CN116058361A - 粘性生物样本液化保存组合产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物样本处理技术领域，具体而言，涉及一种粘性生物样本处理组合产品。该组合产品包含液化组分和保存组分：所述液化组分包括愈创甘油醚和强碱；所述保存组分为包括以下组分的组合物：a)缓冲组分，用于中和所述强碱使保存体系的pH为6～8；b)渗透压调节组分；c)海藻糖、甘露醇以及甘油中的至少一种。本发明能够快速将粘性生物样本进行液化，使样本的粘稠度下降，使得后续操作易于进行，还可以在室温下即可进行，对操作条件要求不苛刻，不影响后续核酸检测，可兼容免提取扩增体系，对液化后的生物样本能够进行长期有效保存。

Description

粘性生物样本液化保存组合产品

技术领域

本发明涉及生物样本处理技术领域，具体而言，涉及一种粘性生物样本处理组合产品，特别涉及一种粘性生物样本液化保存组合产品。

背景技术

随着荧光定量PCR以及多重PCR等技术在病原体检测领域的快速发展，通过痰液样本类型检测是否感染相应的病原体种类的需求日益增加。然而痰液样本具有粘度大、蛋白多、成分复杂的特点，包含粘蛋白和其他多种蛋白(如免疫蛋白)、多种酶类、脱落细胞、微生物及其他吸入杂质等，不便于直接检测，临床上痰液样本的检测需要先对痰液进行液化处理。

常见的痰液液化方法为氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60℃～80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。DTT(二硫苏糖醇)法是目前最常用的痰液液化方法，利用含巯基(-SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等固定细胞。该方法耗时长，且使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且DTT稳定性差，需要在低温条件下保存，同时DTT存在一定的毒性，不适合临床上大批量处理痰液样本。此外，由于痰液样本粘度大，常规液化处理过程中易产生混合不均的问题。痰液样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。然而在临床检测中，往往不能及时处理和检测痰液样本中的核酸，因此发明一种能够快速充分液化痰液同时有效保护样本核酸的方法十分必要。

目前已公开的关于痰液液化及核酸保护的发明较多。然而，这些方法普遍存在成分复杂、成本高、操作复杂、样本混匀及液化不充分等问题，且液化后的样本如何进行有效保存，也是本领域的一个需要解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种粘性生物样本液化保存组合产品，其包括液化组分和保存组分：

所述液化组分包括愈创甘油醚和强碱；

所述保存组分包括以下组分：

a)缓冲组分，用于中和所述强碱使保存体系的pH为6～8；

b)渗透压调节组分；和

c)海藻糖、甘露醇以及甘油中的至少一种。

本发明的再一目的在于提供一种试剂盒，其包括如上所述的组合产品。

本发明的再一目的在于提供一种粘性生物样本液化保存方法，包括如下步骤：

i)将粘性生物样本与如上所述的液化组分混合得到第一混合物；

ii)孵育所述第一混合物得到第二混合物；

iii)将所述第二混合物与如上所述的保存组分混合。

本发明的再一目的在于提供一种粘性生物样本中核酸的释放方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法将所述粘性生物样本液化并保存；

使用核酸释放剂释放所述粘性生物样本中的核酸。

本发明的再一目的在于提供一种粘性生物样本中核酸的提取方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

使用核酸提取剂提取释放的核酸。

本发明的再一目的在于提供一种粘性生物样本中核酸的扩增方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

使用核酸扩增剂扩增核酸。

本发明的再一目的在于提供一种粘性生物样本中核酸的检测方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

任选地使用核酸扩增剂扩增核酸；

使用核酸检测剂检测核酸。

本发明能够快速将粘性生物样本进行液化，使样本的粘稠度下降，使得后续操作易于进行，且在室温下即可进行，对操作条件要求不苛刻，对后续核酸检测不产生不利影响，对液化后的生物样本能够进行长期有效保存。

本发明提供的粘性生物样本液化保存组合产品还具有较好的兼容性，对后续核酸检测无不利影响，因此，能够兼容免提取扩增体系，可以在无需核酸纯化操作的情况下直接进行后续的核酸扩增、检测等操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中各组对人基因组快速检测所得扩增曲线；A为实验组；B为蛋白酶法；C为氢氧化钠法；D为DTT法；E为乙酰半胱氨酸法；

图2为本发明一个实施例中各组对呼吸道合胞病毒检测所得扩增曲线；A为实验组；B为蛋白酶法；C为氢氧化钠法；D为DTT法；E为乙酰半胱氨酸法；

图3为本发明一个实施例中对免提取扩增体系(引入扩增提取的核酸未纯化)的影响验证；A为1号样本基质影响测试扩增曲线结果；B为2号样本基质影响测试扩增曲线结果；

图4为本发明一个实施例中试剂液化后的样本稳定性测试结果；A为实验组RNA稳定性曲线；B为实验组DNA稳定性曲线；C为对照组RNA稳定性曲线；D为对照组DNA稳定性曲线；

图5为本发明一个实施例中经过保存后对呼吸道病毒的检测结果；A为1号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；B为1号样本，采用商业保存液进行保存；C为2号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；D为2号样本，采用商业保存液进行保存；

图6为本发明一个实施例中经过保存后对淋球菌的检测结果；A为1号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；B为1号样本，采用商业保存液进行保存；C为2号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；D为2号样本，采用商业保存液进行保存；

图7为本发明一个实施例中经过保存后对细胞样本的检测结果；A为1号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；B为1号样本，采用商业保存液进行保存；C为2号样本，采用本申请所提供的示例保存组分进行保存；D为2号样本，采用商业保存液进行保存。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上大于等于2。比如，“一种或多种”从数量上≥1，可以为一种、两种、三种或更多种。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”、“为佳”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。

本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。

本发明中，“任选地”如无特别定义，可以为无，也可以任意选择。

本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，术语“室温”一般指4℃～35℃，较佳地指20℃±5℃。在本发明的一些实施例中，室温是指20℃～30℃。

本发明中，“第一混合物”、“第二混合物”等中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分性的描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。

本发明中，m/v表示质量体积比，％(m/v)表示在一定体积的混合体系中所含有的质量百分数。比如物质A在混合体系中的浓度为5％(m/v)表示每100毫升混合体系中含有5克物质A。

