CN116042665A - 葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了葡萄糖脱氢酶N37T位点的突变体，突变体的催化活性较野生型有了约19倍提升。将葡萄糖脱氢酶突变体N37T应用到电化学生物传感器上，选用具有巨大的比表面积、导电性良好的多壁碳纳米管作为载体，聚乙二醇作为分散剂，全氟磺酸膜作为成膜材料，所制得电极具有优异重现性、扫描稳定性，构建的电化学传感器不受溶解氧的干扰，可广泛应用于生物传感分析测试和食品检测等领域。

Description

葡萄糖脱氢酶突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及葡萄糖脱氢酶突变体，及其制备和在生物传感器中的应用。
背景技术
葡萄糖脱氢酶在按照辅基或辅酶差异可分为：以NAD(P)+为辅酶的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47简称NAD(P)-GDH)、以PQQ为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC1.1.5.2简称PQQ-GDH)、以FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.5.9简称FAD-GDH)。本发明所研究的NAD(P)-GDH是短链脱氢酶/还原酶家族中的一员，与同源对应的亚基具有相似的整体折叠和低聚体结构，主要来源于芽孢杆菌和古细菌，在辅酶存在下能够专一地催化底物葡萄糖同时辅酶被还原，其具底物特异性专一和热稳定性良好等特点，有很高的应用和研究价值，但野生型葡萄糖脱氢酶其催化活性较低，对酶的活性提高长期以来是一个重点和难点问题，因此提高葡萄糖脱氢酶的催化活性具有重要的应用和研究价值。
生物传感器是以微生物、核酸、蛋白质、酶、细胞器等生物材料以特定的方式固定在识别元件表面，对底物特异性识别并伴随着某种物理变化或者化学变化，在此过程中的生物活性表达信号转化为可被监测到的电信号或光谱学信号的一种重要的检测工具。在反应过程中伴随着电子的转移，电化学检测系统捕捉到电子转移的变化，产生不同强度的电流，产生的电流会根据不同的底物浓度而改变。
在电化学的构建过程中，大多数选择机械强度高、稳定性好、导电能力强的碳纳米材料作为基底材料，但是碳纳米材料疏水性较差不能均匀分布在溶液及电极表面，也是需要解决的技术问题。
大多数市售检测系统是基于葡萄糖氧化酶电化学读数的检测系统，这类传感器采用体外的电子受体进行。但利用葡萄糖氧化酶在氧和葡萄糖存在的情况下，葡萄糖氧化酶消耗氧气催化葡萄糖产生过氧化氢和葡萄糖酸，这会影响介体辅助生物传感器的灵敏度，始终存在氧气的干扰其对检测结果的影响无法消除，而葡萄糖脱氢酶不以氧气为电子受体，规避了这一问题。
发明内容
本项目针对基于葡萄糖氧化酶的检测系统会受到氧气干扰，而葡萄糖脱氢酶对底物催化活性较低的缺陷，通过AlphaFold2预测突变位点并用Discovery Studio 3.0建模分析构建了高催化活性的突变体，并基于该突变体探索出一种新型传感器的构建——基于多壁碳纳米管和聚乙二醇纳米复合材料和葡萄糖脱氢酶突变体构建出高灵敏度葡萄糖检测传感器，该传感器既能解决溶解氧的干扰，又能将葡萄糖脱氢酶很好地固定在电极上，所采用的纳米复合材料用量是μg级别，避免材料浪费，提高了酶的利用率，可广泛应用于生物传感分析测试和食品检测等领域。
首先本发明通过定点突变，得到一种更高催化活性的葡萄糖脱氢酶突变体，然后对突变后酶活性检测，选择合适的纳米材料、最终制备成电极，将其应用到在葡萄糖检测用新型生物电化学传感器的制备中，该方法所制备的电化学传感器可使葡萄糖脱氢酶与玻碳电极表面进行直接电子转移。
