CN116063408A - 口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

口蹄疫病毒a型elisa抗体检测试剂盒及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用；本发明通过确定口蹄疫A型病毒GH环表位多肽与口蹄疫O型非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题；但是缩减后对A型抗体的检测敏感性明显降低，进一步通过多聚抗原肽的形式展示多肽序列提高检测敏感性。最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及ELISA抗体检测试剂盒。本试剂盒对口蹄疫灭活疫苗免疫抗体和阴性血清检测总符合率较高达95％以上，但明显提高对口蹄疫合成肽疫苗免疫抗体的阳性检出率；可有效降低对口蹄疫病毒O型疫苗、猪口蹄疫病毒O型灭活疫苗免疫抗体的交叉反应。

Description

口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
口蹄疫病毒包括7种血清型，目前我国主要流行O型和A型，两类病毒结构蛋白氨基酸序列相似度高，因此开发口蹄疫病毒结构蛋白抗体检测试剂盒的最主要难点在于避免与不同血清型的抗体非特异反应，尤其目前我国在临床使用的口蹄疫A型疫苗均与O型疫苗构成多价疫苗，包括口蹄疫病毒OA二价灭活疫苗、口蹄疫病毒OA二价合成肽疫苗，这对试剂盒的检测特异性提出更高要求。
对现有专利文献进行检索发现，CN109485703A公开了一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用；CN106432434A公开了一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。该专利涉及口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列a(Tyr Asn GlyThr Thr Lys Tyr Ser Thr Gly Asn Ala Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Ser Leu AlaAla Arg Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala ILe Arg Ala)、序列b(Val Tyr Asn Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Arg Gly Asp Leu GlySer Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Tyr Gly Ala IleArg Ala)、序列c(Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Sera La Ser Gln Asn Arg ArgGly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe AsnPhe Gly Ala Ile Arg Ala)中一种或几种组成的混合多肽，以及多肽在制备检测感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体的试剂盒中的应用。
其缺点在于，在验证特异性反应时，并未验证对目前市场上正在使用的猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)免疫抗体交叉反应。事实上，所设计多肽与口蹄疫O型病毒对应位置(如口蹄疫O型病毒Re-O/MYA98/JSCZ/2013株对应GH环序列为ValTyrAsnGlyLysCysLysTyrAlaGlyGlySerLeuProAsnValArgGlyAspLeuGlnValLeuAla GlnLysAlaAlaArgProLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlaIleLysAla)存在完全一致的序列(如斜体部分序列)，尤其涉及N末端和C末端序列。而事实上本发明试验发现，该发明所选多肽序列a(对应本发明说明书表1PAF7204)、序列b(对应本发明说明书表1PWH0904)、序列c(对应本发明说明书表1PMM1304)的确能与猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗体非特异结合，在临床应用中将导致假阳性反应，阻碍临床评价疫苗真实免疫效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。本发明通过确定口蹄疫A型病毒GH环位置与猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型灭活疫苗抗体非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题。但是缩减后对A型抗体的检测敏感性明显降低，因此进一步通过多聚抗原肽的形式展示多肽提高检测敏感性。最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及ELISA抗体检测试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列1所示，序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K。
还提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列2所示，序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K。
还提供一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列3所示，序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
本发明还提供一种抗原包被板，所述包被板含有3条表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：
序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K；
序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K；
