CN116064492A - 一种具有高活性的重组酰胺水解酶及其编码基因、重组载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有高活性的重组酰胺水解酶及其编码基因、重组载体及应用，属于酶工程技术领域。本发明还提供了该酰胺水解酶的最适pH及其在降解赭曲毒素A中的应用。该重组酰胺水解酶在室温条件下，pH 8.0的缓冲体系中处理含有赭曲毒素A的小麦粉和茯砖茶粉样品15‑25分钟，赭曲毒素A的降解率即达到100％，这个降解效率在本领域是前所未有的。

Description

一种具有高活性的重组酰胺水解酶及其编码基因、重组载体及应用

技术领域

本发明涉及一种酰胺水解酶及其编码基因、重组载体、重组菌及应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

霉菌毒素是由青霉属、曲霉属、镰刀霉属等100余种有害真菌产生的毒性次级代谢产物，包括赭曲毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、棒曲霉素、黄曲毒素等300余种，广泛存在于受霉菌污染的各种谷物、水果、坚果及其制品中。霉菌毒素产生于农产品的田间生长、采后储藏、生产加工等多个环节，具有致癌、致突变、引起动物生殖紊乱、组织器官损伤与病变等毒副作用，严重威胁人类健康，给全球食品业和农牧业造成了巨大的经济损失。

其中，赫曲毒素A(ochratoxin A,OTA)是由赫曲霉、疣孢青霉等真菌产生的次级代谢产物，广泛存在于各种受霉菌污染的谷物、饲料和干果中，污染范围广、程度高。OTA具有强烈的肾毒性、肝毒性、细胞毒性、免疫毒性，还具有潜在的致癌性，被国际癌症研究机构列为潜在的ⅡB类致癌物质，是公共健康和食品安全领域关注的热点。目前，OTA的脱毒方法包括：物理吸附法和化学分解法，这些方法能够去除食品及饲料中部分的OTA。但是，物理吸附法和化学分解法用于OTA脱毒具有成本高昂、化学残留、脱毒不够彻底、引起食品及饲料的感官变化、营养成分流失等问题。利用特异性的生物酶催化OTA降解，具有成本低、安全、高效等优势，被认为是去除OTA污染最具应用前景的方法。因此，筛选或者通过分子改造技术，获得高效的生物脱毒酶及其编码基因，将为OTA的高效降解与脱毒提供重要的生物解决方案。

酰胺水解酶可以水解OTA生成无毒性的赭曲毒素α(ochratoxinα,OTα)和L-苯丙氨酸，该水解途径被认为是OTA最有效的脱毒方法。来源于Stenotrophomonas sp.CW117的酰胺水解酶ADH3可将OTA转化为OTα和L-苯丙氨酸，且ADH3降解OTA的活性高于目前报道的所有的OTA水解酶。但是现有的用于降解赭曲霉素A的酶的降解效率不高，或不适合工业应用，因此需要提出一种赭曲毒素A降解率高，且适合工业应用的酰胺水解酶。

发明内容

为解决上述问题，本发明在于通过结构分析、理性设计与定点突变技术来改造现有的寡养单胞菌来源酰胺水解酶ADH3，以增强其对OTA的水解活性，进而提升其在产业上的应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种重组酰胺水解水解酶，其氨基酸序列为将SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的第88位的丝氨酸突变为天冬氨酸或赖氨酸的序列。

突变后的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示。

所述酰胺水解酶的氨基酸序列含有SEQ ID NO.4所述序列的第21～427位的氨基酸序列。

或，所述酰胺水解酶的氨基酸序列含有SEQ ID NO.6所述序列的第21～427位的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码所述重组酰胺水解酶的基因。

进一步地，所述的基因具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列的第61～1284位所示的核苷酸序列。

进一步地，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列的第61～1284位所示的核苷酸序列。

编码本发明所述酰胺水解酶的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括(但不局限于)：(1)用探针与基因或cDNA文库杂交以检出同源性的多核苷酸序列和(2)表达文库的活性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，该表达文库可以包括环境宏基因组文库或某个纯培养菌株所建的克隆文库。本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：(1)从基因组DNA分离双链DNA序列；(2)化学合成DNA序列以获得所述酰胺水解酶的双链DNA。

本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组载体。

进一步地，所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

本发明中，编码酰胺水解酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞等。

用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的本领域众所周知，可供选择的是用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

利用本发明的多核苷酸序列，通过常规的重组DNA技术来表达或生产重组的酰胺水解酶，包括以下步骤：

(1)用本发明的编码的重组酰胺水解酶的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞的条件下进行培养。当宿主细胞生长在适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在步骤(3)中，重组酶可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、亲和层析、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的第四个目的是提供所述重组酰胺水解酶在降解赭曲毒素A中的应用。进一步地，所述的应用包括降解小麦粉或茶叶中的赭曲毒素A。

