CN116041300B - 一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种2,2‑二甲基苯并吡喃类衍生物及其制备方法和应用，属于医药化学技术领域。本发明运用拼合原理、生物电子等排、基团替换策略设计新型结构2,2‑二甲基苯并吡喃甲酰胺类SPU‑ZD系列化合物和2,2‑二甲基苯并吡喃丙烯酰胺类SPU‑D系列化合物，经实验证实，对小鼠小胶质细胞BV2的自由基清除效率高，副作用小，抑制炎症因子效力强，抗氧化应激能力好，能够用于制备神经保护、治疗缺血性脑卒中等疾病的药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药化学技术领域，尤其涉及一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
脑卒中(Stroke)，又称为中风，每年脑卒中全球患病和死亡人数分别为1370万人和550万人，是全球第二大最常见的死亡原因(Lancet Neurology,2019,18,439-458)。流行病学调查估计每4名成年人中就有1名会发生脑卒中，全球目前有8000万名中风患者。脑卒中给社会和家庭带来了沉重的经济和精神负担，而且随着人口老龄化，这种负担将在未来20年内大大增加。根据脑卒中病理学特征，脑卒中分为缺血性脑卒中(Ischemic stroke)和出血性脑卒中(Haemorrhagic stroke)。出血性脑卒中因出血位置不同主要分为脑内出血和蛛网膜下腔出血。缺血性脑卒中主要由动脉闭塞引起，占脑卒中总数的71％(NewEngland Journal of Medicine,2018,379,2429-2437)。
脑动脉阻塞导致严重的氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)，引发了一系列细胞和分子事件，从而导致不可逆的脑损伤(Journal of Neuropathology andExperimental Neurology,2017,76,548-561)。神经元更容易受到缺氧的影响，在缺血性卒中后迅速失调或死亡(Metabolic Brain Disease,2020,35(1):31-43)。缺血后，OGD引起线粒体功能障碍，导致ATP耗竭和大量活性氧(Reactive oxidative species,ROS)产生。与其它脑细胞相比，神经元对能量的需求更高，但对能量储备不足。ATP耗竭后会引发局部缺血级联反应，包括离子泵衰竭、钠离子、氯离子和水分子的内流，细胞内钾离子外排和膜去极化。神经元在缺血性卒中后无法维持其正常的跨膜离子梯度和体内稳态，进而引发多种病理过程，包括兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化和硝化应激、酸中毒、Ca2+超载、蛋白质错误折叠、炎症、DNA损伤、凋亡等。这些病理生理过程会对神经元、神经胶质细胞和内皮细胞产生有害作用，并且通过正反馈回路相互激活，从而导致神经细胞死亡(Medical GasResearch.2016,6,227-231)。
根据缺血性脑卒中的病理特点，缺血性脑卒中最有效的治疗方法是恢复血栓或栓塞所阻塞的脑动脉血流量。目前临床治疗缺血性脑卒中的策略主要集中在两个方面：一是改善供血，通过溶栓、血栓切除、抗凝血、抗血小板聚集、扩张血管、血管重构、建立侧支循环和调节血液状态等治疗策略，恢复和促进脑缺血区血液供应(Lancet Neurology,2008,7,981-982)；二是保护神经细胞的结构和功能，通过药物阻断神经细胞死亡的级联反应，减轻缺血引起的神经细胞损伤，提高损伤神经细胞的功能恢复(Expert Opinion onInvestigational Drugs,2015,24,1137-1142)。但是，在实际临床应用中，围绕上述两种治疗策略开发的药物却非常有限。因此临床干预治疗策略显得尤为重要，根据卒中发生的时间，治疗方法主要分为对急性卒中的干预和预防卒中发生和复发的预防体系。
从补骨脂种子中提取分离得到的2,2-二甲基苯并吡喃类化合物具有非常广泛的生物活性，如神经保护、抗癌、抗菌、抗病毒等。已有多项研究证实含苯并吡喃类化合物对谷氨酸诱导的HT22neurocyte具有神经保护活性(Bioorganic&Medicinal Chemistry,2009,17,6432-6441)。Gong等通过组合化学的方法合成了6-氨基-2,2-二甲基-3,4,6-三取代苯并吡喃衍生物，其中化合物13在脂质过氧化诱导的损伤模型中具有较好的生物活性，其IC50为0.12μM(US20040097580Al.2004-05-20)。研究新型2,2-二甲基苯并吡喃衍生物用于缺血性脑卒中的治疗具有值得期望的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物及其制备方法和应用，所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物对小鼠小胶质细胞BV2的自由基清除效率高，副作用小，抑制炎症因子效力强，抗氧化应激能力好，能够用于制备神经保护、治疗缺血性脑卒中等疾病的药物。
本发明提供了一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，本发明运用拼合原理、生物电子等排、基团替换等策略设计2,2-二甲基苯并吡喃甲酰胺类SPU-ZD系列化合物和2,2-二甲基苯并吡喃丙烯酰胺类SPU-D系列化合物，所设计的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物活性更强，毒性相对减弱，可以通过清除自由基，抑制BV细胞产生NO，减少炎症细胞因子IL-6、TNF-α的产生，从而发挥神经保护作用，有望用于抗脑卒中的治疗。
本发明提供的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物可用于制备神经保护剂，对于缺血性脑卒中具有较好的神经保护作用。
本发明提供了所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物的制备方法，式I的制备主要以对羟基苯甲酸甲酯为原料，经溴代、成醚、[3,3]-σ重排环、与多种取代的芳基硼酸经Suzuki-Miyaura偶联得到联苯中间体，然后经水解、酰化等反应得到。式Ⅱ的制备主要以对羟基苯甲酸甲酯为原料，经溴代、成醚、[3,3]-σ重排环、还原、Knoevenagel缩合、酰化和Suzuki-Miyaura偶联等反应得到。本发明运用拼合原理、生物电子等排、基团替换策略设计新型结构2,2-二甲基苯并吡喃甲酰胺类SPU-ZD系列化合物和2,2-二甲基苯并吡喃丙烯酰胺类SPU-D系列化合物，经实验证实，对小鼠小胶质细胞BV2的自由基清除效率高，副作用小，抑制炎症因子效力强，抗氧化应激能力好，能够用于制备神经保护、治疗缺血性脑卒中等疾病的药物。
附图说明
图1为OGD在50μM时诱导SPU化合物的细胞活力；
