或蛋白间相互作用、转录调节及选择性剪切调控等。越来越多的证据强调了环状RNA在癌症的发生发展中发挥重要的调控作用。然而，环状RNA调控TNBC化疗耐药性的功能和潜在机制在很大程度上尚不明确。因此，鉴定在化学敏感性中具有调节作用的环状RNA并研究其潜在机制可能为TNBC提供新的治疗靶点。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供circRNA-CREIT在增强三阴性乳腺癌化疗敏感性及乳腺癌患者预后评估中的应用。本发明通过研究发现，circRNA-CREIT在乳腺癌组织中表达显著低于周围正常乳腺组织，在TNBC细胞系中的表达显著低于non-TNBC,且circRNA-CREIT过表达与乳腺癌患者的预后良好显著相关。在TNBC细胞系中过表达circRNA-CREIT可以显著增强细胞对阿霉素化疗药物的敏感性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供检测circRNA-CREIT表达水平的物质在制备乳腺癌预后评估产品中的应用。
其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
所述乳腺癌预后评估包括对(三阴性)乳腺癌患者的生存期进行评估；
所述生存期包括总生存期(OS)。
本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含检测circRNA-CREIT表达的物质，所述产品可用于乳腺癌预后评估。
本发明的第三个方面，提供一种用于乳腺癌预后评估的系统，所述系统包括：
i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述circRNA-CREIT表达水平的检测物质，以及；
ii)评估模块，所述评估模块包含根据i)中确定的所述circRNA-CREIT表达判断所述受试者预后情况。
本发明的第四个方面，提供circRNA-CREIT作为靶点在乳腺癌治疗和/或筛选乳腺癌药物中的应用。
本发明的第五个方面，提供促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a)增强乳腺癌细胞对化疗药物敏感性或制备增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性的产品；
(b)治疗乳腺癌或制备治疗乳腺癌的产品。
其中，所述乳腺癌可以为三阴性乳腺癌。
本发明的第六个方面，提供一种治疗乳腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用上述促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质。
具体的，在TNBC细胞系中过表达circRNA-CREIT可以显著增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗药物的敏感性，从而达到治疗乳腺癌之目的。
与现有技术方案相比，上述一个或多个技术方案具有如下有益效果：
TNBC患者在接受化疗过程中容易出现耐药，造成病情恶化甚至死亡。本发明通过研究发现，circRNA-CREIT可以为增强TNBC的化疗敏感性提供新型治疗靶点，并为乳腺癌患者的预后判断提供新型预测因子，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为circRNA-CREIT的结构模式图。
图2为本发明实施例中circRNA-CREIT在乳腺癌组织中的表达显著低于周围正常组织。
图3为本发明实施例中高表达circRNA-CREIT的乳腺癌患者预后显著优于低表达组。
图4为本发明实施例中circRNA-CREIT在TNBC中表达显著低于non-TNBC。
图5为测序结果显示circRNA-CREIT的接头序列。
图6为本发明实施例中在TNBC细胞中过表达circRNA-CREIT可以增强细胞对阿霉素(DOX)的敏感性。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测circRNA-CREIT表达水平的物质在制备乳腺癌预后评估产品中的应用。
其中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
所述乳腺癌预后评估包括对(三阴性)乳腺癌患者的生存期进行评估；
所述生存期包括总生存期(OS)。
所述circRNA-CREIT是由宿主基因SPIDR的6-7号外显子环化而成，染色体位置为chr8:48308935-48320523。
其核苷酸序列如下所示：
