CN116042788B - 一种波纹唇鱼微卫星荧光多重pcr的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，该方法包括以下步骤：(1)提取波纹唇鱼DNA；(2)合成SSR多重PCR引物；(3)多重PCR扩增；(4)遗传多样性评估。该方法通过合成用于波纹唇鱼SSR多重PCR的引物，可用于评估波纹唇鱼遗传多样性，且采用的引物多态性高，扩增稳定，结果可靠。还公开了所述方法在评估波纹唇鱼遗传多样性方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于微卫星标记技术领域，具体涉及一种用于波纹唇鱼SSR多重PCR的方法及其应用。
背景技术
波纹唇鱼(Cheilinus undulatus)属鲈形目、隆头鱼科、唇鱼属，分布于太平洋和印度洋的热带海域有海草床和红树林分布的礁盘和近岸栖息地，通常丰度很低，以软体动物、小型鱼类、海胆和甲壳类等为食，雌雄同体，雌性先熟，有些个体直接发育为雄性，初次性成熟在35～50厘米，雄性成年个体体长一般在1米以上，成体喜独居，繁殖期有集群现象，是珊瑚礁中最具经济价值的鱼类，珊瑚大三角区域是其主要的分布区域，印度尼西亚是主要出口国。人类活动是生物多样性下降的主要原因。海洋动物相比陆地动物受到的影响较小，但从上世纪七十年代开始海洋动物灭绝也开始加速，而此时正是渔业捕捞量达到顶峰并开始徘徊的时间节点。遭到威胁的海洋动物主要为食物链顶端的大型动物。波纹唇鱼是珊瑚礁中大型鱼类，受大量捕捞和栖息地破坏的影响，数量迅速减少，1996年被世界自然保护联盟列为“易危”，2004年升级为“濒危”，2005年被列入濒危野生动植物种国际贸易公约附录二，实行国际贸易配额制度。我国将该种列为《国家重点保护野生动物名录》二级。
群体大小的波动会影响遗传多样性的变化，而极小的群体容易引起群体内的自交，从而导致群体适应能力的减弱，在较好的环境下近交衰退会表现不明显，但是在恶劣环境中则容易显现。目前的科学研究已经发现了波纹唇鱼群体大小出现了急速下降，但是并不清楚珊瑚礁破坏和人类捕捞究竟充当了什么作用，评估其遗传多样性变化和和近交水平是切实可行的监测手段。当前用来监测遗传多样性的分子标记有单核苷酸多样性标记(SNP)、微卫星标记(SSR)等。针对特定的群体进行监测，微卫星标记具有单个位点等位基因丰富、分型成本低、技术成熟等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，该方法通过合成用于波纹唇鱼SSR多重PCR的引物，可用于评估波纹唇鱼遗传多样性，且采用的引物多态性高，扩增稳定，结果可靠。
本发明的目的还在于提供上述方法在评估波纹唇鱼遗传多样性方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现的：一种波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)提取波纹唇鱼DNA：采集波纹唇鱼样品的鳍条组织，提取基因组DNA；
(2)合成SSR多重PCR引物：SSR多重PCR引物包括12对特异性引物和两条荧光标记通用引物M13和PQE-F，分别为引物对Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586、Cun148、Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484，将12对特异性引物分为两组，分别为G1组和G2组，其中G1组包括引物对Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586和Cun148，G2组包括引物对Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484；
(3)多重PCR扩增：利用步骤(2)中的两组特异性引物和所述两条荧光标记通用引物对步骤(1)中的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
(4)遗传多样性评估：对扩增产物进行基因分型，统计每个位点和个体的等位基因，根据杂合度指标比较遗传多样性。
在上述波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法中：
优选的，步骤(2)中所述12对特异性引物中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述12对特异性引物的碱基序列依序分别如SEQ ID NO：1～24所示。
进一步的，步骤(2)中与所述通用引物M13相配合的荧光标记为5-FAM，与所述通用引物PQE-F相配合的荧光标记为5-HEX。
本发明还可以进一步提供一种用于波纹唇鱼SSR多重PCR的试剂盒，包括所述12对特异性引物，或所述12对特异性引物和上述荧光标记的通用引物的组合。
优选的，步骤(3)中PCR扩增时，G1组的反应体系如下所示：
优选的，步骤(3)中PCR扩增时，G2组的反应体系如下所示：
| G2组PCR体系反应物 | 含量(μL) |