在这项研究中，从PDB蛋白数据库获取葡萄糖脱氢酶(PDB ID：1GCO)的三维结构，通过AlphaFold2预测突变位点并用Discovery Studio 3.0建模分析，使用含有GDH基因的pET-28a(+)质粒作为模板，通过PCR扩增编码GDH目的片段，成功构建了4个GDH突变体(pET-GDH、pET-N37T、pET-D108F、pET-E148K、pET-V209W)分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。
其中4个突变体分别如下：
Figure BDA0004118688630000021
Figure BDA0004118688630000031
将所构建的菌株用LB培养基培养至OD600值为0.5，加入0.5mM IPTG诱导12小时后离心收集菌体，并用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌泥3次，用超声破碎仪在300W条件下将细胞破碎30分钟，离心去除沉淀，上清液经过0.22μm滤膜过滤，在200mM咪唑条件下经过亲和层析柱纯化并用超滤管除去咪唑得到酶液。
所得到的野生型GDH和N37T、D108F、E148K、V209W突变体酶液用于催化活性分析，N37T和V209W较野生型GDH相比催化能力有所提高，尤其是N37T突变体的催化能力为野生型的19倍。
将N37T突变体其应用在电化学传感器的制作中，选用电化学性能更优越的MWCNTs作为基底材料，但由于其的疏水性较强特征，在水中的溶解性较差，故选择亲水性的聚乙二醇作为分散剂改善这一特征。聚乙二醇的加入，一方面的作用可以改善MWCNTs的分散性，防止MWCNTs形成团聚，可以使疏水性极强的MWCNTs在电极表面分散均匀，增大葡萄糖脱氢酶与纳米材料之间的接触面积:另一方面，聚乙二醇的加入可以使电极成膜强度和稳定性增加，将全氟磺酸膜(Nafion)作为成膜材料保护电极，所构建的电极具有以下特性：
1.N37T催化活性较野生型GDH响应信号较好；
2.在检测过程中不受溶解氧的干扰；
3.具有较好的储存稳定性。
本发明所达到的有益效果是：本发明公开了葡萄糖脱氢酶N37T位点的突变体，突变体的催化活性较野生型有了19倍提升。将葡萄糖脱氢酶突变体N37T应用到电化学生物传感器上，实现了葡萄糖脱氢酶与玻碳电极表面进行直接电子转移，解决了传统以葡萄糖氧化酶为识别元件的传感器受氧气干扰的情况及以碳纳米管为基底疏水性差的问题。同时选用具有巨大的比表面积、导电性良好的多壁碳纳米管作为载体，聚乙二醇作为分散剂，全氟磺酸膜作为成膜材料，制备条件温和，不需要高温高压反应，简单快捷的制备一种高稳定性的电化学传感器，所制得电极具有优异重现性、扫描稳定性，构建的电化学传感器不受溶解氧的干扰，可广泛应用于生物传感分析测试和食品检测等领域。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1、葡萄糖脱氢酶的质粒构建图；
图2、野生型葡萄糖脱氢酶和N37T、D108F、E148K、V209W突变体SDS-PAGE电泳分析图；
图3、野生型葡萄糖脱氢酶和筛选得到的突变体的酶学性质比较；
图4、对37位点天冬酰胺进行随机突变得到的突变体酶学性质比较；
图5、本发明中多壁碳纳米管和聚乙二醇的扫描电镜图像；
图6、本发明采用GDH和GDH-N37T为识别元件的响应信号对比图；
图7、本发明在有氧气和无氧气条件下的响应信号对比图；
图8、本发明所制备电极经过28天保存后的氧化峰值电流变化；
图9、本发明葡萄糖浓度与响应电流变化的线性关系图；
图10、葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸基因序列及突变位点；
图11、GDH的核苷酸序列以及涉及到的突变位点变化。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1葡萄糖脱氢酶突变体的制备
通过PDB蛋白数据库获取葡萄糖脱氢酶的三维结构，并分析其氨基酸序列，氨基酸序列表见表1.