本发明中，涉及液化组分中各组分的浓度或用量，如无特别定义，均指在液化组分中的终浓度或终用量，相当于在液化组分构成液化试剂中的终浓度或终用量。

本发明中，涉及保存组分中各组分的浓度或用量，如无特别定义，均指在保存组分中的终浓度或终用量，相当于在保存组分构成的保存剂中的终浓度或终用量。比如提供无机阳离子的组分。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。

本发明的一个方面涉及一种粘性生物样本液化保存组合产品，其包括液化组分和保存组分：

所述液化组分包括愈创甘油醚和强碱；

所述保存组分包括以下组分：

a)缓冲组分，用于中和所述强碱使保存体系的pH为6～8；

b)渗透压调节组分；和

c)海藻糖、甘露醇以及甘油中的至少一种。

在本发明中，“组合产品”意味着其中的组分并非均是混合在一起的，其中的一个或多个组分可以是分别独立包装的。

在一些实施方式中，一个独立的包装中包括愈创甘油醚和强碱两种组分。

在一些实施方式中，所述液化组分对应一个独立的包装。

在一些实施方式中，所述保存组分对应一个独立的包装。

在一些实施方式中，所述缓冲组分对应一个独立的包装。

在一些实施方式中，所述渗透压调节组分对应一个独立的包装。

在本发明中，术语“生物样本”、“样本”等是指动物样本；可以来自动物(优选至少包括哺乳动物，例如灵长类动物，包括人)的组织或器官、组织裂解液；细胞(在受试者体内、直接取自受试者、或保持在培养物中的或来自培养细胞系的细胞)、细胞裂解物(或裂解物部分)或细胞提取物；含有一种或多种衍生自细胞、细胞材料或病毒材料(例如多肽或核酸)的分子的溶液；或含有天然或非天然存在的核酸的溶液，其被或可以如本文所述进行测定。在一些实施方式中，样本中含有核酸。样本也可以是含有一种或多种细胞、细胞组分或核酸的任何体液或排泄物，包括但不限于细胞、核或无细胞核酸。特别地，本发明的生物样本优选来自体液，体液包括来自动物的液体、半固体、充气液体、液体-气体混合物等。此类体液可包括但不限于唾液、痰液、血清、血浆、血液、尿液、粘液、汗液、眼泪或其他眼部液体、耳部液体、脸(例如，来自水疱或疮)、胃液或胃汁、粪便液、胰液或汁、精液、哺乳或测定产物、脊髓液、液体骨髓或淋巴液。

“粘性生物样本”是指具有粘性的生物样本，特别是具有粘性的体液。粘性可源自于生物样本中存在大量的黏蛋白和多糖(特别是粘多糖)或者蛋白聚糖等成分。一种优选的粘性生物样本为痰液或宫颈粘液。一些粘性生物样本的举例为鼻咽拭子、口腔拭子、灌洗液等。“黏蛋白”是指任何提高分泌细胞周围细胞质基质粘度的粘性蛋白。“痰液”是指包含在哺乳动物的鼻腔或口腔中，或从其中排出的粘性物质(通常是从呼吸道中排出)。

本发明中，“液化试剂”与“液化剂”具有相同含义，可以互换使用，作为一个独立的体系，是由液化组分构成的混合物。“液化组分”中的不同组分可以是独立的试剂，也可以是非独立的成分。

本发明中，“保存剂”指的是一个独立的体系，是由保存组分构成的混合物。“保存组分”中的不同组分可以是独立的试剂，也可以是非独立的成分。

所述液化组分，是用于降解粘性生物样本中的粘性物质，使样本粘度下降，便于对其中的核酸成分进行后续操作。

所述保存组分，是为了使经液化的样本得以稳定保存，便于临床在灵活的时间进行后续操作。本发明中，“保存体系”，如无特别限定，指的是由保存组分和待保存物形成的混合体系。

所述液化组分和所述保存组分原则上应当分开包装，先使用液化组分在碱性条件下处理粘性生物样本，经液化降低粘度，再利用保存组分中的缓冲组分下调经液化的样本的pH值，使稳定在pH6～pH8，保存组分中的各组分相互协同，能够对经液化的样本进行长期保存，有效避免核酸降解，待进行后续操作。

在使用液化试剂处理粘性生物样本时，是需要在水性环境中的，因此需要提供溶剂，且优选水性溶剂。不过，应当理解的是，溶剂可以在进行处理操作时再额外提供，因此，对于液化组分来说，溶剂是可选的。在一些实施方式中，所述液化组分优选还包括水性溶剂，该水性溶剂进一步优选为水或缓冲溶液。

所述液化组分中的愈创甘油醚和强碱进行混合后，根据情况选择是否添加其它组分(比如水性溶剂、吸附剂、刚性微颗粒等中一种或多种)，可以得到液化试剂，用来对粘性生物样本进行液化。

液化组分中的愈创甘油醚相对于传统的液化试剂，具有优异的液化效果。如本发明实施例1所示。还如专利申请CN2021109014550中所记载。

在一些实施方式中，所述愈创甘油醚的浓度为1mmol/L～1mol/L。本文中，关于愈创甘油醚的浓度，如无特别限定，指的是在液化试剂中浓度。

在本发明的一些实施方式中，在液化组分中，所述愈创甘油醚的浓度为20mmol/L～500mmol/L。

在本发明的一些实施方式中，所述愈创甘油醚的浓度范围举例包括但不限限于：20mmol/L～400mmol/L、50mmol/L～200mmol/L、50mmol/L～150mmol/L等。

在本发明的一些实施方式中，所述愈创甘油醚的浓度举例包括但不限限于：20mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、180mmol/L、200mmol/L、220mmol/L、240mmol/L、250mmol/L、260mmol/L、280mmol/L、300mmol/L、320mmol/L、340mmol/L、350mmol/L、360mmol/L、380mmol/L、400mmol/L、420mmol/L、450mmol/L、500mmol/L等。