CCAAGTTCTATAGAAATTTTAGAGTATTCATCAGATAGTGAAAAAGAAGATGATTTGGAAAATGTCCTACTCATTGATTCAGAATCCCCTCACAAATACCACGTGCAGTTTGCATCGGATGCAAGACAGATTATGGAGAGACTGATAGATCCAAGGACAAAATCAACAGAGACCATTTTGCATACACCTCAGAAACCCACAGCTAAGTTTCCCAGGACTCCAGAAAATTCAGCAAAGAAGAAGCTTTTAAGAGGTGGACTAGCAGAAAGACTAAATGGACTGCAGAATCGAGAGAGATCTGCTATTTCTTTGTGGAGACATCAATGTATTTCTTACCAAAAGACACTTTCAG(SEQ ID NO.1)。
本发明利用生物学技术，发现circRNA-CREIT在乳腺癌组织中表达显著低于周围正常乳腺组织，在TNBC细胞系中的表达显著低于non-TNBC，且circRNA-CREIT过表达与乳腺癌患者的预后良好显著相关。在TNBC细胞系中过表达circRNA-CREIT可以显著增强细胞对阿霉素化疗药物的敏感性。这预示本发明可为TNBC提供新型治疗靶点，为乳腺癌患者的预后提供新的预测因子。
在本发明中，对检测circRNA-CREIT表达水平的物质不做具体限定，其包括但不限于定量和/或定性检测物质；优选的，检测circRNA-CREIT表达水平的物质为定量检测待测样本中检测circRNA-CREIT表达水平的物质。
其中，所述待测样本可以为受试者的乳腺癌细胞或组织。
所述受试者为乳腺癌患者，具体可以为三阴性乳腺癌患者。
本发明的又一具体实施方式中，上述检测待测样本中circRNA-CREIT表达水平的物质为选自基因扩增引物(如SEQ ID NO.2-3)、探针、基因芯片中的一种或几种。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含检测circRNA-CREIT表达的物质，所述产品可用于乳腺癌预后评估。
本发明的又一具体实施方式中，所述检测待测样本中circRNA-CREIT表达水平的物质为选自基因扩增引物(如SEQ ID NO.2-3)、探针、基因芯片中的一种或几种。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为检测试剂、检测试剂盒或生物传感器等等，在此不做具体限定。
本发明的第三个方面，提供一种用于乳腺癌预后评估的系统，所述系统包括：
i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述circRNA-CREIT表达水平的检测物质，以及；
ii)评估模块，所述评估模块包含根据i)中确定的所述circRNA-CREIT表达判断所述受试者预后情况。
其中，所述受试者为三阴性乳腺癌患者，所述待测样品包括但不限于乳腺癌患者的乳腺癌细胞或组织，所述预后情况包括但不限于对乳腺癌患者的生存期进行评估；所述生存期包括总生存期(OS)。
更具体的，所述判断所述受试者预后情况具体为：当所述circRNA-CREIT高表达时，则表明受试者预后较好(总生存期较长)，反之则表明受试者预后较差(总生存期较短)。
本发明的又一具体实施方式中，提供circRNA-CREIT作为靶点在乳腺癌治疗和/或筛选乳腺癌药物中的应用。
本发明的又一具体实施方式中，所述筛选乳腺癌药物的方法包括：
1)采用候选药物处理表达和/或含有所述circRNA-CREIT的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；
2)完成步骤1)后，检测体系中所述circRNA-CREIT的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选药物处理的体系中所述circRNA-CREIT的表达量显著提高，所述候选物质可作为候选的乳腺癌治疗药物。
其中，所述乳腺癌治疗药物可以为三阴性乳腺癌治疗药物，更具体的，所述三阴性乳腺癌治疗药物为增强乳腺癌对化疗药物敏感性的药物。
本发明的又一具体实施方式中，提供促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a)增强乳腺癌细胞对化疗药物敏感性或制备增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性的产品；
(b)治疗乳腺癌或制备治疗乳腺癌的产品。
本发明的又一具体实施方式中，所述乳腺癌可以为三阴性乳腺癌；
促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质包括但不限于采用基于基因特异性技术上调circRNA-CREIT表达和/或促进其活性的物质；如人工合成的短发夹RNA(shorthairpin RNA，shRNA)或上调circRNA-CREIT表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂。