序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
本发明还提供一种抗原包被板的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、分别采用固相合成法合成所述表位多肽；
S2、将3种表位多肽混合，稀释后加入酶联反应板孔中进行包被、封闭、干燥处理，即得所述抗原包被板。
作为一个实施方案，步骤S1中，序列1的合成包括如下步骤：
1)合成得到全保护肽段1：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-OH(保护肽片段1)；
2)合成得到保护肽段2：
Fmoc-Ala-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-OH(保护肽片段2)；
3)合成得到保护肽段3：
H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段3)；
4)在保护肽段3的NMP溶液中，加入保护片段2/HOBt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护片段1/PyBOP/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列1肽树脂；
5)在序列1肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整多肽(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K的粗肽样品；纯化得到完整序列1多肽。
优先的，步骤1)包括：先合成肽树脂：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到全保护肽段。
所述合成肽树脂具体为：以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Pro-OH连接上树脂形成Fmoc-Pro-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(PIP)/NMP脱除Fmoc形成H-Pro-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤去除残余哌啶后，加入Fmoc-Ala-OH/PyBOP/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Ala-Pro-2-chlorotritylresin，NMP洗涤残余氨基酸后再脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin。
步骤1)中，所述肽树脂以1％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段。
优选的，步骤3)具体为：以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOBt/DIC为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHA resin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHA resin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成：
H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段3)。
优选的，步骤5)具体为：在全保护的序列1肽树脂中加TFA/TIS/DTT/H2O(90:5:2:3)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整多肽(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K的粗肽样品。
步骤5)中所述纯化为：将粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列1多肽。
作为一个实施方案，步骤S1中，序列2的合成包括如下步骤：
1)合成得到全保护肽段4：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-OH(保护肽片段4)；
2)合成保护肽段5：
Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Leu-Ala-OH(保护肽片段5)；
3)合成保护肽树脂片段3：
H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段3)；
4)在保护肽树脂片段3的NMP溶液中，加入保护片段5/HOAt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护片段4/TBTU/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列2肽树脂；
5)在序列2肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K的粗肽样品；纯化得到序列2多肽。
步骤1)具体为先合成肽树脂：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到全保护肽段1。
所述合成肽树脂具体为：以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Pro-OH连接上树脂形成Fmoc-Pro-2-chlorotrityl resin，洗涤、脱除Fmoc形成H-Pro-2-chlorotrityl resin；加入Fmoc-Ala-OH/HBTU/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin，洗涤、脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤、脱除Fmoc步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin。
所述肽树脂以1％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段4。