液化组分中，采用强碱提供强碱环境，用于提供pH≥10的强碱环境。只要能够提供充分液化的pH条件，只要不对后续的PCR产生不利影响，则对强碱的种类没有特别限定。

在本发明中，术语“强碱”是指在水溶液中电离出的阴离子全部是氢氧根离子的物质。其可以是有机强碱或无机强碱，包括但不限于氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铷、氢氧化钫、氢氧化铯、氢氧化钙、胆碱、氢氧化银、氢氧化亚铊、季铵碱、氢氧化锶、氢氧化钡、氢氧化镭、氢氧化二氨合银等中的至少一种。在一些优选的实施方式中，所述强碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾。

在本发明的一些实施方式中，液化组分中所述强碱为一元碱，其浓度为5mmol/L～500mmol/L。此处，关于强碱的浓度，如无特别限定，指在液化试剂中浓度。所述强碱的浓度范围的举例包括但不限于5mmol/L～400mmol/L、5mmol/L～200mmol/L、5mmol/L～100mmol/L、5mmol/L～80mmol/L、5mmol/L～60mmol/L、5mmol/L～50mmol/L、5mmol/L～40mmol/L、10mmol/L～200mmol/L、10mmol/L～100mmol/L、10mmol/L～50mmol/L、10mmol/L～40mmol/L等。浓度的举例包括但不限于5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L、300mmol/L、350mmol/L、400mmol/L、450mmol/L、500mmol/L、等。该实施方式中的技术特征可以通过合适的方式组合于其它的实施方式中。

在本发明的一些实施方式中，所述液化组分中的所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化钡、胆碱中至少一种。

在本发明的一些实施方式中，液化组分中所述强碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾。进一步地，所述强碱的浓度为5mmol/L～500mmol/L。浓度范围的举例及具体浓度的举例可参见上述一元碱的举例部分，可通过合适的方式形成组合特征。

在一些实施方式中，液化组分中的愈创甘油醚和强碱以组合物形式提供(共同包装于一个容器)。进一步地，愈创甘油醚在液化试剂中的浓度优选1mmol/L～1mol/L，强碱在液化试剂中的浓度优选5mmol/L～500mmol/L(进一步优选氢氧化钠)。所述愈创甘油醚和所述强碱的浓度，均可以选自本文中记载的浓度或浓度范围的示例，两者之间的浓度可以通过合适的方式进行组合，以实现较好的液化效果为佳。

在一些优选的实施例中，所述液化组分制备的液化试剂包含100mmol/L愈创甘油醚和10mmol/L氢氧化钠。

所述液化组分中，可选地包括溶剂；当包括溶剂时，所述溶剂优选为水性溶剂。

在一些优选的实施例中，液化组分由愈创甘油醚和、强碱、溶剂(进一步优选为水性溶剂)组成。

如本文使用的术语“水性溶剂”为包含水的溶剂或溶液，可以为纯水组成的单一溶剂，也可以为水与其它溶剂混溶形成的混合溶剂。能够与水混溶的溶剂，包括但不限于：醇类溶剂(举例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、聚乙二醇等)等。所述水性溶剂中还允许包含盐成分。

在本发明的一些实施方式中，所述水性溶剂为水。例如蒸馏水、纯化水、过滤水、去离子水等；优选为无核酸水，更优选无核酸酶的水。

在本发明的一些实施方式中，所述水性溶剂由缓冲组分提供。

如本文使用的术语“缓冲组分”，在本文中也称为“缓冲溶液”，指水溶液或组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类液体的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH6～pH8，又例如pH≥10。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and useof buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。液化组分中包括缓冲组分时，该缓冲组分旨在将液化体系的pH维持在强碱环境，比如pH≥10。

本文中的缓冲组分的成分可以独立包装于一个或多个容器。当其成分独立包装于一个容器中时，可以作为预制的缓冲试剂。

所述液化组分可选地包括吸附剂，也即，所述吸附剂为可选组分，非必需。

在一些实施方式中，所述液化组分还包括吸附剂。

如本文所用的“吸附剂”可以通过物理或化学作用吸附杂质，减少杂质对后续检测的干扰。所述吸附剂在不对液化产生不利影响的原则下，可以任意选择合适的类型。用于吸附杂质的化学作用包括但不限于螯合作用。所述吸附剂可以为树脂或螯合物，也可为螯合树脂。在一些实施方式中，所述吸附剂为树脂。在一些优选的实施方式中，所述吸附剂为聚丙乙烯类、聚丙烯酸类、聚乙烯醇类、壳聚糖类等树脂，进一步优选为螯合树脂。在一些实施例中，所述吸附剂为Chelex树脂。在一些实施方式中，所述吸附剂在液化试剂中的浓度为1％～15％(w/v)，例如0.5％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。

所述液化组分还可选地包括刚性微颗粒。也即，刚性微颗粒为可选组分。

在一些实施方式中，所述液化组分还包括刚性微颗粒，可起到加速混匀的作用。

在一些实施方式中，所述刚性微颗粒对应一个独立的包装。

刚性微颗粒的材质可以是任意的硬质材料，所述“刚性”指其在混合/辅助混合粘性生物样本的时候通常不发生明显破损，且不释放干扰后续流程(如核酸的保存、释放、富集、扩增、检测中的至少一个流程)的成分。其材质包括但不限于金属(可以为单质或合金)或金属氧化物、陶瓷、玻璃、硬质塑料、天然或人工的矿物成分等。在一些优选的实施方式中，所述刚性微颗粒的材质包括氧化锆、氮化硅、陶粒、硬质不锈钢、硬质碳化钨、烧结刚玉和玛瑙中的至少一种。

刚性微颗粒可用于辅助混匀粘性生物样本和所述粘性生物样本液化组合物，减少处理时间，增加处理效率。

在本发明中，术语“微颗粒”可以为球体、近球体、椭球体、柱状、棒状、多面体(举例如立方体)或不规则形状，优选为微球。微颗粒的平均粒径优选为毫米级，例如0.01mm～500mm，也可以为0.05mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、100mm、200mm、300mm、400mm、500mm等，进一步优选为0.01mm～10mm。

在本发明的一些实施方式中，所述刚性微颗粒的用量为0.1g/mL～2g/mL(如无特别限定，指在液化组分中的终用量)。用量的举例包括但不限于0.1g/mL、0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL、0.6g/mL、0.7g/mL、0.8g/mL、0.9g/mL、1.0g/mL、1.1g/mL、1.2g/mL、1.3g/mL、1.4g/mL、1.5g/mL、1.6g/mL、1.7g/mL、1.8g/mL、1.9g/mL、2.0g/mL等。