本发明的第五个目的是提供一种包含所述重组酰胺水解酶的酶制剂。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种重组酰胺水解酶及其编码基因，还提供了该酰胺水解酶的最适pH及其在水解赭曲毒素A或者粮食或茶叶中赭曲毒素A脱毒中的应用。该酰胺水解酶在室温条件下，pH 8.0的缓冲体系中处理含有赭曲毒素A的小麦粉或者茶叶15-25分钟，赭曲毒素A的降解率即达到100％，这个降解效率在本领域是前所未有的。

附图说明

图1为ADH3水解赭曲毒素A生成苯丙氨酸和赭曲毒素α的反应式；

图2为ADH3与底物赭曲毒素A的复合体结构；

图3为原核表达的重组酰胺水解酶ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K的SDS-PAGE蛋白电泳；

图4为ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K的高效液相色谱；

图5为ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K降解赭曲毒素A的相对酶活比较；

图6为重组酰胺水解酶ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K对粮食(小麦粉)中赭曲毒素A的降解效果比较；

图7为重组酰胺水解酶ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K对茯砖茶粉中赭曲毒素A的降解效果比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

寡养单胞菌株(Stenotrophomonas sp.)是于2015年6月14日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072)保藏的，其微生物保藏号是CCTCC NO:M2015371；分类命名为：寡养单胞菌CW117株。

实施例1：酰胺水解酶基因的合成、酰胺水解酶表达及突变体构建

参照ZL201910004511.3记载的方法通过全基因合成的方法获得酰胺水解酶基因ADH3，ADH3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的ADH3酰胺水解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。然后利用限制性内切酶NcoI及XhoI将ADH3基因连接到pET46EK载体上，构建pET46EK-ADH3重组质粒。接着将pET46EK-ADH3重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，构建含有pET46EK-ADH3重组质粒的大肠杆菌工程菌。异源表达上述酰胺水解酶基因获得不含有信号肽的酰胺水解酶ADH3，利用该酶制剂与赭曲毒素A标准缓冲液(使用1*PBS配置pH 7.3)反应，赭曲毒素A的终浓度约为40μg/L，反应2min，向反应体系中加入1.5mL的乙腈停止反应。ADH3降解OTA的反应式如图1所示，ADH3可以水解OTA分子内的酰胺键，生成无毒性的苯丙氨酸和赭曲毒素α。

利用冷冻电镜技术解析了ADH3与赭曲毒素A(ochratoxin A,OTA)的复合体结构，复合体结构如图2所示，ADH3与赭曲毒素A的蛋白复合体结构显示，第88位的丝氨酸残基系位于活性区域附近，但是与底物赭曲毒素A(ochratoxin A,OTA)没有相互作用力。为了进一步增强赭曲毒素A与底物口袋的结合力，故此把丝氨酸突变为侧链更长的氨基酸残基，可能引入新的作用力，从而被认为可能对ADH3的催化反应有促进作用，因此，基于ADH3与OTA复合体的结构信息，理性设计和分子改造，将活性区附近的第88位置的丝氨酸(Ser88，S)突变成侧链更长的天冬氨酸(Asp，E)或赖氨酸(Lys，K)，构建突变体蛋白ADH3-S88K和ADH3-S88E，以期提升其酶活性。

为了改造ADH3和提升ADH3对OTA的水解活性，以pET46EK-ADH3重组质粒做为模板，设计如表1所示的突变引物，以扩展获得含有ADH3-S88K和ADH3-S88E基因的重组载体pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K。

表1.PCR所用引物序列

突变体	引物序列(5’-->3’)
		ADH3-S88E_F	<![CDATA[CCTGGGT<u>GAG</u>CAGTCCTCTCCGCAGTC]]>
ADH3-S88E_R	<![CDATA[GGACTG<u>CTC</u>ACCCAGGTGAACGTGCAG]]>
		ADH3-S88K_F	<![CDATA[CCTGGGT<u>AAG</u>CAGTCCTCTCCGCAGTC]]>
ADH3-S88K_R	<![CDATA[GGACTG<u>CTT</u>ACCCAGGTGAACGTGCAG]]>

通过表2所示的聚合酶链式反应体系，构建含有突变体ADH3-S88E和ADH3-S88K的重组质粒pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K。

表2.PCR反应体系

反应体系	加样量(μL)
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	28
2xPrime STAR Max DNA聚合酶	20
		上、下游引物(10μmol/L)	1
模板DNA	1