步骤1)根据AlphaFold 2预测突变位点并用Discovery Studio 3.0建模分析，得到4个潜在突变位点可能影响酶的催化活性，并为其设计引物，引物及引物序列见表1。
培养菌种：大肠杆菌BL21(DE3)
培养基配方：LB培养基：蛋白胨(10g/L)、酵母提取物(5g/L)和NaCl(10g/L)表2.突变体设计的引物以及引物序列
Figure BDA0004118688630000051
注：突变处已加粗和划线提示
步骤2)利用限制性内切酶ECoRI将突变体基因序列连接到pET-28a质粒上，构建出重组质粒pET-28a-GDH、pET-28a-GDH-N37T、pET-28a-GDH-D108F、pET-28a-GDH-E148K、pET-28a-GDH-V209W。其载体示意图如图1所示。
步骤3)将步骤2中构建完成的质粒转入感受态的大肠杆菌BL21(DE3),取出部分菌液涂布在含有硫酸卡那霉素的LB培养基平板上，于37℃培养箱中倒置培养12-16h，筛选出阳性的工程菌株,并于-80℃下储存。
步骤4)将重组的大肠杆菌BL 21接种到50ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养基中，在37℃和200rpm下培养2小时，随后在培养基中加入0.5mM IPTG。在22℃和200rpm下培养12小时后通过12000g，4℃条件下离心5分钟收集细胞，并用pH 7.5磷酸盐缓冲液洗涤三次。将细胞超声破碎，在4和℃12000g下离心20分钟，得到粗制的酶溶液。
步骤5)将步骤4)中的粗酶液通过Ni2+亲和色谱法和pET-28a-GDH、pET-28a-GDH-N37T、pET-28a-GDH-D108F、pET-28a-GDH-E148K、pET-28a-GDH-V209W中的组氨酸标签的特异性亲和作用，用200mM咪唑对上述酶液进行洗脱，通过超滤管12000g，4℃条件下离心5分钟除去粗酶液中的咪唑。得到野生型葡萄糖脱氢酶和N37T、D108F、E148K、V209W突变体纯酶，通过SDS聚丙烯酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白质进行分析，SDS-PAGE结果如图2所示。
实施例2
将实施例1中的野生型葡萄糖脱氢酶和N37T、D108F、E148K、V209W突变体进行活性分析。
分析条件为在60℃下培养5分钟，使用含有0.2M磷酸盐(pH 7.0)、50g/LNADP+、1M葡萄糖和0.5g/L野生型GDH及N37T、D108F、E148K、V209W突变体。所有的实验都在4毫升的最终体积中进行，在340纳米处测量反应中产生的NADPH量。一个单位的酶活性被定义为在实验条件下每分钟产生1μmoL的NADPH所需的酶量，每组反应重复三次。其催化活性变化如图3所示，实验结果表明：野生型的GDH酶活为121.4U/mg，通过定点突变改造后的酶活性均有变化，N37T、D108F、E148K、V209W的活性分别为2289.7、1034.5、161.1、92.8，N37T和D108F的催化活性大幅度提高，尤其是N37T突变体的催化活性较野生型提高了约19倍。进一步对N37T进行随机突变，探索突变成其他氨基酸是否有同样效果，催化活性如图4所示，其结果表明37位点的天冬酰胺突变成其他氨基酸效果较差，并不是所有随机突变都能提高GDH的催化活性，此外该位点天冬酰胺突变成谷氨酸还会导致GDH而失去催化活性。
实施例3
(1)MWCNTs和mPEG进行表面特征分析
多壁碳纳米管(MWCNTs)具有巨大的比表面积、高导电性和生物材料相容性，是一种良好的电化学传感器的构建载体。通过扫描电镜对聚乙二醇(mPEG)和MWCNTs进行表面特征分析，图5中(A)为在100000倍下MWCNTs的场发射扫描电镜图，通过该图可以看出MWCNTs是弯曲且拥有巨大的比表面积，可以为生物材料提供附着空间，是电极制备的理想材料之一；图5中(B)为在100000倍下的MWCNTs和mPEG孵育8小时后在的场发射扫描电镜图，结果显示mPEG的加入有效的交联在MWCNTs表面，改善了MWCNTs疏水性差的问题，增加了MWCNTs表面附着面积；
(2)电极的制备流程