| Cun752.F(10μM) | 0.06 |
| Cun752.R(10μM) | 0.24 |
| Cun230.F(20μM) | 0.06 |
| Cun230.R(20μM) | 0.24 |
| Cun27.F(10μM) | 0.06 |
| Cun27.R(10μM) | 0.24 |
| Cun485.F(10μM) | 0.06 |
| Cun485.R(10μM) | 0.24 |
| Cun484.F(10μM) | 0.06 |
| Cun484.R(10μM) | 0.24 |
| M13(10μM) | 0.36 |
| PQE-F(10μM) | 0.36 |
| BSA(2mg/mL) | 0.45 |
| DNA(50ng/μL) | 2.0 |
| Taq HS(Takara) | 12.5 |
| ddH2O | 7.83 |
| Total | 25.0 |
。
本申请中的引物组合是根据引物相互作用模拟优化获得的，体系配置过程：首先根据要求配置引物粗存液，然后按照1：4混合正向引物和反向引物，再等量混合各引物对混合液，最后根据检测样品数量配置扩增体系。该配置过程避免了引物单个添加引起的误差，提高了实验稳定性，适合于批量扩增。
优选的，步骤(3)中PCR扩增时，采用的扩增程序为：98℃10s，57℃40s，72℃60s，35个循环；98℃10s，53℃40s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸30min。
优选的，步骤(4)中分型方法采用毛细管电泳技术，具体的，对扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行基因分型。
本发明的第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的SSR多重PCR方法在评估波纹唇鱼遗传多样性方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明中的波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，该方法选用可靠有效的微卫星引物组合，提供一种利用多重PCR技术对波纹唇鱼群体进行分型的方法，根据开发的引物和试剂盒，可用于群体遗传学研究、种质资源评估、谱系鉴定和增殖放流效果评估等方面；
(2)本发明利用微卫星标记、多重PCR和通用扩增引物技术的结合，筛选了12个高度多态性微卫星位点，对波纹唇鱼进行分型；
(3)本发明除了可以一次将引物组G1、引物组G2组合，同时检测12个位点之外，实际应用中还可以通过调整引物组G1、引物组G2的数量，可以检测1-12个位点，且通用引物可以重复利用，相对于简单的单位点检测，效率提高，费用降低；
(4)本发明中包含的微卫星位点为3-6碱基，等位基因大小判读更加准确，提高了基因型数据的准确性。
附图说明
图1是实施例1中的毛细管电泳图，1-2分别与位点Cun463、Cun378对应；
图2是实施例1中的毛细管电泳图，3与位点Cun500对应；
图3是实施例1中的毛细管电泳图，4与位点Cun626对应；
图4是实施例1中的毛细管电泳图，5与位点Cun672对应；
图5是实施例1中的毛细管电泳图，6与位点Cun586对应；
图6是实施例1中的毛细管电泳图，7与位点Cun148对应；
图7是实施例1中的毛细管电泳图，8与位点Cun752对应；
图8是实施例1中的毛细管电泳图，9与位点Cun230对应；
图9是实施例1中的毛细管电泳图，10与位点Cun27对应；
图10是实施例1中的毛细管电泳图，11与位点Cun485对应；
图11是实施例1中的毛细管电泳图，12与位点Cun484对应。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施例提供的波纹唇鱼微卫星多重PCR的方法，首先根据微卫星位点，筛选并设计出两组微卫星扩增引物组合，共包含12对特异引物，然后分成两组，不同组在不同反应管中加入各自组的特异引物对和荧光标记的通用引物，经PCR扩增出多个目的片段，通过电泳将不同引物的多个扩增产物加以分离，最后对分离条带进行统计。
具体的，本实施例提供的波纹唇鱼微卫星多重PCR的方法，包括以下步骤：
(1)提取波纹唇鱼DNA：采集待评估的波纹唇鱼亲本鳍条组织，提取基因组DNA；
(2)筛选出两组多重SSR-PCR引物；
根据波纹唇鱼基因组参考序列，统计微卫星的分布和分类特点，通过对群体重测序数据分析，对微卫星进行分型、筛选高多态水平和3-6碱基重复单元的微卫星，评估引物的扩增特异性和引物组合之间的兼容性，筛选出两组多重SSR-PCR组合，用G1、G2表示，分别均包含6个微卫星位点，如下表1、表2中所示，微卫星序列使用荧光通用引物标记，利用毛细管电泳仪自动分型，通用引物如表3所示。
其中12对特异性引物，分别为引物对Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586、Cun148、Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484，其中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，24个特异性引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～24所示，各引物的序列如下表1-2。
