CN116059324A - 一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于冻干粉技术领域，具体涉及一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂、其制备方法及应用。所述血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备原料包括血红蛋白氧载体和保护剂溶液，所述保护剂溶液中含有无水葡萄糖和精氨酸盐酸盐。本发明的有益效果为：本发明提供的血红蛋白氧载体冻干粉针剂，冻干后外型平整，可快速复溶，复溶后不溶微粒少，不易被氧化，且胶体渗透压可调节以适配不同生物体血清胶体渗透压，具有产品安全性高、应用范围广、使用方便、易于保存和运输等优点，可应用于战伤、手术、车祸等造成失血过多时的输血治疗。

Description

一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于冻干粉技术领域，具体涉及一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂、其制备方法及应用。

背景技术

血红蛋白氧载体基于修饰方法的不同，主要包括聚合血红蛋白、基因调控的血红蛋白以及聚乙二醇化的血红蛋白等。血红蛋白氧载体作为人工血液代用品，用于临床输血治疗。作用机理主要是其在体内可携带并释放氧气，及时输送氧气至缺血缺氧部位，以消除对组织器官(尤其是脑组织)造成的损伤，避免因失血休克导致的死亡。

血红蛋白氧载体为液体制剂，相比固体制剂重量重，不利于运输，为获得稳定且易于运输的血红蛋白类氧载体，最常用的方法是采用真空冷冻干燥将其制成冻干粉针剂。

现有的血红蛋白氧载体冻干粉针剂在使用中存在以下问题：(1)复溶时间长；(2)复溶后有较多不溶微粒，不溶微粒对人体危害较大，例如较大微粒可造成局部循环障碍，引起血管栓塞，微粒过多，可造成局部堵塞和供血不足及组织缺氧而产生水肿和静脉炎，此外微粒还可以引起过敏反应，热原样反应，降低产品安全性；(3)复溶后胶体渗透压与生物体的血清的胶体渗透压不匹配；(4)氧合血红蛋白被氧化成高铁血红蛋白，从而丧失了载氧的功能；(5)冻干后的外形不够平整，有裂痕，出现塌陷、表面萎缩、变硬变色等，表明制剂的多孔网状结构被破坏，影响复溶能力。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的上述问题，提供一种配方成分简单，冻干后外型平整，可快速复溶，复溶后不溶微粒少，胶体渗透压可调，不易被氧化的血红蛋白氧载体冻干粉针剂及其制备方法。

为实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其制备原料包括血红蛋白氧载体和保护剂溶液，所述保护剂溶液中含有无水葡萄糖和精氨酸盐酸盐。葡萄糖分子中具有多个自由羟基，这些自由羟基可以与蛋白质形成氢键以取代水，保证蛋白质的稳定性；在溶液中自由羟基易与水分子结合，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的晶核细小，从而起到保护作用。精氨酸盐酸盐能在一定程度上阻止由于干燥引起的乳酸脱氢酶活性丧失。

优选的，所述血红蛋白氧载体为聚合血红蛋白。血红蛋白结构不稳定，可引起严重副作用，不能直接用作红细胞代用品。聚合血红蛋白结构稳定。

优选的，所述保护剂溶液中，无水葡萄糖的终浓度为2-5％W/V、精氨酸盐酸盐的终浓度为2-4％W/V。该浓度比例下，冻干后复溶时间短、不溶微粒少、可有效抑制高铁血红蛋白形成。

优选的，所述保护剂溶液中还含有以下浓度的各组分：6.70-6.75g/L氯化钠、0.28-0.33g/L氯化钾、0.18-0.23g/L氯化钙、1.90-2.40g/L乙酰半胱氨酸、2.80-3.30g/L乳酸钠，溶剂为注射用水。

优选的，所述血红蛋白氧载体的质量与保护剂溶液的体积比为6-13g:1dL。

本发明所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备方法，包括如下步骤：先将保护剂溶液通过膜包换液方式与血红蛋白氧载体溶合，然后依次进行过滤除菌、冷冻干燥，即得所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂。

优选的，所述膜包为30KD膜包。

优选的，采用0.22μm滤膜进行过滤除菌。

优选的，所述冷冻干燥的条件为：-80℃预冻2h以上，直至完全冻结，冷阱-80℃，真空度低于0.3mbar，干燥时间10-27h，所得样品中残余水分低于3％。1、-80℃预冻2h以上可以保证样品完全冻结，防止在冻干过程中融化导致冻干失败。2、冷阱的作用是冷凝吸附气体，-80℃的低温，使水蒸气从升华表面到冷凝表面的压力差较大，间接促进水蒸气从干燥箱向捕水器流动，增加冻干效率。3、0.3mbar高真空使内外形成较大的蒸汽压力，促进水蒸气从产品逸出。综上，在该冻干条件下，冻干粉状态良好，易复溶，水分含量低于3％。