一种稳定性好的新型电化学传感器的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)称取8mg的mPEG、2mg的MWCNTs和2mL的GDH分别溶于1mL超纯水中，配制成水溶液。
步骤2)将mPEG和MWCNTs以1：8的比例混合常温下孵育4-8小时；由于MWCNTs的疏水性特征，在电极表面上的分散性较差，故选择亲水性的mPEG与疏水性MWCNTs混合后，一方面聚乙二醇可以改善MWCNTs的分散性，防止MWCNTs形成团聚，可以使疏水性极强的MWCNTs在电极表面分散均匀，增大葡萄糖脱氢酶与纳米材料之间的接触面积:另一方面，聚乙二醇的加入可以使电极成膜强度和稳定性增加。
步骤3)将步骤2)的mPEG和MWCNTs混合液超声20分钟，使其在水溶液中分布均匀，以滴落涂布法将2μL交联后的混合液滴加在活化好的玻碳电极(GCE)电极中心，在干燥塔中干燥10min左右确保成膜均匀；
步骤4)分别配制浓度为10mg/mL的GDH和NADP，将二者等比例混合，取4μL于步骤3)制成的电极上，放入干燥塔中反应10min得到葡萄糖脱氢酶膜；
步骤5)将2μL 5％的Nafion(NF)覆盖于步骤4)制成的电极上，保护电极稳定性。从而制得NF/GDH/mPEG-MWCNTs/GCE。不用时放在4℃冰箱待用，以减小电极和GDH的氧化。
步骤6)本发明采用三电极体系，步骤5)已制备的电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，所述参比电极为Ag/AgCl，与上海辰华CHI650C电化学工作站，形成一套完整的电化学传感器。
实施例4
(1)GDH和GDH-N37T突变体的电化学响应信号对比
步骤1)称取8mg的mPEG、2mg的MWCNTs和2mL的GDH-N37T分别溶于1mL超纯水中，配制成水溶液。
步骤2)将mPEG和MWCNTs以1：8的比例混合常温下孵育4-8小时；
步骤3)将步骤2)的mPEG和MWCNTs混合液超声20分钟，使其在水溶液中分布均匀，以滴落涂布法将2μL交联后的混合液滴加在活化好的玻碳电极(GCE)电极中心，在干燥塔中干燥10min左右确保成膜均匀；
步骤4)分别配制浓度为10mg/mL的GDH-N37T和NADP，将二者等比例混合，取4μL于步骤3)制成的电极上，放入干燥塔中反应10min得到葡萄糖脱氢酶膜；
步骤5)将2μL 5％的Nafion(NF)覆盖于步骤4)制成的电极上，保护电极稳定性。从而制得NF/GDH-N37T/mPEG-MWCNTs/GCE。不用时放在4℃冰箱待用，以减小电极和GDH的氧化。
已制备的电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，所述参比电极为Ag/AgCl，与上海辰华CHI650C电化学工作站，形成一套完整的电化学传感器。以pH为7的50mM PBS为电解液，扫描速率为0.05V/s，对比GDH和GDH-N37T突变体在电化学传感器上的信号变化情况。其对比如图6所示，因为GDH-N37T经过定点突变后其催化活性较野生型GDH的催化能力有了19倍的提高，其在电化学响应信号也优于野生型GDH，而且GDH和GDH-N37T突变体的特征响应电压没有发生偏移，故在后续的工作中采用GDH-N37T突变体作为识别模块。
(2)所制备的电极在有无氧气的情况下测试
已制备的电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，所述参比电极为Ag/AgCl，与上海辰华CHI650C电化学工作站，形成一套完整的电化学传感器。以pH为7的50mM PBS为电解液，扫描速率为0.05V/s，分别通氧气使得反应池中饱和氧气、通氮气使得待测反应池中无氧气，在含有电化学活化过的反应池中加入5毫摩尔/升的葡萄糖，在室温25±1℃条件下用循环伏安法进行操作，对比溶液中饱和溶解氧及溶液中没有氧气的情况，其结果如图7所示，有无氧气的存在不会引起响应峰值信号及电位的改变，这一结果正是葡萄糖脱氢酶的优势所在既葡萄糖脱氢酶及突变体在催化过程中，不受溶解氧的约束，克服了氧气对实验结果的干扰。
(3)所制备的电极稳定性测试