优选的，步骤3)具体为：以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOAt/EDC.HCl为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHAresin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHAresin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成所述保护肽树脂片段3。
优选的，步骤5)中，所述纯化为：将粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列2多肽。
优选的，步骤5)中，在序列2肽树脂中加TFA/TIS/EDT/H2O(90:5:3:2)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K的粗肽样品。
作为一个实施方案，步骤S1中，序列3的合成包括如下步骤：
1)合成全保护肽段6：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-OH(保护肽片段6)；
2)合成保护肽段7：
Fmoc-Asn(Trt)-Ala-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-OH(保护肽片段7)；
3)合成保护肽树脂片段8：
H-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ly s(H-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段8)；
4)在保护肽树脂片段8的NMP溶液中，加入保护片段7/HOBt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护片段6/HATU/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列3肽树脂；
5)在所述序列3肽树脂中脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，沉淀得到完整(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K的粗肽样品；纯化得到序列3多肽。
步骤1)中，先合成肽树脂：
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl resin；去除固相载体，得到所述全保护肽段6。
所述合成肽树脂具体为：
以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Gly-OH连接上树脂形成Fmoc-Gly-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(PIP)/NMP脱除Fmoc形成H-Gly-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤去除残余哌啶后，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH/PyBOP/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Thr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤残余氨基酸后再脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl resin。
所述肽树脂以三氟乙醇(TFE)/乙酸/二氯甲烷(DCM)(1:1:8)处理去除固相载体，得到所述全保护肽段6。
优选的，步骤3)具体为：以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOBt/DIC为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHA resin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHA resin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成所述保护肽树脂片段8。
优选的，步骤5)具体为：在全保护的序列3肽树脂中加TFA/TIS/DTT/H2O(90:5:4:1)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K的粗肽样品。
优选的，步骤5)中，所述纯化为将所述粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列3多肽。
作为一个实施方案，步骤S2中，序列1、序列2、序列3的表位多肽的混合质量比为1:1:1～1:3:3，或为1:1:1～3:1:3，或为1:1:1～3:3:1。优选3种表位多肽等量混合。
作为一个实施方案，步骤S2中，所述包被是在2～8℃下包被18～24小时。
作为一个实施方案，步骤S2中，所述包被液为0.1mol/L、pH值9.55～9.65的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，所述碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液含0.02％-0.08％DMSO和0.3％-1％Tween20。
本发明还提供一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含前述的抗原包被板。
作为一个实施方案，所述试剂盒还包括酶结合物、酶结合物稀释液、样品稀释液、显色液、终止液、25倍洗涤液。
本发明还提供一种前述抗原包被板在制备口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒中的用途。所述试剂盒用于检测口蹄疫A型抗体水平。进一步的，所述试剂盒用于检测口蹄疫A型病毒及疫苗作用后的动物血清中的A型抗体。在一些实施例中，所述试剂盒用于检测口蹄疫A型疫苗与O型疫苗多价使用后的动物血清中的A型抗体。