在一些实施例方式中，液化组分包括愈创甘油醚、强碱和刚性微颗粒。在一些优选的实施方式中，液化组分中的愈创甘油醚、强碱和刚性微颗粒以包含三者的混合体系提供(共同包装于一个容器)，还优选包括溶剂，该溶剂进一步优选为水性溶剂，更优选为水或缓冲溶液。其中，愈创甘油醚的含量优选1mmol/L～1mol/L，强碱的含量优选5mmol/L～500mmol/L(进一步优选氢氧化钠)，刚性微颗粒的含量优选0.1g/mL～2g/mL(进一步优选氧化锆珠)。

在一些优选的实施例中，液化组分中包括100mM愈创甘油醚、10mM强碱(独立地优选氢氧化钠)和1g/mL刚性微颗粒(独立地优选氧化锆珠)。

在一些优选的实施例中，液化组分由愈创甘油醚和、强碱、刚性微颗粒和水性溶剂组成。

在一些实施方式中，由液化组分构成的液化试剂包括(终浓度)：100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠和1g/mL刚性微颗粒(优选为氧化锆珠)，溶剂为水。

所述液化组分中的各组分可以分开包装，也可以合并包装。

在一些实施方式中，所述液化组分为组合物，包装于一个容器中。在一些实施方式中，一个包装容器中含有所述液化组分中的愈创甘油醚和强碱，还有一个包装容器中含有刚性微颗粒。在一些实施方式中，愈创甘油醚、强碱、刚性微颗粒分别独立包装。在本发明中，组合物可以是固体(优选干粉状固体)或者液体，或者介于二者之间的状态例如凝胶态。在一些实施方式中，所述组合物为溶液。溶液的溶剂可以为水，例如蒸馏水、纯化水、过滤水、去离子水等；优选为无核酸水，更优选无核酸酶的水。

保存组分

所述保存组分中的各组分可以混合后得到独立的保存剂，用于保存粘性生物样本或者经过处理的粘性生物样本。

在本发明的一些实施方式中，所述保存剂由以下组分配制而成：

a)缓冲组分，用于中和所述强碱使保存体系的pH为6～8；

b)渗透压调节组分；和

c)海藻糖、甘露醇以及甘油中的至少一种。

保存组分中的缓冲组分，其定义与液化组分的中的缓冲组分一致，都起到维持特定pH的作用。应当理解，缓冲组分在保存组分、液化组分中的定义是各自独立的。保存组分中的缓冲组分是为了中和碱，当样本经液化组分处理，再与保存组分混合后，混合体系的pH大致为中性即可，举例如pH6～pH8、pH7±0.2等。对于保存组分中的缓冲组分，缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备，也可以选自弱酸和/或其盐。可以使用的缓冲组分优选选自a)柠檬酸、醋酸、磷酸、酒石酸、苹果酸、碳酸、巴比妥酸中的至少一种，或者b)a的酸根，或者c)a的酸式酸根(通常带有一个或两个氢离子，例如磷酸氢根、磷酸二氢根)，或者选自a)、b)、c)所组成的组中的一种或多种成分。在本发明的一些实施方式中，缓冲组分在保存组分中的浓度可以为：1mmol/L～5mmol/L的柠檬酸，也可以选择1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L等示例的具体浓度。

保存组分中的渗透压调节组分用于稳定待保藏生物成分(例如细胞或病毒)的渗透压。渗透压调节组分通常包括无机阳离子(特别是盐离子，优选Na⁺以及K⁺)和/或甜菜碱。在一个具体的实施方式中，渗透压调节组分包括0.1％～1.2％(m/v)氯化钠和0.1％～1.2％(m/v)氯化钾。在一个具体的实施方式中，甜菜碱0.1％～10％(m/v)。所述渗透压调节组分的浓度，如无特别限定，指的是在保存组分中的终浓度。

在一些实施方式中，所述保存组分还包括一种或多种氨基酸。氨基酸可以为左旋或者右旋手性的氨基酸；可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸；氨基酸的举例包括但不限于：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、硒半胱氨酸和吡咯赖氨酸等。一些优选的实施例中，氨基酸在保存组分中的总浓度优选为1mol/L～3mol/L，例如1mol/L、1.4mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.2mol/L、2.5mol/L、3mol/L等。

在一些实施方式中，保存组分中的组分c)包括0.8mol/L～1mol/L甘氨酸和0.6mol/L～1mol/L异亮氨酸，以在保存组分中的终浓度计。

在一些实施方式中，所述海藻糖在所述保存组分中的浓度为0.5mol/L～1mol/L，例如0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L等。

在一些实施方式中，所述甘露醇在所述保存组分中的浓度为1.5％～4.5％(m/v)，也可以为1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％等。

在一些实施方式中，所述甘油在所述保存组分中的浓度为2％～10％(v/v)，也可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。

在一些实施方式中，所述保存组分中还含有尿素。尿素的浓度可以为1％～3％(m/v)，例如1％、1.5％、2％、2.5％、3％(m/v)等，以在保存组分中的终浓度计。

在一些实施方式中，所述保存组分包括(终浓度)：1mmol/L～5mmol/L柠檬酸、0.1％～1.2％(w/v)氯化钠、0.1％～1.2％(w/v)氯化钾、0.8mol/L～1mol/L甘氨酸、0.6mol/L～1mol/L异亮氨酸、0.5mol/L～1mol/L海藻糖、1.5％～4.5％(w/v)甘露醇以及2％～10％(v/v)甘油。

在一些实施方式中，所述保存组分以单一混合体系提供，可以通过向缓冲组分中添加其它组分配制。在其中的一些实施方式中，渗透压调节组分优选0.1％～1.2％(w/v)氯化钠，更优选1％(w/v)，所述保存组分中的组分c)优选0.5mol/L～1mol/L海藻糖，进一步优选1M。