对于生物传感器和生物反应器来说，稳定性是最重要的特性之一。对上述所构建的电化学传感器进行储存稳定性测试，将所制备的电极储存在4℃冰箱内，每隔7天测量一次峰值电流变化，检测条件为：pH为7的50mM PBS为电解液，扫描速率为0.05V/s，室温25±1℃条件下用循环伏安法进行操作，其结果如图8所示，对氧化峰值响应电流进行分析，在经过28天的储存后，较第一天仍有92.35％的峰值电流，结果表明本发明中GDH-N37T为识别元件构建的电极具有储存稳定性，可进一步用于葡萄糖生物传感器研究。
实施例5
(1)葡萄糖检测标准曲线的绘制
配制不同浓度的葡萄糖水溶液，依次加入在葡萄糖，以已制备的电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，所述参比电极为Ag/AgCl，与上海辰华CHI650C电化学工作站，以pH为7的50mM PBS缓冲液为电解液，在室温25±1℃条件下进行线性伏安法操作。静置时间为40s，以不添加葡萄糖待测液为空白，记录电化学响应信号与葡萄糖的浓度之间的关系，1mM-100mM的葡萄糖浓度范围内，峰值电流的变化值与葡萄糖的浓度呈线性关系，结果如图9所示，回归方程为I(μA)＝0.0507C(μM)+0.4713，R2＝0.993
(2)发酵液中的葡萄糖溶液测定
上述所制备的电极对发酵液中的葡萄糖含量进行测定，将含有葡萄糖的发酵液进行过滤和离心处理，以高效液相色谱法检测作为对比。实际样品检测时，需要对样品进行稀释，加入缓冲液调节pH为中性，测量得电化学响应信号通过线性回归方程进行计算待检测样品中葡萄糖的浓度。
每个样品平行测定3次，以不添加葡萄糖待测液为空白，得到峰值变化电流平均值为3.63μA，代入线性回归方程上述回归方程，计算出20稀释后发酵液中葡萄糖的平均含量为0.1137g。
计算出待测样品中葡萄糖含量为2.274g,与高效液相色谱法对比，其误差是7.2％，5次平行测定的相对标准偏差RSD值为0.46％
综上所述,在基于葡萄糖脱氢酶所制备的葡萄糖生物传感器在纳米材料的选择和相容性测试上具有一定的优势，在本发明中大大地提高了葡萄糖生物传感器的稳定性，发酵液中葡萄糖的在线监测提供了一种新型思路。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.葡萄糖脱氢酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因的重组载体。
4.使用权1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因或权3所述的重组载体转化的基因工程菌。
5.权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体基因、权利要求3所述的重组载体和权利要求4所述的基因工程菌在在制备葡萄糖脱氢酶中的应用。
6.一种葡萄糖脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于，培养权利要求4所述的基因工程菌，从而获得葡萄糖脱氢酶突变体。
7.权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶突变体在葡萄糖检测用生物传感器中的应用。
8.葡萄糖检测用生物传感器，其特征在于，包含有权利要求2所述的葡萄糖脱氢酶突变体。
9.如权利要求8所述的葡萄糖检测用生物传感器，其特征在于，以多壁碳纳米管作为载体，聚乙二醇作为分散剂，全氟磺酸膜作为成膜材料制成。
10.一种葡萄糖检测用生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1)将mPEG、MWCNTs和GDH分别溶于超纯水中，配制成水溶液；
步骤2)将mPEG和MWCNTs的水溶液以1：4-8的比例混合常温下孵育4-8小时；
步骤3)将步骤2)的mPEG和MWCNTs混合液超声混匀，以滴落涂布法将混合液滴加在活化好的玻碳电极电极中心，干燥成膜；
步骤4)分别配制GDH和NADP，将二者等比例混合，取4μL于步骤3)制成的电极上，干燥塔中反应后得到葡萄糖脱氢酶膜；
步骤5)将Nafion覆盖于步骤4)制成的电极上，从而制得NF/GDH/mPEG-MWCNTs/GCE；
步骤6)以步骤5)已制备的NF/GDH/mPEG-MWCNTs/GCE电极作为工作电极，对电极为铂丝电极，所述参比电极为Ag/AgCl，与电化学工作站形成一套完整的电化学传感器。
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