我国长期流行的口蹄疫病毒为O型，且危害最为严重，其中优势流行毒株是SEA拓扑型Mya-98毒株。2009年以来A型口蹄疫病毒开始在我国流行暴发，代表毒株包括A/Sea-97G1分支毒的A/HuBWH/CHA/2009株和A/Sea-97 G2分支毒的A/GDMM13/CHA/2013株，此时可同时防控A型和O型病毒的口蹄疫OA二价灭活疫苗和合成肽疫苗在疫情防控中发挥了关键作用，包括申联生物医药(上海)股份有限公司兰州分公司等的猪口蹄疫O型，A型二价灭活疫苗(Re/O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)、猪口蹄疫O型，A型二价合成肽疫苗(多肽2700+2800+MM13)等。其中灭活疫苗的抗原为人工培养的、经化学灭活的病毒，而合成肽疫苗的抗原包含有O型MYA-98毒株等代表毒株和A型A/GDMM13/CHA/2013株的关键中和表位GH环序列，该疫苗可产生极高浓度针对GH环的中和抗体，因此可同时高效预防O型和A型口蹄疫病毒感染。根据2022年国家动物疫病免疫技术指南规定，需采用GB/T 18935-2018《口蹄疫诊断技术》规定的方法进行口蹄疫疫苗抗体日常检测。其中使用灭活疫苗免疫的，采用液相阻断ELISA、固相竞争ELISA检测免疫抗体；使用合成肽疫苗免疫的，采用VP1结构蛋白ELISA检测免疫抗体。但因O型病毒和A型病毒结构蛋白氨基酸序列相似度高达75％以上，而位于结构蛋白上的GH环的氨基酸序列也高度相似，尤其是N末端和C末端存在完全一致的序列，因此在极高浓度特异抗体存在时，避免非特异检出O型抗体成为A型VP1结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒开发最主要难点。
设计多肽作为抗原进行ELISA抗体检测，可能有效降低非特异性反应，但是多肽抗原直接应用于ELISA抗体检测的难点在于，多肽上各氨基酸残基易以各种不可预测的作用力随机结合到96孔酶联反应板表面，包括亲水力、疏水力、范德华力或者离子键等，这导致多肽趴在板孔表面而不能在溶液中充分展示，不利于与抗体结合，导致诊断敏感性降低(如专利CN102998460B背景所述)。
多聚抗原肽通过在赖氨酸的α氨基和ε氨基上分别进行氨基和羧基缩合反应形成含多个多肽的树枝状肽分子，以期望达到展示多肽的目的。但随着所含多肽数目增多、多肽所含氨基酸残基数目增多，肽链之间以及肽链与基质树脂之间相互纠缠，将限制多肽与抗体之间的相互作用，因此目前所报道的用于诊断目的的多聚抗原肽所含氨基酸残基数目普遍不超过25个(根据文献DOI 10.1007/s13337-013-0162-z)，用于诊断用途的超长多聚抗原肽(比如本发明中的多肽包含linker有35个氨基酸残基)的制备和应用是行业难点。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过确定口蹄疫A型病毒GH环表位多肽与口蹄疫O型合成肽疫苗抗体和口蹄疫O型灭活疫苗抗体非特异结合的序列，通过序列缩减有效解决非特异结合问题；但是缩减后的多肽(含32个氨基酸残基)对A型抗体的检测敏感性明显降低，进一步通过优化的固相合成法制备了超长多聚抗原肽(每分支肽含有35个氨基酸残基)，并通过优化多肽包被液的组分制备了包含该超长多聚抗原肽的抗原包被板，明显提高抗体检测敏感性，为首次成功制备超长多聚抗原肽和应用于抗体检测。
2)本发明最终确定多肽表位组合、含多肽表位组合的抗原包被板以及ELISA抗体检测试剂盒；与商品化液相阻断试剂盒及竞争型试剂盒相比，本试剂盒对口蹄疫灭活疫苗免疫抗体和阴性血清检测总符合率较高达95％以上，但明显提高对口蹄疫合成肽疫苗免疫抗体的阳性检出率；
3)与商品化猪口蹄疫A型VP1结构蛋白ELISA抗体检测试剂盒相比，本试剂盒可有效降低对口蹄疫病毒O型疫苗(猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)、猪口蹄疫病毒O型灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株))免疫抗体的交叉反应；
4)本发明的试剂盒有利于口蹄疫A型疫苗尤其A型合成肽疫苗免疫效果真实临床监测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、多肽抗原的设计、制备和筛选
口蹄疫合成肽疫苗设计时选择关键中和B细胞表位GH环(氨基酸129-171)，结合国内口蹄疫A型病毒主要流行毒株(A/GDMM/2013毒株)和疫苗毒株(Re-A/WH/09毒株和AF72毒株)，从NCBI下载对应毒株序列的GH环对应氨基酸序列，设计各候选抗原多肽(见表1)。
表1候选表位多肽
Figure BDA0004103810640000091
Figure BDA0004103810640000101
各多肽采用Fmoc固相合成法合成，合成顺序从C端向N端。其中多聚抗原肽，因多肽较长含35个氨基酸残基，按常规线性合成方法无法获得完整长链，多肽合成反应至第16位残基L时反应终止导致无法制备完整抗原。本发明经多次优化摸索后，采用分段合成方式解决该问题。具体地，将PWH09-5分成3个片段(VYNGTSKYSAP、ATRRGDLGSLA和(ARLAAQLPASGSS)2K)合成，三条多肽分别单独合成以解决第16位L残基直接无法合成问题，首先将ARLAAQLPASGSS同时连接到Lys的N端氨基和侧链氨基上构成二元分支肽(ARLAAQLPASGSS)2K，之后再将多肽ATRRGDLGSLA和VYNGTSKYSAP依次拼接到(ARLAAQLPASGSS)2K的N末端制备获得完整多肽PWH09-5。同样将PMM13-2按同理分成3个片段(VYSGTSKYSAP、QNRRGDSGPLA和(ARLAAQLPASGSS)2K)合成，首先将ARLAAQLPASGSS同时连接到Lys的N端氨基和侧链氨基上构成二元分支肽(ARLAAQLPASGSS)2K，再将多肽QNRRGDSGPLA和VYSGTSKYSAP依次拼接到(ARLAAQLPASGSS)2K的N末端制备获得完整多肽PMM13-2。同样将PAF72-2按同理分成3个片段(VYNGTTKYSTG、NAGRRGDLGSLA和(ARVAAQLPASGSS)2K)，首先将ARVAAQLPASGSS同时连接到Lys的N端氨基和侧链氨基上构成二元分支肽(ARVAAQLPASGSS)2K，再将多肽NAGRRGDLGSLA和VYNGTTKYSTG依次拼接到(ARVAAQLPASGSS)2K的N末端制备获得完整多肽PAF72-2。
具体的，序列1的合成包括如下步骤：