接着分别把突变质粒pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K转入大肠杆菌感受态细胞中，由DNA测序确认突变基因。ADH3-S88E的核苷酸序列以及氨基酸序列如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示；ADH3-S88K的核苷酸序列以及氨基酸序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。以上所构建的突变株S88E，是指ADH3的第88位丝氨酸突变成天冬氨酸；另一个突变株S88K，是指ADH3的第88位丝氨酸突变成赖氨酸。将此两个突变基因命名为ADH3-S88E和ADH3-S88K。

实施例2：大肠杆菌中表达及纯化ADH3和突变体蛋白。

将构建好的上述重组质粒(pET46EK-ADH3、pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K)分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板中筛选菌株。吸取1.0mL种子菌液接种于新鲜的5mL LB内，37℃温度下，180r/min震荡培养培养过夜，再放大至200mL LB培养基中培养。最终放大到10L的LB培养基。在菌体的OD₆₀₀值到达0.6至0.8时，将培养温度降低至16℃后，加入IPTG的浓度至0.3mM以诱导蛋白的大量表达。再经过16h的蛋白质诱导后，将菌液以6000rpm离心10min收集大肠杆菌菌体。接着用缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5)将菌体重悬，并利用细胞破碎机进行破菌，再以16000rpm离心30min，并收集上清液用以下一步的纯化。

再用快速蛋白质液相层析仪依序利用镍离子层析柱洗脱目的蛋白，接着将目的蛋白透析在5L(20mM Tris-HCl,pH 7.5)中4℃透析过夜，再过一次离子柱纯化。最后将纯化的目的蛋白浓缩在20mM Tris-HCl,pH 7.5缓冲液中并保存于-80℃。图3为原核表达获得的纯化的重组酰胺水解酶(ADH3,ADH3-S88E,ADH3-S88K)的SDS-PAGE蛋白电泳。

实施例3：OTA水解活性测定:

为比对ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K活性的差异，本实施例进一步测定三种酶水解OTA的活力。

OTA水解酶的活性测试方法如下所述：每个反应的混合物(100μL)处于50mM Tris-HCl,pH 8.0的缓冲液中，包括底物200μg/mL OTA和10μL酶(10μg/mL)。混合后置于震荡金属浴40℃、800rpm反应10min，每个反应均做3个平行，并且重复3次反应。反应后加入等体积乙腈终止酶反应，然后用12000rpm离心10min，取上清反应液通过0.22μm滤膜进行过滤。接着各组反应通过高效液相色谱(HPLC,Shimadzu SPD-M20A)进行产物测定与分析，其分析柱为InertSustain C18 column(4.6×250mm,5μm)，流动相A：水，流动相B：95％乙腈+5％乙酸，流速1mL/min，检测波长330nm，洗脱时间20min，洗脱浓度为50％。ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K的高效液相色谱检测结果如图4所示，在保留时间4.4min和保留时间12.5min分别出峰。其中，保留时间4.4min的出峰时间与产物标准品OTα一致，因此，保留时间4.4min的物质为OTα；而保留时间12.5min的出峰时间则与底物标准品OTA一致，因此，保留时间12.5min的物质为OTA。接着通过比较ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K水解产物OTα的峰面积，来计算活性差异。

从图4数据显示，ADH3、ADH3-S88E和ADH3-S88K水解OTA的产物是OTα和苯丙氨酸，可以检测到OTα。因此，如图5在本发明中我们将ADH3的水解产物OTα的峰面积值当作100％，比较ADH3-S88E和ADH3-S88K水解产物OTα的峰面积，作为相对酶活。OTA降解活性测定结果如图5所示，在40℃反应10min，可以明显看到ADH3-S88E的活性为ADH3的3.7倍，ADH3-S88K的活性为ADH3的2.4倍。因此，在此发明中由结构分析与理性设计改造，显著地将ADH3改造成活性更高的OTA水解酶ADH3-S88E和ADH3-S88K，突变体蛋白ADH3-S88E和ADH3-S88K在OTA降解产业上具有更高的应用价值。