所述产品可以为药物或实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。比如构建三阴性乳腺癌细胞模型，通过对其circRNA-CREIT进行过表达，探究其耐化疗药物耐药性的相关机制。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，优选为人。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗乳腺癌的方法，所述方法包括向受试者施用上述促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质。
具体的，在TNBC细胞系中过表达circRNA-CREIT可以显著增强乳腺癌细胞对阿霉素化疗药物的敏感性，从而达到治疗乳腺癌之目的。
以下结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发
明，并不对其内容进行限定。凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂、质粒、专用试剂盒等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例
(1)实验材料与步骤
1)细胞培养与传代
乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468和HS578T使用添加10％胎牛血清、100U/ml的青霉素-链霉素双抗的DMEM完全培养基进行培养。MDA-MB-436、MCF-7、ZR-75-1、ZR-75-30和SKBR3使用添加10％的胎牛血清、100U/ml的青霉素-链霉素双抗的RPMI-1640完全培养基进行培养。所有细胞均置于含有5％CO2的37℃细胞孵箱中进行培养。细胞传代时，使用EDTA-胰酶对贴壁细胞进行消化，用完全培养基终止消化，800rpm离心5min，弃上清，用完全培养基重悬细胞沉淀。然后加入洁净无菌的培养皿中进行培养。
2)细胞总RNA的提取与实时定量PCR实验
细胞总RNA的提取使用南京诺唯赞公司的RNA-easy分离液进行，按照厂家说明书进行实验操作。使用美国赛默飞品牌的NanoDrop 2000仪器对所提取RNA的纯度、完整度以及浓度进行检测。使用500ng细胞总RNA进行逆转录实验，此实验使用的是试剂盒是Takara品牌的PrimeScript逆转录试剂盒。实时定量PCR实验使用的是罗氏公司的Light Cycler480II实时定量PCR仪和Takara的SYBR Premix Ex TaqII试剂盒。本实验使用的引物序列如下表1所示(β-Actin作为内参)：
表1
Figure BDA0003795497850000081
3)乳腺癌组织RNA的提取与实时定量PCR实验。
将乳腺癌手术标本从-80℃冰箱取出，于冰上将组织切成3-4mm大小的碎块，置于洁净无RNA酶的EP管中。向EP管中加入大约500μL RNA-easy分离液提取试剂，将2颗研磨钢珠加入EP管中。将EP管置于-30℃冷冻研磨仪中，研磨程序为研磨60s，停30s。盖好研磨仪盖子，启动研磨程序，大约研磨5-8次，直至将组织块研磨成匀浆。组织RNA的提取及实时定量PCR的实验步骤参照细胞RNA的提取。
4)PCR实验及Sanger测序
为了验证circRNA-CREIT在三阴性乳腺癌细胞中的序列，我们进行了Sanger测序鉴定。首先使用MDA-MB-231细胞总RNA通过逆转录得到的cDNA作为模板，利用circRNA-CREIT的特异性引物(见表1)和艾科瑞生物科技有限公司的ApexHF HS DNA Polymerase FS预混型PCR试剂盒将circRNA-CREIT的特异性反向剪接位点附近的DNA片段扩增出来，然后利用天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒将DNA片段进行纯化提取，测定浓度和纯度后送往铂尚生物技术有限公司进行Sanger测序鉴定。
5)乳腺癌细胞化疗敏感性检测
为了检测circRNA-CREIT对三阴性乳腺癌阿霉素(Doxorubicin,DOX)敏感性的影响，我们进行了MTT实验。首先将一定数目的三阴性乳腺癌细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24小时后将培养基换成添加不同浓度梯度DOX的完全培养基，每孔100μl，继续培养48-72小时。加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃培养4-6小时后，小心吸弃培养基，然后加入100μl二甲基亚砜溶液，轻轻拍打培养板待蓝紫色结晶完全溶解后，置于酶标仪中检测各孔在490nm处的吸光度值。
6)数据统计及分析
使用GraphPad Prism V8.3.0进行统计分析，数据以平均值±标准差表示。采用非配对双尾Student t检验比较不同组别组织或细胞中基因表达的差异。应用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验比较circRNA CREIT高表达和低表达患者的生存率。在我们的研究中，p<0.05被认为具有统计学意义。