1)以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Pro-OH连接上树脂形成Fmoc-Pro-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(PIP)/NMP脱除Fmoc形成H-Pro-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤去除残余哌啶后，加入Fmoc-Ala-OH/PyBOP/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤残余氨基酸后再脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrit ylresin。
2)上述肽树脂以1％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)处理去除固相载体，得到全保护肽段Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-OH(保护肽片段1)。
3)同样以步骤1、2的方法得到保护肽段Fmoc-Ala-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-OH(保护肽片段2)。
4)以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOBt/DIC为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHA resin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHA resin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段3)。
5)在保护肽树脂片段3的NMP溶液中，加入保护性片段2/HOBt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护性片段1/PyBOP/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列1肽树脂。
6)在全保护的序列1肽树脂中加TFA/TIS/DTT/H2O(90:5:2:3)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整多肽(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K的粗肽样品。
7)将步骤6粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列1多肽。
序列2的合成包括如下步骤：
1)以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Pro-OH连接上树脂形成Fmoc-Pro-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(PIP)/NMP脱除Fmoc形成H-Pro-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤去除残余哌啶后，加入Fmoc-Ala-OH/HBTU/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤残余氨基酸后再脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-2-chlorotrityl resin。
2)上述肽树脂以1％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)处理去除固相载体，得到全保护肽段Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Pro-OH(保护肽片段4)。
3)同样以步骤1、2的方法得到保护肽段Fmoc-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Leu-Ala-OH(保护肽片段5)。
4)以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOAt/EDC.HCl为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHA resin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHA resin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Leu-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHAresin(保护肽树脂片段3)。
5)在保护肽树脂片段3的NMP溶液中，加入保护性片段5/HOAt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护性片段4/TBTU/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列2肽树脂。
6)在全保护的序列2肽树脂中加TFA/TIS/EDT/H2O(90:5:3:2)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K；的粗肽样品。
7)将步骤6粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列2多肽。
序列3的合成包括如下步骤：
1)以2-chlorotrityl resin为固相载体，二异丙基乙基胺(DIPEA)为催化剂，将Fmoc-Gly-OH连接上树脂形成Fmoc-Gly-2-chlorotrityl resin，再以25％哌啶(PIP)/NMP脱除Fmoc形成H-Gly-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤去除残余哌啶后，加入Fmoc-Thr(tBu)-OH/PyBOP/DIPEA活化氨基酸偶联形成Fmoc-Thr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl resin，NMP洗涤残余氨基酸后再脱除Fmoc，循环偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH，最终形成Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-2-chlorotrityl resin。