本发明的另一个方面还涉及试剂盒，其含有如上所述的组合产品。

如无特别考虑，液化组分中的各组分可以分开提供于不同的包装容器，也可以合并提供于同一个包装容器，保存组分中的各组分也可以分开提供于不同的包装容器或合并提供。合并提供时，可以为液态，也可以为固态或半固态。所述液态包括但不限于溶液、乳液、悬浊液等形态。所述半固态的举例包括不限于凝胶态等。

在一些实施方式中，所述液化组分中的各组分构成一体化的组合状态。

在一些实施方式中，所述保存组分中的各组分构成一体化的组合状态。

在一些实施方式中，所述液化组分中的各组分，有的组分与其它组分以组合状态存在，有的组分独立存在。

在一些实施方式中，刚性微颗粒独立存在。

在一些实施方式中，液化组分中的缓冲组分独立存在。

在一些实施方式中，保存组分中的缓冲组分独立存在。

在一些实施方式中，液化组分和保存组分中的缓冲组分由相同组分种类的缓冲试剂提供。进一步地，所含成分的含量也相同。

在一些实施方式中，所述保存组分中的各组分，有的组分与其它组分以组分状态存在，有的组分独立存在。在一些优选的实施方式中，组分a)、组分b)和组分c)分别独立存在。在一些优选的实施方式中，组分b)和组分a)以组合状态存在，且组分c)也和组分a)以组合方式存在。

在一些实施方式中，所述试剂盒还含有用于核酸的释放剂、提取剂、扩增剂以及检测剂中的任意一种或多种。

在一些实施方式中，所述核酸包括DNA和/或RNA，其形式是多样的，可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多聚核苷酸的形式。也可以是双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA。在一些具体的实施方式中，核酸可以是基因、cDNA分子、mRNA、tRNA、rRNA、非编码RNA分子等，以及上述核酸形式的片段例如寡核苷酸。

根据本发明的再一方面，还涉及一种粘性生物样本液化保存方法，包括如下步骤：

i)将粘性生物样本与如上所述的液化组分混合得到第一混合物；

ii)孵育所述第一混合物得到第二混合物；

iii)将所述第二混合物与如上所述的保存组分混合。

上述步骤ii)即是为了实现液化，降低样本粘度。

进行步骤iii)时，可以将保存组分一并加入，也可以将不同的保存组分分开加入。

进行液化时的体系pH优选为碱性，并且该碱性优选足以提供pH≥10的强碱环境。

在一些实施方式中，愈创甘油醚和强碱可以分开包装，此时，可以根据粘性生物样本的特点灵活控制强碱的添加量，从而灵活控制液化体系的pH值，以更好地适应不同样本间的差异化特性。

在一些实施方式中，所述第一混合物的pH值≥10，例如pH10、pH11、pH11.5、pH12、pH12.5、pH13、pH13.5、pH14、pH14.5、pH15，优选pH12～pH14。调节所述第一混合物的pH值，可以控制所述ii)步进行孵育时的pH值。

同样地，在一些实施方式中，愈创甘油醚的含量也可以灵活控制，便于对微量样本的液化过程进行更精准的控制。在一些实施方式中，所述愈创甘油醚在所述第一混合物中的浓度(也即愈创甘油醚的工作浓度)为1mmol/L～1mol/L，例如5mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L、110mmol/L、120mmol/L、130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L或900mmol/L。

本发明的液化保存方法中，在进行液化时，无需苛刻的温度条件，比如，在常温即可操作。

在一些实施方式中，所述孵育的温度为18℃～35℃。孵育温度的举例包括但不限于：18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃等。

在进行液化时，孵育时间可以根据样本量、样本特性等因素进行合理控制，在合理的时间内实现充分的液化。

在一些实施方式中，从临床操作性角度而言，5min～30min相对较佳。

在一些实施方式中，所述孵育的时间≥5min。孵育时间的举例包括但不限于5min、6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min、30min或更久。

关于所述保存组分与所述第二混合物的用量，将经液化的样本的pH值被调节到温和范围内(比如pH6～pH8)，便于核酸物质的稳定保存即可。

在一些实施方式中，所述保存组分与所述第二混合物的体积比为1：(2～4)，也可以选择1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4等。

步骤i)中的混合方式没有特别限定，只要是样本充分接触液化组分，能够顺利进行液化即可。

步骤iii)中的混合方式也没有特别限定，只要能顺利调节体系pH值至预定范围即可，并与渗透压调节组分等组分充分接触，能够发挥对核酸物质的保护作用即可。

在一些实施方式中，步骤i)以搅拌或震荡的方式混合。

在一些实施方式中，所述粘性生物样本包括痰液或宫颈粘液。

根据本发明的再一方面，还涉及一种粘性生物样本中核酸的释放方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法将所述粘性生物样本液化并保存；

使用核酸释放剂释放所述粘性生物样本中的核酸。

术语“核酸的释放”是指核酸从样片中释放出来并处于可提取/富集/纯化/检测的状态。核酸的释放通常伴随着细胞的裂解以及，杂质成分如蛋白、脂质、多糖等组分与核酸组分在物理状态上的分离，与生理状态下不同，它们之间可以通过简单的离心等方法分离，且核酸可以被某些检测试剂直接检测到。

根据本发明的再一方面，还涉及一种粘性生物样本中核酸的提取方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

使用核酸提取剂提取释放的核酸。

术语“核酸的提取”是指将释放的核酸与杂质分离过程，常常伴随核酸组分的纯化。例如离心，磁珠富集，化学试剂处理导致的样品成分分层等。

根据本发明的再一方面，还涉及一种粘性生物样本中核酸的扩增方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

使用核酸扩增剂扩增核酸。

术语“扩增(ampIifying或amplification)”在“核酸”此用语的上下文中共同出现时，指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的部分，通常从少量的多核苷酸开始(例如，少至单个多核苷酸分子)，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增包括多种化学和酶促方法。在聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)或连接酶链反应(LCR)过程中从一个或几个拷贝的靶DNA或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录RT-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外，在转录过程期间从单一DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。