图2为OGD在不同浓度下诱导SPU化合物的细胞活性；
图3为化合物SPU-D17的血浆浓度-时间曲线；
图4为化合物SP-D17对小鼠体重的影响；
图5为化合物SPU-D17对器官指数的影响。
具体实施方式
一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，其特征在于，具有式I或式II所示结构：
式I和式II中，Ar1为取代或未取代的5～10元芳基、取代或未取代的5～10元杂芳基，所述杂芳基中杂原子包括N、O和S中的一个或几个；所述Ar1中取代所用取代基独立为C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、卤素、-OH、-NH2、-NO2、-CN、-CR3、-OR、-SR、-N(R)2、-C(O)R、-CO2R、-C(O)C(O)R、-C(O)CH2C(O)R、-S(O)R、-S(O)2R、-C(O)N(R)2、-SO2N(R)2、-OC(O)R、-N(R)C(O)R、-N(R)N(R)2或5～10元芳基；其中R为H、取代或未取代的C1～C6烷基、取代或未取代的C1～C6环烷基；
R1为C1～C6烷基、取代或未取代的C1～C6环烷基、取代或未取代的C1～C6杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基；所述R1中取代所用取代基独立为羟基、氨基、硝基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、C1～C6环烷氧基、C1～C6环烷基、取代或未取代的2-吡啶酮；所述2-吡啶酮的取代基为羟基、氨基、硝基、C1～C6烷氧基、C1～C6烷基、C1～C6环烷氧基、C1～C6环烷基或含有C1～C6六元杂环的取代或未取代的芳基；
X和Y独立为单键或双键。
在本发明中，所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物优选还包括所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物药学上可接受的盐。本发明对所述药学上可接受的盐的种类没有特殊的限定，本领域熟知的相应盐即可。
在本发明中，所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物优选包括8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD01)、N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶基-3-基)甲基]-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD02)、8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-N-[(2-氧代-2,5,6,7-四氢-1H-环戊[b]吡啶-3-基)甲基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD03)、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD04)、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD05)、N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD06)、8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD07)、N-(2-甲氧基苯基)-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD08)、N-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD09)、[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基][8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]甲酮(SPU-ZD10)、(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D01)、(E)-3-[8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D02)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D03)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-4-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D04)(E)-4-(6-{3-[(4-甲氧基苯基)氨基]-3-氧代丙-1-烯-1-基}-2,2-二甲基-2H-色烯-8-基)苯甲酸甲酯(SPU-D05)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(嘧啶-5-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D06)、(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D07)、(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D08)、(E)-3-{2,2-二甲基-8-[4-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-基}-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D09)、(E)-3-{2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-基}-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D10)、(E)-3-[8-(4-羟基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D11)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(2,4,6-三氟苯基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D12)、(E)-3-[8-(4-氟苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D13)、(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