2)上述肽树脂以三氟乙醇(TFE)/乙酸/二氯甲烷(DCM)(1:1:8)处理去除固相载体，得到全保护肽段Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Asn(Trt)-Gly-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-OH(保护肽片段6)。
3)同样以步骤1、2的方法得到保护肽段Fmoc-Asn(Trt)-Ala-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Leu-Gly-Ser(tBu)-Leu-Ala-OH(保护肽片段7)。
4)以Rink amide MBHA resin为固相载体，加入Fmoc-Lys(Fmoc)-OH/HOBt/DIC为活化氨基酸偶联形成Fmoc-Lys(Fmoc)-Rink amide MBHA resin，NMP洗涤后加入25％PIP/NMP脱除Fmoc，得到H-Lys(ε-NH2)-Rink amide MBHA resin,NMP洗涤残余哌啶，按照肽段序列偶联、洗涤、脱除Fmoc及洗涤步骤，最终形成H-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(H-Ala-Arg(Pbf)-Val-Ala-Ala-Gln(Trt)-Leu-Pro-Ala-Ser(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Ser(tBu)-)-Rink amide MBHA resin(保护肽树脂片段8)。
5)在保护肽树脂片段8的NMP溶液中，加入保护性片段7/HOBt/DIC的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，NMP洗涤后再加入保护性片段6/HATU/DIPEA的活化片段进行偶联反应，反应完全后(Kaiser test阴性),以哌啶脱除肽树脂上的Fmoc，得到全保护的序列3肽树脂。
6)在全保护的序列3肽树脂中加TFA/TIS/DTT/H2O(90:5:4:1)脱除固相载体及氨基酸侧链保护基团，以叔丁基甲醚(MTBE)沉淀得到完整(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K的粗肽样品。
7)将步骤6粗肽样品溶解于纯水中，经高压液相(HPLC)-C18层析柱纯化得到最终纯度大于85％以上的完整序列3多肽。
进一步通过检测口蹄疫A型病毒Re-A/WH/09灭活疫苗免疫猪血清(编号SA1)、口蹄疫A型病毒A/GDMM13/CHA/2013灭活疫苗免疫猪血清(编号SA2)、口蹄疫A型病毒AF72灭活疫苗免疫猪血清(编号SA3)、猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)免疫猪血清(编号SO)、口蹄疫抗体猪阴性血清(编号SN)筛选最优多肽，最优多肽应具有高灵敏度高特异性。
本研究发现采用文献(DOI:10.1016/s0022-1759(01)00444-6)所述的包被液碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.4)包被多聚抗原肽，其检测能力甚至弱于包被单肽PWH0903的检测效果(结果见表2)，可能因为超长多聚抗原肽因含多条长肽，直接使用不可避免会发生多个多肽链之间相互交缠而达不到使多肽充分展示到溶液的目的。因此对多肽包被液组分进行优化，经多条件筛选获得优选包被液碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH值9.55～9.65，含0.02％-0.08％DMSO和0.3％-1％Tween20)。如表2所示，用本发明的包被溶液制备成的抗原包被板可明显提高对样本SA1的检测数值，表明该超长多聚抗原肽需要特定的包被和展示条件实现既定用途。
在本发明的一个案例中多肽包被方法为将多肽用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1mol/L，pH值9.55～9.65，含0.03％DMSO和0.5％TWEEN20)稀释成1μg/ml，向96孔酶联反应板各孔中加入100μl，在2～8℃包被18～24小时，取出，弃去各孔中的抗原包被液。配制3％BSA(90g BSA溶于3L PBS缓冲液中)，加入已包被的酶联反应板各孔中，每孔250μl，室温封闭60分钟，弃去封闭液。用常规间接ELISA方法的溶液组分，及本步骤制备的抗原包被板，按照常规间接ELISA方法检测待测血清样品SA1、SA2、SA3、SO和SN，每样品重复测试3次并计算得均值，根据检测样品SO的OD450nm值初步考察是否会非特异检出口蹄疫O型合成肽疫苗抗体，根据检测样品SA1、SA2、SA3的OD450nm值初步考察灵敏度，结果见表2～4。
根据表2，针对该毒株相对完整GH环表位多肽PWH09和PWH0904检测样品SA1数值分别为1.212和1.112，表明两多肽均能有效结合样品SA1中抗体，但检测样品SO的OD450nm值高达0.828，提示相对完整的GH环表位多肽对O型合成肽疫苗抗体存在明显交叉反应。进一步的，对抗原N末端序列部分截短优化后不降低交叉反应(见PWH09-2)，但对抗原C末端序列部分截短优化后则明显降低交叉反应(见PWH09-3)，检测样品SO的OD450nm值小于0.3，但同时也观察到该抗原检测灵敏度明显下降，检测样本SA1的OD450nm值降低到0.754，与完整多肽相比降幅达到37.8％。本研究显示，将PWH09-3构建成二元多聚抗原肽PWH09-4、含有linker的二分支聚合肽PWH09-5和四分支聚合肽PWH09-6，均可明显提高检测灵敏度，检测样本SA1的OD450nm值依次提高到2.112、2.714、3.122。上述结果表明PWH09-3已包含抗体检测用足够的多肽序列，但直接应用时多肽结合到包被板底部不利于与抗体结合，而通过构建成二分支或者四分支多聚抗原肽可提高抗体结合能力，具体机制尚不清楚，可能与有利于多肽在溶液中展示，增加与抗体在溶液中结合的几率有关，而增加柔性linker可进一步增强该作用，此外四分支多聚抗原肽优于二元多聚抗原肽。多聚抗原肽使用赖氨酸核心进行构建，通过在赖氨酸的α氨基和ε氨基上分别进行氨基和羧基缩合反应形成含多个多肽的树枝状肽分子，该反应复杂，涉及多条肽链之间以及肽链与基质树脂之间高精度相互作用，且随着增加多肽数目越多，合成难度越大。在实际制备中，四分支多聚抗原肽PWH09-6合成产率仅为45.7％-50.2％，纯度仅为31.2％-44.7％，而两分支多聚抗原肽PWH09-5合成产率可达到76.8％-85.1％，纯度达到75.4％-83.7％，因此从控制工艺成本的角度，选择PWH09-5作为针对该毒株的最优多肽，其含有两条针对A型口蹄疫病毒Re-A/WH/09株优选多肽，两条多肽通过C末端的GSS linker分别与赖氨酸的α氨基和ε氨基连接，形成两分支多聚抗原肽。