(2)实验结果与讨论
通过检索网络数据库Circinteractome，我们发现circRNA-CREIT由SPIDR基因的6号-7号外显子反向剪接构成。利用UCSC基因组浏览器，我们发现其序列在不同物种间具有良好的保守性(图1)。实时定量PCR实验显示circRNA-CREIT在乳腺癌组织中的表达显著低于周围正常组织中的表达(图2)，且Kaplan-Meier生存曲线显示，乳腺癌组织中高表达circRNA-CREIT的乳腺癌患者其总生存率显著优于circRNA-CREIT低表达的患者(图3)。此外，我们发现circRNA-CREIT在TNBC亚型细胞中的表达显著低于non-TNBC亚型的表达(图4)，这提示circRNA-CREIT可能对TNBC的进展具有潜在的调控作用。为了进一步验证circRNA-CREIT在TNBC细胞中的表达，我们以MDA-MB-231细胞的cDNA为模板，用circRNA-CREIT的特异性引物进行了PCR实验，并对PCR产物进行了Sanger测序，通过对测序结果的分析，我们确认了circRNA-CREIT的反向剪接位点(图5)。接下来我们利用MTT实验发现，circRNA-CREIT过表达可以显著增强TNBC细胞对化疗药物阿霉素的敏感性(图6)。
在本发明中我们首次发现circRNA-CREIT在乳腺癌，特别是TNBC中的表达紊乱，并发现其作为新型乳腺癌预后预测因子以及生物标志物的潜能。此外我们首次揭示增强circRNA-CREIT的表达有望成为提高TNBC对化疗敏感性的有效手段，具有重要的临床意义及社会经济学意义。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.检测circRNA-CREIT表达水平的物质在制备乳腺癌预后评估产品中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，
所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
所述乳腺癌预后评估包括对(三阴性)乳腺癌患者的生存期进行评估；
优选的，所述生存期包括总生存期。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，检测circRNA-CREIT表达水平的物质为定量检测待测样本中检测circRNA-CREIT表达水平的物质。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，待测样本为受试者的乳腺癌细胞或组织；
优选的，所述受试者为乳腺癌患者，具体可以为三阴性乳腺癌患者。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于，检测待测样本中circRNA-CREIT表达水平的物质为选自基因扩增引物(包括SEQ ID NO.2-3)、探针、基因芯片中的一种或几种。
6.一种产品，其特征在于，所述产品包含检测circRNA-CREIT表达的物质，所述产品用于乳腺癌预后评估。
7.如权利要求6所述产品，其特征在于，检测待测样本中circRNA-CREIT表达水平的物质为选自基因扩增引物(包括SEQ ID NO.2-3)、探针、基因芯片中的一种或几种；
优选的，所述产品为检测试剂、检测试剂盒或生物传感器。
8.一种用于乳腺癌预后评估的系统，其特征在于，所述系统包括：
i)分析模块，所述分析模块包含用于确定受试者的待测样品中选自上述circRNA-CREIT表达水平的检测物质，以及；
ii)评估模块，所述评估模块包含根据i)中确定的所述circRNA-CREIT表达判断所述受试者预后情况；
优选的，所述受试者为三阴性乳腺癌患者，所述待测样品包括乳腺癌患者的乳腺癌细胞或组织，所述预后情况包括对乳腺癌患者的生存期进行评估；所述生存期包括总生存期。
9.促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质在如下任意一种或多种中的应用：
(a)增强乳腺癌细胞对化疗药物敏感性或制备增强乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性的产品；
(b)治疗乳腺癌或制备治疗乳腺癌的产品。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌；
促进circRNA-CREIT表达和/或活性提高的物质包括采用基于基因特异性技术上调circRNA-CREIT表达和/或促进其活性的物质；包括人工合成的短发夹RNA或上调circRNA-CREIT表达的启动子或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂；
所述产品为药物或实验试剂。
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