本发明所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂可用于制备人工血液代用品。

本发明的有益效果为：

本发明提供的血红蛋白氧载体冻干粉针剂，冻干后外型平整，可快速复溶，复溶后不溶微粒少，不易被氧化，且胶体渗透压可调节以适配不同生物体血清胶体渗透压，具有产品安全性高、应用范围广、使用方便、易于保存和运输等优点，可应用于战伤、手术、车祸等造成失血过多时的输血治疗。

附图说明

图1：表1中各样品胶体渗透压对比；

图2：表1中各样品冻干状态对比；

图3：表1中各样品复溶时间对比；

图4：表1中各样品10μm不溶微粒个数；

图5：表1中各样品25μm不溶微粒个数；

图6：表2中各样品胶体渗透压对比；

图7：表2中各样品复溶时间对比；

图8：表2中各样品10μm不溶微粒个数；

图9：表2中各样品25μm不溶微粒个数；

图10：表3中各样品胶体渗透压对比；

图11：表3中各样品10μm不溶微粒个数；

图12：表3中各样品冻干前后蛋白浓度；

图13：表3中各样品冻干前后metHBOCs浓度。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

试剂：氯化钠、氯化钾、氯化钙、乙酰半胱氨酸、乳酸钠、注射用水、血红蛋白氧载体(本公司自制)、D(+)-无水葡萄糖、L-精氨酸盐酸盐，以上试剂均为辅料级。

仪器：30KD膜包、冷冻干燥机(LABCONCO 794801340)、血气分析仪(RADIOMETERABL90 FLEX)、不溶性微粒仪(Backman、HIAC9703+)、胶体渗透压仪(gonotec OSMOMAT050)、一次性无菌过滤器(0.22μm)、无菌无热源西林瓶及无菌无热源胶塞、手套箱等。

聚合血红蛋白：润方生物OXP系列产品，是以新鲜牛全血为原料，通过蛋白提取和纯化技术获得超高纯度的牛血红蛋白，然后采用戊二醛聚合技术制备而成的具有携氧、释氧和扩容功效的戊二醛聚合牛血红蛋白，平均分子量约200KD。

按以下方法制备各实施例组和对比例组样品：

(1)配制基础溶液：6.73g/L氯化钠、0.3g/L氯化钾、0.205g/L氯化钙、2.09g/L乙酰半胱氨酸、3.07g/L乳酸钠，溶剂为注射用水；

(2)配制保护剂溶液：按表1-3各项下比例称取各添加组分并溶解于基础溶液中，得保护剂溶液；

(3)先将保护剂溶液通过膜包换液方式进入血红蛋白氧载体中，换液至聚合血红蛋白浓度为6.0g/dL，然后采用0.22μm滤膜过滤除菌，之后分装到西林瓶中，-80℃预冻2h，直至完全冻结，冷阱-80℃，真空度低于0.3mbar，干燥时间10h，所得样品中残余水分低于3％，得血红蛋白氧载体冻干粉针剂。

表1

从表1可以看出，1)各组分加入后胶体渗透压均有不同程度的增加，其中谷氨酸钠和聚葡萄糖变化较为明显；2)冻干后外型全部平整无裂痕的有4％L-精氨酸盐酸盐和5％D(+)-无水葡萄糖两组，其次为2％L-精氨酸盐酸盐和3％蔗糖，其余均出现不同程度裂痕；3)各组分的加入可以不同程度缩短复溶时间，其中4％L-精氨酸盐酸和5％D(+)-无水葡萄糖复溶时间最短，其次为3％乳糖，再次为2％L-精氨酸盐酸盐和4％谷氨酸钠；4)10μm不溶微粒个数较低的分别为4％L-精氨酸盐酸、4％脯氨酸、2％L-精氨酸盐酸盐、5％蔗糖、D(+)-无水葡糖糖组；5)25μm不溶微粒除葡聚糖组较高以外，其余均较低。

结论：通过综合比较冻干后外型、复溶时间、不溶微粒个数以及胶体渗透压，其中L-精氨酸盐酸盐、D(+)-无水葡萄糖，作为添加剂组分，其外型较为平整，复溶时间较短。葡聚糖和谷氨酸钠有明显调节胶体渗透压的功能，但是其复溶时间较长且不溶微粒数较高。