根据本发明的再一方面，还涉及一种粘性生物样本中核酸的检测方法，包括如下步骤：

使用如上所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

任选地使用核酸扩增剂扩增核酸；

使用核酸检测剂检测核酸。

核酸的检测方法可以依赖或不依赖核酸的扩增。如本文所用，术语“核酸的检测方法”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法，包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法、结构特异性裂解测定(例如，INVADER测定，(Hologic,Inc.)并且描述于例如美国专利号5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；Lyamichev等人,Nat.Biotech.,17:292(1999),Hall等人,PNAS,USA,97:8272(2000),以及US 2009/0253142，其各自出于所有目的全文以引用的方式并入本文)；酶错配裂解方法(例如，Variagenics，美国专利号6,110,684、5,958,692、5,851,770，其全文以引用的方式并入本文)；以上所述的聚合酶链反应(PCR)；分支杂交方法(例如，Chiron，美国专利号5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其全文以引用的方式并入本文)；滚环式复制(例如，美国专利号6,210,884、6,183,960和6,235,502，其全文以引用的方式并入本文)；NASBA(例如，美国专利号5,409,818，其全文以引用的方式并入本文)；分子信标技术(例如，美国专利号6,150,097，其全文以引用的方式并入本文)；E-传感器技术(Motorola，美国专利号6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其全文以引用的方式并入本文)；环状探针技术(例如美国专利号5,403,711、5,011,769和5,660,988，其全文以引用的方式并入本文)；Dade Behring信号扩增方法(例如美国专利号6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其全文以引用的方式并入本文)；连接酶链反应(例如，BaranayProc.Natl.Acad.Sci USA 88,189-93(1991))；以及夹心杂交方法(例如，美国专利号5,288,609，其全文以引用的方式并入本文)。

在本发明还涉及所述粘性生物样本液化保存组合产品及其试剂盒在核酸直接扩增或直接检测中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述的应用为非诊断和治疗目的。

在本发明的一些实施方式中，所述的应用为诊断和治疗目的。

具体实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度和/或操作精度导致的可接受的偏差。

DTT，二硫苏糖醇的浓度单位为质量体积比。

SDS，十二烷基硫酸钠。

圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)，型号S1014，规格24T；

圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，规格24T。

实施例1液化效果测试

本实施例中，实验组液化试剂使用愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠配制而成。终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)配制试剂使用的溶剂为纯化水，将其记为实验组。

收集得到的4例目测较为粘稠的痰液样本(I、II、III、IV)，将这些痰液样本每一例单独充分混合，并且每例分别取6份2mL样本，编号为1～6。备用。

向1号样本中加入实验组试剂6mL；

向2号样本中加入6mL二硫苏糖醇溶液(2％(w/v)DTT)；

向3号样本中加入6mL氢氧化钠溶液(0.1M)；

向4号样本中加入6mL终浓度为100mM乙酰半胱氨酸、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)配制的试剂；

向5号样本中加入6mL终浓度为100mM愈创甘油醚；

向6号样本中加入10mM氢氧化钠室温振荡混匀5分钟处理痰液后，调pH至中性，再加入100mM愈创甘油醚室温振荡混匀5分钟。

以上样本均振荡混匀5分钟，在室温下进行。

利用移液器分别吸取上步得到的液化后的4例样本，观察并记录吸取过程，结果如表1所示。

结果表明，本方法液化后的痰液可顺利被10μL移液器吸取操作，证明本方法对痰液液化效果较好，样本粘稠度明显下降。

使用乙酰半胱氨(4号样本)替代在本方法体系中的愈创甘油醚发现液化效果出现下降。另在单一愈创甘油醚组分情形下(5号样本)，液化效果也出现下降。

表1

此外，进一步地，对于上述单一愈创甘油醚组(5号本，常温中性条件下，未加入氧化锆珠处理30min)液化效果一般，个别浓痰吸头吸取时存在拉丝现象，但无可见痰液。对于5号样本，于95℃加热30min条件下可与实验组液化效果基本相当。

实施例2不同浓度的液化组分配合氧化锆珠的效果测试

本实施例中，实验组液化试剂由以下组分中的一种或多种组成；愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠。

实验组1：终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

实验组2：终浓度为1mM愈创甘油醚、1000mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

实验组3：终浓度为1mM愈创甘油醚、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)、0.1mM氢氧化钠，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

收集得到的4例目测较为粘稠的痰液样本(I、II、III、IV)，将这些痰液样本每一例单独充分混合，并且每例分别取3份2mL样本，编号为1～3。备用。

向1号样本中加入实验组1试剂6mL(混合后pH＝12)；

向2号样本中加入实验组2试剂6mL(混合后pH＝14)；

向3号样本中加入实验组3试剂6mL(混合后pH＝10)；

以上样本均振荡混匀5分钟，在室温下进行；

利用移液器分别吸取上步得到的液化后的4例样本，观察并记录吸取过程，结果如表2所示。

结果表明，各实验组方法液化后的痰液可顺利被10μL移液器吸取操作，证明本方法对痰液在较为宽泛的愈创甘油醚浓度和pH下液化效果均较好，样本粘稠度明显下降。

表2

实施例3与其他方法对液化后痰液样本快速检测对比

本实施例中，实验组液化试剂使用愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠配制而成。终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水，将其作为实验组。

收集得到的4例目测较为粘稠的痰液样本(I、II、III、IV)，将这些痰液样本每一例单独充分混合，并且每例分别取5份2mL样本，编号为1～5。备用。

向1号样本中加入实验组试剂6mL；向2号样本中加入2.5g盐酸胍+0.5g乙酰半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒(专利文献CN108949748A所公开的方法)；向3号样本中加入6mL二硫苏糖醇溶液(2％DTT)；向4号样本中加入6mL胰蛋白酶溶液(含pH7.0的缓冲体系)；向5号样本中加入6mL氢氧化钠溶液(0.1M)，以上样本均振荡混匀5分钟，在室温下进行。