还包括两条荧光标记的通用引物M13、PQE-F，与其相配合的荧光标记分别为5-FAM、5-HEX，具体序列如下表3。
表1 G1组微卫星位点扩增的特异引物对和荧光标记通用引物
表2 G2组微卫星位点扩增的特异引物对和荧光标记通用引物
表3两条通用引物和与通用引物相配合的荧光标记
| 序号 | 引物对 | 引物序列 | 荧光标记 |
| 1 | M13 | tgtaaaacgacggccagt | 5-FAM |
| 2 | PQE-F | ttgagaggatcgcatcca | 5-HEX |
(3)上述引物在商业公司合成；
(4)PCR扩增：扩增程序为98℃10s，57℃40s，72℃60s，35个循环；98℃10s，53℃40s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸30min。扩增体系如下表4-5：
表4 G1组多重PCR扩增体系
| PCR体系反应物 | 含量(μL) |
| Chun463.F(20μM) | 0.06 |
| Chun463.R(20μM) | 0.24 |
| Chun378.F(20μM) | 0.06 |
| Chun378.R(20μM) | 0.24 |
| Chun500.F(10μM) | 0.06 |
| Chun500.R(10μM) | 0.24 |
| Chun626.F(20μM) | 0.06 |
| Chun626.R(20μM) | 0.24 |
| Chun672.F(10μM) | 0.06 |
| Chun672.R(10μM) | 0.24 |
| Chun586.F(10μM) | 0.06 |
| Chun586.R(10μM) | 0.24 |
| Chun148.F(20μM) | 0.06 |
| Chun148.R(20μM) | 0.24 |
| M13(10μM) | 0.36 |
| PQE-F(10μM) | 0.36 |
| BSA(2mg/mL) | 0.45 |
| DNA(50ng/μL) | 2.0 |
| Taq HS(Takara) | 12.5 |
| ddH2O | 7.23 |
| Total | 25.0 |
表5 G2组多重PCR扩增反应体系
(5)扩增样品送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型；
(6)基因型检测：将多重PCR产物在自动测序仪(ABI 3730XL)上进行分型，读取个体基因型。
毛细管电泳图如图1-11所示，其中1-12分别与位点Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586、Cun148、Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484一一对应。
如下表6所示：
表6 1-12与位点的关系
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| 位点 | Cun463 | Cun378 | Cun500 | Cun626 | Cun672 | Cun586 | Cun148 | Cun752 | Cun230 | Cun27 | Cun485 | Cun484 |
从图1-11的峰图上可以看出峰型整齐、稳定，等位基因长度严格符合重复基序特征，说明开发的多重PCR-SSR可以稳定使用。
实施例2
以下通过具体实施例来说明上述的SSR荧光标记引物在波纹唇鱼遗传多样性评估中的应用。
(1)提取波纹唇鱼DNA
剪取波纹唇鱼30个个体鳍条并立即保存在95％乙醇中，利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组总DNA，具体步骤参见试剂盒使用说明。DNA提取完毕后使用紫外分光光度计检测浓度。
(2)合成引物
按照表1-3中的序列和荧光标记要求合成引物。
(3)多重PCR扩增
每个个体按照表4、表5体系进行PCR扩增。
PCR反应程序设定：98℃10s，59℃30s，72℃60s，30个循环；98℃10s，53℃30s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸30min。
PCR结束后，取5μL在琼脂糖凝胶上电泳检测有期望大小的整齐明亮条带，采用凝胶电泳确认引物可以扩增出来目的条带，其余送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型。
(4)利用软件GeneMarker V2.2.2.0进行将峰型转换为等位基因，表7是群体遗传学参数。
表7波纹唇鱼12个微卫星位点遗传学参数
| Locus | N | Na | Ne | I | Ho | He | uHe | F |