表2

从表2可以看出，1)谷氨酸钠和葡聚糖的加入组，胶体渗透压普遍较高，超出公司产品标准(10-25mmHg)，其中，L-精氨酸盐酸盐和D(+)-无水葡萄糖组合较为适宜；2)组合添加剂的复溶时间，较单独使用一种添加剂组分，有明显提高，绝大部分在1min内完全复溶，其中，谷氨酸钠和葡聚糖各自加入L-精氨酸盐酸或D(+)-无水葡萄糖后由之前单独使用的5-15min降到1-1.5min；3)不溶微粒方面，各组分的加入均低于空白对照组，其中最低的组合为L-精氨酸酸盐和D(+)-无水葡萄糖组。

结论：通过综合比较，L-精氨酸盐酸盐和D(+)-无水葡萄糖的组合可在明显降低复溶时间的同时、具有较少不溶微粒个数。

表3

从表3可以看出，1)冻干后复溶时间结果显示均在1min内完全溶解、且外型平整、颜色鲜红；2)不同配比组合可适配于不同物种需求、例如序号为2、11、3、7的四种组合适配与大鼠(健康大鼠血清胶体渗透压为14-16)；3)不溶微粒数整体较低，远远低于药典要求(10μm小于6000个/mL、25μm小于600个/mL)，其中较低的为3％L-精氨酸盐酸+3％D(+)-无水葡萄糖组，其次为3％L-精氨酸盐酸+4％D(+)-无水葡萄糖组，25μm不溶微粒数所有组合几乎为0个；4)冻干前后蛋白浓度几乎没有变化；5)冻干后高铁血红蛋白(metHb)均有不同程度下降，平均减少58.2％。

结论：1)组合后的冻干外型绝大部分平整无裂痕；2)冻干后颜色鲜红，复溶时间均在1min内完全溶解成透明均一溶液，metHb均有明显降低,平均降低58.2％；3)不溶微粒数均低于对照组，且远低于药典要求；4)冻干前后蛋白浓度没有明显变化。

综合上述试验结果可以得出：

1、L-精氨酸盐酸盐、无水葡萄糖成分比例不同，其胶体渗透压不同，可根据不同物种需求做出相应调节。

2、复溶时间间接反应溶解度大小，加入L-精氨酸盐酸盐、无水葡萄糖后，可以提高血红蛋白氧载体冻干粉针剂的复溶速度，得到透明均一的溶液。

3、冻干粉颜色可以反应高铁血红蛋白(metHBOCs)的变化，高铁血红蛋白为红褐色，当高铁血红蛋白含量上升时，冻干粉颜色加深；L-精氨酸盐酸盐、无水葡萄糖的加入可以有效抑制冻干过程中metHb的形成，避免血红蛋白携氧能力下降。

4、各实施例组较对比例组的不溶微粒数量显著减少，说明L-精氨酸盐酸盐、无水葡萄糖的加入可有效减少不溶微粒的个数，提高产品的安全性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其特征在于，其制备原料包括血红蛋白氧载体和保护剂溶液，所述保护剂溶液中含有无水葡萄糖和精氨酸盐酸盐。

2.根据权利要求1所述血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其特征在于，所述血红蛋白氧载体为聚合血红蛋白。

3.根据权利要求1所述血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其特征在于，所述保护剂溶液中，无水葡萄糖的终浓度为2-5％W/V、精氨酸盐酸盐的终浓度为2-4％W/V。

4.根据权利要求3所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其特征在于，所述保护剂溶液中还含有以下浓度的各组分：

6.70-6.75g/L氯化钠、0.28-0.33g/L氯化钾、0.18-0.23g/L氯化钙、1.90-2.40g/L乙酰半胱氨酸、2.80-3.30g/L乳酸钠，溶剂为注射用水。

5.根据权利要求1所述血红蛋白氧载体冻干粉针剂，其特征在于，所述血红蛋白氧载体的质量与保护剂溶液的体积比为6-13g:1dL。

6.权利要求1-5之一所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

先将保护剂溶液通过膜包换液方式与血红蛋白氧载体溶合，然后依次进行过滤除菌、冷冻干燥，即得所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂。

7.根据权利要求6所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，所述膜包为30KD膜包。

8.根据权利要求6所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，采用0.22μm滤膜进行过滤除菌。

9.根据权利要求6所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件为：-80℃预冻2h以上，直至完全冻结，冷阱-80℃，真空度低于0.3mbar，干燥时间10-27h，所得样品中残余水分低于3％。

10.权利要求1-5之一所述的血红蛋白氧载体冻干粉针剂在制备人工血液代用品中的应用。

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