根据表3，针对该毒株相对完整的GH环表位多肽PMM13和PMM1304检测样品SA2数值分别为0.545和0.536，表明两多肽均能有效结合样品SA2中抗体，但同时检测样本SO的OD450nm值分别高达0.405和0.401，提示相对完整的GH环表位多肽也对O型合成肽疫苗抗体存在明显交叉反应。而对应优化成二元分支聚合肽PMM13-2，检测样品SA2的OD450nm值可提高到1.855，且具有最高的信噪比S/N值达到22.622，而检测样品SO无交叉反应。因此选择PMM13-2作为针对该毒株最优多肽。
根据表4，针对该毒株相对完整的GH环表位多肽PAF72和PAF7204检测样品SA3数值分别为0.885和0.755，表明两多肽均能有效结合样品SA3中抗体，但同时检测样本SO的OD450nm值分别高达0.438和0.512，提示针对相对完整的GH环表位多肽也对O型合成肽疫苗抗体存在明显交叉反应。而对应优化成二元分支聚合肽PAF72-2，检测样品SA3的OD450nm值可提高到2.157，且具有最高的信噪比S/N值达到22.237，而检测样品SO无交叉反应。因此选择PAF72-2作为针对该毒株的最优多肽。
表2针对A型口蹄疫病毒Re-A/WH/09株不同候选多肽抗体检测效果比较
Figure BDA0004103810640000151
Figure BDA0004103810640000161
表3针对A型口蹄疫病毒A/GDMM/2013株不同候选多肽抗体检测效果比较
Figure BDA0004103810640000171
表4针对A型口蹄疫病毒AF72株不同候选多肽抗体检测效果比较
Figure BDA0004103810640000172
进一步验证多肽组合是否存在相互干扰，以及能否实现对不同毒株抗体广谱检测效果。将候选多肽进行组合后对各血清检测，结果见表5。PWH09-5、PMM13-2、PAF72-2单独使用，仅能检测对应毒株疫苗免疫的抗体，而对其他毒株疫苗的抗体交叉性较弱，这与GH环高度变异的特征相符，也表明单肽应用存在局限。将三肽组合后使用，对各代表性A型口蹄疫疫苗免疫抗体均能较好检测，OD450nm数值与对应单肽的检测结果相近，且不检测O型口蹄疫疫苗免疫血清。
表5多肽组合对口蹄疫抗体检测效果
Figure BDA0004103810640000181
实施例2、ELISA抗体检测试剂盒制备及组装
具体制备过程：
(1)多肽抗原制备
多肽抗原的合成采用Fmoc固相合成法合成。将合成步骤输入多肽合成仪，由机器自动完成。将合成肽在冻干机中冷冻真空干燥3日，形成冻干品。合成肽冻干品称重，分装于棕色瓶内密封保存，贴签。-20℃以下保存。用高效液相色谱分析法测定，主峰应含色谱整合区的80％以上，即多肽纯度80％以上。
(2)抗原包被板的制备
将3种多肽抗原等量混合，用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.1mol/L，pH值9.6，含0.05％DMSO和0.5％ TWEEN20)稀释成1μg/ml，向96孔酶联反应板各孔中加入0.1ml，在2～8℃下包被18～24小时，取出，弃去孔中的抗原包被液。用封闭液注入已包被的酶联反应板各孔内，每孔0.33ml，在室温下封闭30分钟，弃去封闭液。将包被板放在真空干燥机中，室温干燥30分钟。干燥后，立即将每块板与2g干燥剂一起放入一个铝箔袋内，高温密封。抗原包被板2～8℃保存。
(3)ELISA抗体检测试剂盒的制备
试剂盒的组分包括抗原包被板、酶结合物、酶结合物稀释液、样品稀释液、显色液、终止液、25倍洗涤液等。各主要成分参考《中华人民共和国兽药典》2020版或行业的通用方法优化及制备。其中一个方案如下：
抗原包被板：按本实施例步骤(2)方法制备。1块或2块含有上述抗原的96孔酶联反应板。
阳性对照血清：以猪口蹄疫病毒OA灭活疫苗作为免疫原，免疫无特定病源体猪制备的高免血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。1瓶(0.5ml)。
阴性对照血清：用无口蹄疫抗体的正常猪血清，加入1000U/ml链霉素和1000U/ml青霉素，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。1管(1.5ml)。
酶结合物：辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG多克隆抗体，1瓶(0.3ml)。
样品稀释液：含有3％(g/ml)BSA的0.15M、pH为7.4的PBS缓冲液，过0.45μm滤膜。1瓶(30ml或45ml)。
酶结合物稀释液：每30L无菌纯化水含无水磷酸二氢钠60g、二水磷酸氢二钠4g、氯化钠50g、庆大霉素6g和酪蛋白10g，pH值7.2，0.45μm滤膜过滤。1瓶(20ml或30ml)。
TMB底物工作液：为单组分四甲基联苯胺(TMB)显色液。1瓶(15ml或25ml)。
25倍洗涤液：0.25M，含有20％～30％(ml/ml)Tween-20和2.5％(ml/ml)ProClin300的磷酸盐缓冲液，pH为7.4，后经过0.2μm滤膜除菌。1瓶(50ml)。
终止液：2mol/L的硫酸溶液。1瓶(15ml或25ml)。
将各试剂盒各主要组份和其他辅助组份包括样品稀释板、说明书、一次性封板膜、定位标签，按下表6组装成试剂盒：
表6 ELISA试剂盒组成
Figure BDA0004103810640000191
Figure BDA0004103810640000201
实施例3、临床应用效果评价