利用移液器分别吸取上步得到的液化后的4例样本，(未液化样本12000rmp转离心1min取上清)。

采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)(湘长械备20150022号)进行提取，圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(国械注准20213400256)进行检测。检测结果如表3所示，表3中列出了本实施例中不同样本进行呼吸道病原体核酸检测的Ct值；其中，Ct值表示样本浓度的高低，其数值的高低反映了浓度的高低，数值越低浓度越高，数值越高浓度越低)。根据表3，检测本实施例实验组液化后的4例样本，人基因组DNA可正常检出(Ct值均小于40)。呼吸道合胞病毒均为阳性(Ct值均小于40)，其他方法DNA及RNA检测Ct值均受到不同程度的影响。说明其他方法液化样本后无法直接进行快速提取检测。对POCT(即时检测)检测系统存在阻力。上述实验结果的扩增曲线分别如图1和图2所示。图1中，A为实验组；B为蛋白酶法；C为氢氧化钠法；D为DTT法；E为乙酰半胱氨酸法。图2中A为实验组；B为蛋白酶法；C为氢氧化钠法；D为DTT法；E为乙酰半胱氨酸法。结果表明，实验组方法明显优于其他方法。

表3.实施例3中不同样本进行呼吸道病原体核酸检测的Ct值。

其中，NoCt表示未检出信号值，结果阴性。

实施例4对免提取扩增体系(引入扩增提取的核酸未纯化)的影响验证

本实施例中，实验组液化试剂使用愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠配制而成。终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

选取2份咽拭子样本分别使用本实施例实验组液化试剂及生理盐水(对照组)作为基质100倍稀释后，采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)进行提取，圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测。检测结果如表4(Ct值)所示和图3所示，结果表明，本实施例实验组针对选取的2份样本稀释处理后，使用荧光定量PCR方法免提取扩增体系测试核酸浓度值与生理盐水基质稀释测试核酸浓度值差异非常小，说明本实施例实验组中的试剂对后端核酸提取及荧光定量PCR方法扩增检测无抑制作用。因此，对后端应用友好性强。从图3中可以看出，两种基质稀释测试核酸曲线形状均能正常扩增，Ct值差异较小。

表4.实施例4中不同样本进行呼吸道病原体核酸检测的Ct值

实施例5液化后的样本稳定性测试。

本实施例中，实验组液化试剂使用愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠配制而成。终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

收集得到的1例目测较为粘稠的痰液样本，分成2份。其中一份加入3倍体积生理盐水研磨仪研磨均质化，备用。另一份痰液样本与本实施例实验组液化试剂充分混合，分装成11份样本，编号1-11。备用。液化后的样本在37℃条件下放置0h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h时分别采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)进行提取，圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测。检测结果如表5(Ct值)所示，结果表明，本实施例实验组液化处理后的样本采用快速免纯化检测系统检测RNA能在24h内稳定检出，4h内浓度无明显变化。本实施例实验组液化处理后的样本采用快速免纯化检测系统检测DNA能在192h内稳定检出，144h内浓度无明显变化。与对照组相比RNA与DNA在37℃条件下核酸被检出的能力相当。实验结果如表5和图4所示。从图4中可以看出，4张图片均正常扩增，图A与图C曲线形状较为一致。图B与图C形状较为一致。实验组与对照组核酸保存时长差异较小。

表5.实施例5中不同样本进行呼吸道病原体核酸检测的Ct值

其中，“No Ct”表示未检出信号值，结果阴性。

实施例6.对液化宫颈粘液的效果测试

本实施例中，实验组液化试剂使用愈创甘油醚、氢氧化钠、氧化锆珠配制而成。终浓度为100mM愈创甘油醚、10mM氢氧化钠、1g/mL氧化锆珠(通径为1mm)，配制试剂使用的溶剂为纯化水。

于圣维尔医学检验中心收集得到的4例目测较为粘稠的宫颈粘液样本，将宫颈粘液样本与本实施例实验组液化试剂按照体积比1:3进行充分混合，振荡混匀5分钟。

利用移液器分别吸取上步得到的液化后的4个样本，观察并记录吸取过程，结果如表6所示，结果表明，本方法液化后的宫颈粘液可顺利被10μL移液器吸取操作，证明本方法对痰液液化效果较好，样本粘稠度明显下降。

表6

实施例7对比测试本发明保存液与市面上保存液保存液化后病毒样本及核酸的能力

选取2例临床痰液样本，样本中含有呼吸道病毒。采用实施例1中的实验组的方法进行液化。液化完全后加入本实施例实验组所提供的保存液和商业保存液。

本实施例实验组保存液试剂配制：以下组分浓度均为配制后终浓度，柠檬酸3mM、氯化钠1％(w/v)、氯化钾0.8％(w/v)、海藻糖1M、甘露醇2.5％(w/v)、尿素1.5％(w/v)、甘油6％(v/v)、甘氨酸1M、异亮氨酸1M，溶剂为灭菌纯化水。

在液化完全后的样本中加入1/3倍液化样本体积的上述保存液充分混匀。

商业保存液(主要活性成分包括RNasin、硫氰酸胍、氯化钠，与本实施例实验组保存液的成分存在巨大差异)：按照说明书操作。

将两种保存液保存的样本在37℃条件下分别放置0h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、144h、192h、288h时同步(37℃条件处理完后样本置于-20℃保存，待所有测试组全部处理完后解冻备用)分别采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)进行提取，圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(2021001批次，国械注准20213400256)进行检测。

检测结果如表7(Ct值)及图5所示，结果显示，本实施例实验组保存液保存上述液化方法液化的痰液样本，病毒核酸可检出的时间较商业保存液长，检测浓度较商业保存液浓度值高。从0h-288h期间核酸浓度变化可发现，本实施例实验组保存液核酸降解程度明显小于商业保存液，说明本实施例实验组保存液在使用荧光PCR检测保存病毒样本及核酸时具有较大的优势，稳定性更好，持久性更长。

表7.实施例7中不同样本的呼吸道病毒核酸检测结果的Ct值

其中，NoCt表示未检出信号值，结果阴性。

实施例8对比测试本发明保存液与市面上保存液保存液化后病原菌样本及核酸的能力

选取2例临床痰液样本，样本中含有淋球菌。采用实施例1中的实验组的方法进行液化。液化完全后加入本实施例实验组所提供的保存液和商业保存液。

本实施例实验组保存液试剂配制：以下组分浓度均为配制后终浓度，柠檬酸3mM、氯化钠0.3％(w/v)、氯化钾0.8％(w/v)、海藻糖0.5M、甘露醇4.5％(w/v)、尿素1.5％(w/v)、甘油3％(v/v)、甘氨酸1M、异亮氨酸1M，溶剂为灭菌纯化水。