实施例4：重组酰胺水解酶在赭曲毒素A污染粮食中脱毒的应用

将赭曲毒素A标准储备液和粉碎好的小麦粉混合，制备赭曲毒素A污染的小麦粉(最终浓度为200μg赭曲毒素A/g小麦粉)，将重组质粒(pET46EK-ADH3、pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K)分别表达后破菌，收集上清液；取上清液与预制备好的赭曲毒素A污染小麦粉混合均匀，将配制好的样品在37℃条件下培养，于0min、5min、10min、15min、20min、25min和30min取样，每个降解实验设置3个重复。同时，以磷酸盐缓冲液与预制备好的赭曲毒素A污染小麦粉混合均匀混合作为阴性对照处理。处理组和空白对照组每次取样量相同，依据赭曲毒素A标准检测方法进行提取、净化和分析。按照ZL201910004498.1记载的毒素提取与纯化检测方法测量重组酰胺水解酶对赭曲毒素A的降解率，结果如图6所示，不加酶的阴性对照组中，赭曲毒素A在磷酸盐缓冲液中稳定，0-30min内，未降解；而重组酰胺水解酶ADH3-S88E和ADH3-S88K分别在15min和25min完全降解样品中的赭曲毒素A，降解效率达到100％；而ADH3在反应30min后，样品中还残留有80μg赭曲毒素A/g小麦粉，降解效率只有60％，说明ADH3-S88E和ADH3-S88K降解小麦粉样品中的赭曲毒素A的效率显著优于AHD3。

实施例5：重组酰胺水解酶在赭曲毒素A污染的茯砖茶中脱毒的应用

将赭曲毒素A标准储备液和粉碎好的茯砖茶粉混合，制备赭曲毒素A污染的茯砖茶粉样品(最终浓度为200μg赭曲毒素A/g茯砖茶粉)，将重组质粒(pET46EK-ADH3、pET46EK-ADH3-S88E和pET46EK-ADH3-S88K)分别表达后破菌，收集上清液；取上清液与预制备好的赭曲毒素A污染的茯砖茶粉混合均匀，将配制好的样品在37℃条件下培养，于0min、5min、10min、15min、20min、25min和30min取样，每个降解实验设置3个重复。同时，以磷酸盐缓冲液与预制备好的赭曲毒素A污染茯砖茶粉混合均匀混合作为阴性对照处理。处理组和空白对照组每次取样量相同，依据赭曲毒素A标准检测方法进行提取、净化和分析。按照ZL201910004498.1记载的赭曲毒素A提取与纯化检测方法测量重组酰胺水解酶对赭曲毒素的降解率，结果如图7所示，不加酶的阴性对照组，赭曲毒素A在磷酸盐缓冲液中稳定，0-30min内，未降解；而重组酰胺水解酶ADH3-S88E和ADH3-S88K分别在15min和25min完全降解样品中的赭曲毒素A，降解效率达到100％，降解效率达到100％；而ADH3在反应30min后，样品中还残留有90μg赭曲毒素A/g茯砖茶粉，降解效率只有55％，说明ADH3-S88E和ADH3-S88K降解茯苓砖茶中赭曲毒素A的效率显著优于AHD3。

利用SignalP预测寡养单胞菌酰胺酶ADH3的信号肽为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的前20个氨基酸，通过全基因合成的方法获得的去除信号肽序列的ADH3基因为：SEQ IDNO.1所示序列的第61～1284位所示的核苷酸序列。同样能利用限制性内切酶NcoI及XhoI将去除编码信号肽序列的ADH3基因连接到pET46EK载体上，构建重组质粒。接着将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，构建含有重组质粒的大肠杆菌工程菌，并表达和纯化能降解OTA的酰胺水解酶。上述SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示氨基酸序列的前20个氨基酸也是信号肽序列，去除后不影响重组酰胺水解酶的活性，上述SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的前60位碱基也去除，以便于基于剩余碱基序列构建的重组质粒仅表达重组酰胺水解酶。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种具有高活性的重组酰胺水解酶，其特征在于，所述酰胺水解酶的氨基酸序列为将SEQ ID NO.2所示的序列的第88位的丝氨酸突变为天冬氨酸的序列。

2.根据权利要求1所述的具有高活性的重组酰胺水解酶，其特征在于，所述酰胺水解酶的氨基酸序列含有权利要求1所述序列的第21～427位的氨基酸序列。

3.一种编码权利要求1所述的重组酰胺水解酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种编码权利要求2所述的重组酰胺水解酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列的第61～1284位所示的核苷酸序列。

5.一种具有高活性的重组酰胺水解酶，其特征在于，所述酰胺水解酶的氨基酸序列为将SEQ ID NO.2所示的序列的第88位的丝氨酸突变为赖氨酸的序列。

6.根据权利要求5所述的具有高活性的重组酰胺水解酶，其特征在于，所述酰胺水解酶的氨基酸序列含有权利要求5所述序列的第21～427位的氨基酸序列。

7.一种编码权利要求5所述的重组酰胺水解酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

8.一种编码权利要求6所述的重组酰胺水解酶的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示序列的第61～1284位所示的核苷酸序列。

9.一种携带权利要求3或4或7或8所述的重组酰胺水解酶基因构成的重组载体。

10.一种权利要求1或2或5或6所述的重组酰胺水解酶在降解赭曲毒素A中的应用。

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