分别用本试剂盒、文献报道(猪口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫抗体水平检测的试剂盒选择及评估)的商品化口蹄疫病毒A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒和商品化口蹄疫病毒A型抗体ELISA试剂盒(固相阻断ELISA法)分别检测368份猪血清，比较符合率。368份猪血清由本单位从猪场采集并保存，包括口蹄疫疫苗免疫前采集猪阴性血清292份，猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株+Re-A/WH/09株)免疫28天血清66份，猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗(多肽2700+2800+MM13)免疫28天血清14份，所有血清背景按世界动物卫生组织(OIE)要求的病毒中和试验滴定。各试剂盒检测判定结果见表7。用口蹄疫A型抗体固相阻断ELISA试剂盒检测猪阴性血清和猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗免疫血清，共检出阳性60份，检出阴性298份，与本试剂盒总符合率95.5％。用口蹄疫病毒A型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒检测猪阴性血清和猪口蹄疫O型、A型二价灭活疫苗免疫血清，检出阳性64份，检出阴性294份，与本试剂盒总符合率98.8％。对猪口蹄疫O型、A型二价合成肽疫苗免疫血清，两商品化试剂盒检测阳性率分别为42.9％和57.1％，但用本试剂盒抗体阳性率达到92.9％，表明疫苗整体免疫效果较好，采用口蹄疫病毒VP1结构蛋白多肽的本试剂盒能更好地体现疫苗抗体水平。
表7试剂盒临床检测结果
Figure BDA0004103810640000211
实施例4、特异性分析
目前我国口蹄疫A型疫苗全部为与O型疫苗多价使用，包括口蹄疫OA二价合成肽疫苗、口蹄疫OA二价灭活疫苗，而口蹄疫O型A型病毒的结构蛋白氨基酸序列相似度较高，如O/MYA98/JSCZ/2013株和A/WH/09株VP1氨基酸序列相似度达到73.83％，VP2-VP4序列相似度更是达到85％以上，这对口蹄疫抗体检测试剂盒的检测特异性提出极高要求，而解决特异性也是口蹄疫病毒VP1结构蛋白多肽ELISA抗体检测试剂盒开发最大的难点之一。
用本试剂盒和文献公开的(猪口蹄疫病毒合成肽疫苗免疫抗体水平检测的试剂盒选择及评估)商品化猪口蹄疫A型病毒VP1结构蛋白ELISA诊断试剂盒对60份特异性质控血清进行检验。60份特异性质控血清由本单位制备标定及保存，由易发生交叉反应的口蹄疫病毒O型疫苗免疫抗体血清及常见猪病抗体血清组成，包括猪口蹄疫病毒O型灭活疫苗(Re-O/MYA98/JSCZ/2013株)免疫抗体阳性血清20份、猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2600+2700+2800)免疫抗体阳性血清20份、猪口蹄疫阴性血清10份、猪细小病毒灭活疫苗免疫抗体阳性血清2份、猪瘟活疫苗免疫抗体阳性血清2份、猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗免疫抗体阳性血清2份、猪伪狂犬病毒活疫苗免疫抗体阳性血清2份、猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫抗体阳性血清2份。检测结果见表8，两试剂盒检测其他常见猪病抗体和猪阴性血清均为阴性表明一般特异性较好；但商品化试剂盒检测O型灭活苗抗体和O型合成肽苗抗体各检出3份和5份阳性，表明存在一定比例的交叉反应；而本试剂盒对上述血清检测结果均为阴性，表明本试剂盒可有效降低对O型疫苗免疫抗体的交叉反应，更有利于临床中对口蹄疫A型疫苗真实免疫效果监测。
表8试剂盒特异性分析
Figure BDA0004103810640000221
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (10)

1.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列1所示，序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K。
2.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列2所示，序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K。
3.一条口蹄疫病毒A型表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如序列3所示，序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
4.一种抗原包被板，所述包被板含有3条表位多肽，所述多肽的氨基酸序列如下：
序列1：(VYNGTSKYSAPATRRGDLGSLAARLAAQLPASGSS)2K；
序列2：(VYSGTSKYSAPQNRRGDSGPLAARLAAQLPASGSS)2K；
序列3：(VYNGTTKYSTGNAGRRGDLGSLAARVAAQLPASGSS)2K。
5.一种根据权利要求4所述的抗原包被板的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、分别采用固相合成法合成所述表位多肽；
S2、将3种表位多肽混合，稀释后加入酶联反应板孔中进行包被、封闭、干燥处理，即得所述抗原包被板。
6.根据权利要求5所述的抗原包被板的制备方法，其特征在于，步骤S2中，序列1、序列2、序列3的表位多肽的混合质量比为1:1:1～1:3:3，或为1:1:1～3:1:3，或为1:1:1～3:3:1。
7.根据权利要求5所述的抗原包被板的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述包被液为0.1mol/L、pH值9.55～9.65的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，所述碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液含0.02％-0.08％DMSO和0.3％-1％Tween20。
8.一种口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1所述的抗原包被板。
9.根据权利要求8所述的口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶结合物、酶结合物稀释液、样品稀释液、显色液、终止液、25倍洗涤液。
10.一种如权利要求4所述的抗原包被板在制备口蹄疫病毒A型ELISA抗体检测试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒用于检测口蹄疫A型抗体水平。
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