| Cun463 | 30 | 4.000 | 1.835 | 1.835 | 0.367 | 0.455 | 0.463 | 0.194 |
| Cun378 | 30 | 2.000 | 1.724 | 0.611 | 0.267 | 0.420 | 0.427 | 0.365 |
| Cun500 | 30 | 5.000 | 3.455 | 1.409 | 0.667 | 0.711 | 0.723 | 0.062 |
| Cun626 | 30 | 3.000 | 2.817 | 1.067 | 0.433 | 0.645 | 0.656 | 0.328 |
| Cun672 | 30 | 4.000 | 1.850 | 0.906 | 0.433 | 0.459 | 0.467 | 0.057 |
| Cun586 | 30 | 5.000 | 2.521 | 1.088 | 0.500 | 0.603 | 0.614 | 0.171 |
| Cun148 | 30 | 8.000 | 4.380 | 1.721 | 0.900 | 0.772 | 0.785 | -0.166 |
| Cun752 | 30 | 3.000 | 2.203 | 0.931 | 0.300 | 0.546 | 0.555 | 0.451 |
| Cun230 | 30 | 6.000 | 4.592 | 1.635 | 0.667 | 0.782 | 0.795 | 0.148 |
| Cun27 | 30 | 3.000 | 2.436 | 0.985 | 0.100 | 0.589 | 0.599 | 0.830 |
| Cun485 | 30 | 3.000 | 2.332 | 0.952 | 0.500 | 0.571 | 0.581 | 0.125 |
| Cun484 | 30 | 5.000 | 2.320 | 1.123 | 0.567 | 0.569 | 0.579 | 0.004 |
| Mean | 30 | 4.250 | 2.705 | 1.109 | 0.475 | 0.594 | 0.604 | 0.214 |
注：Locus：位点，N：个体数，Na：等位基因数，Ne：有效等位基因数，I：香农信息指数，Ho：观测杂合度；He，期望杂合度；F：固定指数。
以上结果表明，本发明的微卫星12对引物构成的多重PCR方法在波纹唇鱼群体分型中稳定，准确，满足波纹唇鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估的要求。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）提取波纹唇鱼DNA：采集波纹唇鱼样品的鳍条组织，提取基因组DNA；
（2）合成SSR多重PCR引物：SSR多重PCR引物包括12对特异性引物和两条荧光标记通用引物M13和PQE-F，分别为引物对Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586、Cun148、Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484，将12对特异性引物分为两组，分别为G1组和G2组，其中G1组包括引物对Cun463、Cun378、Cun500、Cun626、Cun672、Cun586和Cun148，G2组包括引物对Cun752、Cun230、Cun27、Cun485和Cun484；
（3）多重PCR扩增：利用步骤（2）中的两组特异性引物和两条荧光标记通用引物对步骤（1）中的基因组DNA进行PCR扩增，得扩增产物；
（4）遗传多样性评估：对扩增产物进行基因分型，统计每个位点和个体的等位基因，根据杂合度指标比较遗传多样性；
步骤（2）中所述12对特异性引物中每对引物包括一个正向引物和一个反向引物，所述12对特异性引物的碱基序列依序分别如SEQ ID NO：1~24所示。
2.根据权利要求1所述的波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（2）中与所述通用引物M13相配合的荧光标记为5-FAM，与所述通用引物PQE-F相配合的荧光标记为5-HEX。
3.根据权利要求1所述的波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（3）中PCR扩增时，G1组多重PCR扩增反应体系如下所示：
。
4.根据权利要求1所述的波纹唇鱼微卫星荧光多重PCR的方法，其特征是：步骤（3）中PCR扩增时，G2组多重PCR扩增反应体系如下所示：
。
5.权利要求1-4任一项所述的方法在评估波纹唇鱼遗传多样性方面的应用。
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| CN114921562A (zh) * | 2022-04-27 | 2022-08-19 | 南方海洋科学与工程广东省实验室(广州) | 一种用于棘头梅童鱼ssr多重pcr引物及其应用 |
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