在液化完全后的样本中加入1/3倍液化样本体积的上述保存液充分混匀。

商业保存液(主要活性成分包括RNasin、硫氰酸胍、氯化钠)：按照说明书操作。

将两种保存液保存的样本在37℃条件下分别放置0h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、144h、192h、288h时同步(37℃条件处理完后样本置于-20℃保存，待所有测试组全部处理完后解冻备用)分别采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)进行提取，圣湘生物公司生产的淋球菌核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(2021001批次，国械注准20153400086)进行检测。

检测结果如表8(Ct值)和图6所示，结果显示，本实施例实验组保存液保存上述液化方法液化的痰液样本，病原菌核酸可检出的时间较商业保存液基本相当，检测浓度较商业保存液浓度值高。从0h-288h期间核酸浓度变化可发现，本实施例实验组保存液核酸降解程度明显小于商业保存液，说明本实施例实验组保存液在使用荧光PCR检测保存病毒样本及核酸时具有较一定的优势。

表8.实施例8中不同样本的淋球菌DNA核酸检测结果的Ct值

实施例9对比测试本发明保存液与市面上保存液保存液化后细胞样本及核酸的能力

选取2例临床痰液样本，样本中含有人脱落细胞等。采用实施例1中的实验组的方法进行液化。液化完全后加入本实施例实验组所提供的保存液和商业保存液。

本实施例实验组保存液试剂配制：以下组分浓度均为配制后终浓度，柠檬酸3mM、氯化钠1％(w/v)、氯化钾0.2％(w/v)、海藻糖0.7M、甘露醇2％(w/v)、尿素1.5％(w/v)、甘油10％(v/v)、甘氨酸1M、异亮氨酸1M，溶剂为灭菌纯化水。

在液化完全后的样本中加入1/3倍液化样本体积的上述保存液充分混匀。

商业保存液(主要活性成分包括RNasin、硫氰酸胍、氯化钠)：按照说明书操作。

将两种保存液保存的样本在37℃条件下分别放置0h、4h、8h、24h、48h、72h、96h、144h、192h、288h时同步(37℃条件处理完后样本置于-20℃保存，待所有测试组全部处理完后解冻备用)分别采用圣湘生物科技股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(RNA一步法释放剂)进行提取，圣湘生物公司生产的六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)(2021001批次，国械注准20213400256)进行检测。

检测结果如表9(Ct值)及图7所示，结果显示，本实施例实验组保存液保存上述液化方法液化的痰液样本，人基因组核酸可检出的时间较商业保存液相当，检测浓度较商业保存液浓度值高。从0h-288h期间核酸浓度变化可发现本实施例实验组保存液核酸降解程度明显小于商业保存液，说明本实施例实验组保存液在使用荧光PCR检测保存病毒样本及核酸时具有一定的优势。

表9.实施例9中不同样本的人基因组DNA核酸检测结果的Ct值

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (23)

1.粘性生物样本液化保存组合产品，其包括液化组分和保存组分：

所述液化组分包括愈创甘油醚和强碱；

所述保存组分包括以下组分：

a)缓冲组分，用于中和所述强碱使保存体系的pH为6～8；

b)渗透压调节组分；和

c)海藻糖、甘露醇以及甘油中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述缓冲组分为1mmol/L～5mmol/L的柠檬酸。

3.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述渗透压调节组分包括甜菜碱和/或无机阳离子，所述无机阳离子优选Na⁺以及K⁺中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的组合产品，其特征在于，所述渗透压调节组分包括0.1％～1.2％(m/v)氯化钠和0.1％～1.2％(m/v)氯化钾。

5.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述保存组分还包括一种或多种氨基酸，优选所述氨基酸在所述保存组分中的总浓度为1mol/L～3mol/L。

6.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，所述保存组分中包括0.8mol/L～1mol/L甘氨酸和0.6mol/L～1mol/L异亮氨酸。

7.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述海藻糖在所述保存组分中的浓度为0.5mol/L～1mol/L，和/或；

所述甘露醇在所述保存组分中的浓度为1.5％～4.5％(m/v)；和/或，

所述甘油在所述保存组分中的浓度为2％～10％(v/v)。

8.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述保存组分中还含有尿素，优选所述尿素在所述保存组分中的浓度为1％～3％(m/v)。

9.根据权利要求1～8任一项所述的组合产品，其特征在于，所述液化组分还包括刚性微颗粒。

10.根据权利要求1～8任一项所述的组合产品，其特征在于，所述强碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化钡、胆碱中至少一种。

11.试剂盒，其包括权利要求1～10任一项所述的组合产品。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其还包括用于核酸的释放剂、提取剂、扩增剂以及检测剂中的任意一种或多种。

13.粘性生物样本液化保存方法，包括如下步骤：

i)将粘性生物样本与1～10任一项中所述的液化组分混合得到第一混合物；

ii)孵育所述第一混合物得到第二混合物；

iii)将所述第二混合物与权利要求1～10任一项中所述的保存组分混合。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一混合物的pH值≥10。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述愈创甘油醚在所述第一混合物中的浓度为1mmol/L～1mol/L。

16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述孵育的温度为18℃～35℃。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述孵育的时间≥5min。

18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤iii)中，所述保存组分与所述第二混合物的体积比为1：(2～4)。

19.根据权利要求13～18任一项所述的方法，所述粘性生物样本包括痰液或宫颈粘液。

20.粘性生物样本中核酸的释放方法，包括如下步骤：

使用权利要求13～19任一项所述的方法将所述粘性生物样本液化并保存；

使用核酸释放剂释放所述粘性生物样本中的核酸。

21.粘性生物样本中核酸的提取方法，包括如下步骤：

使用权利要求20所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

使用核酸提取剂提取释放的核酸。

22.粘性生物样本中核酸的扩增方法，包括如下步骤：

使用权利要求20所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

使用核酸扩增剂扩增核酸。

23.粘性生物样本中核酸的检测方法，包括如下步骤：

使用权利要求20所述的方法释放所述粘性生物样本中的核酸；

任选地使用核酸提取剂提取释放的核酸；

任选地使用核酸扩增剂扩增核酸；

使用核酸检测剂检测核酸。

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