D14)、3-{2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]苯并吡喃-6-基}-N-(4-羟基苯基)丙酰胺(SPU-D15)、(E)-3-[8-(3-氯苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D16)、(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D17)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D18)、(E)-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D19)、(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D20)、(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D21)、(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D22)、(E)-3-[8-(4-羟基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D23)、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D24)、(E)-3-[8-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D25)、(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D26)或(E)-3-[8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D27)或(E)-3-[8-(3-三氟甲基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D28)，结构式具体如下式所示：
本发明提供了上述技术方案所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物的制备方法，包括以下步骤：
当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物具有式I所示结构时：
将化合物1进行第一卤代反应，得到化合物2；
将化合物3进行第二卤代反应，得到化合物4；
将所述化合物2和化合物4进行取代反应，得到化合物5；
将所述化合物5进行重排反应，得到化合物6；
将所述化合物6与化合物7进行偶联反应，得到化合物8；
将所述化合物8进行水解反应，得到化合物9；
将所述化合物9与化合物10进行酰化反应，得到具有式I所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物7的结构式为所述化合物8的结构式为/>
所述化合物9结构式：
所述化合物10的结构式为R1NH2；
当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物具有式Ⅱ所示结构时：
1)当X和Y均为双键时：
将化合物6进行还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物13的结构式为
2)当X和Y均为单键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到化合物14；
将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物14的结构式为
3)当X为单键、Y为双键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到化合物14；
将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式(Ⅱ)所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
4)当X为双键、Y为单键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物15；
将所述化合物15进行第二还原反应，得到化合物16；
将所述化合物16进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物17；
将所述化合物17与化合物10进行酰化反应，得到化合物18；
将所述化合物18与化合物7进行偶联反应，得到具有式(Ⅱ)所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物18的结构式为
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物具有式I所示结构时：
将化合物1进行第一卤代反应，得到化合物2；
将化合物3进行第二卤代反应，得到化合物4；
将所述化合物2和化合物4进行取代反应，得到化合物5；
将所述化合物5进行重排反应，得到化合物6；
将所述化合物6与化合物7进行偶联反应，得到化合物8；
将所述化合物8进行水解反应，得到化合物9；
将所述化合物9与化合物10进行酰化反应，得到具有式I所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物7的结构式为所述化合物8的结构式为/>
所述化合物9结构式：
所述化合物10的结构式为R1NH2；
本发明将化合物1进行第一卤代反应，得到化合物2。
在本发明中，所述第一卤代反应优选在铜粉、氯化亚铜和浓盐酸(浓度为20～38wt％)存在条件下进行，所述化合物1、铜粉、氯化亚铜和浓盐酸的摩尔比优选为1:0.05:0.05:7，所述第一卤代反应的温度优选为-40～10℃，更优选为-15℃，时间优选为2～16h，更优选为6h。完成所述第一卤代反应后，本发明优选将所得反应液静置，分出上层，上层用水洗，饱和食盐水洗，采用粒装无水氯化钙干燥，得到化合物2。
本发明将化合物3进行第二卤代反应，得到化合物4。
本发明优选将化合物3、卤素和溶剂混合，进行第二卤代反应；所述卤素优选为溴；所述化合物3和卤素的摩尔比优选为(1.8～2.2)：1，更优选为1：1；所述溶剂优选为二氯甲烷或四氢呋喃，更优选为二氯甲烷；所述第二卤代反应的温度优选为-40～10℃，更优选为0℃，时间优选为16～32h，更优选为24h。完成所述第二卤代反应后，本发明优选在冰浴条件下，向所得反应液中滴加饱和硫代硫酸钠淬灭未反应的卤素，至反应液变白；固体抽滤，滤饼用少量的溶剂洗涤后，水洗，干燥；滤液用水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，合并固体，得到化合物4。
得到化合物2和化合物4后，本发明将所述化合物2和化合物4进行取代反应，得到化合物5。
在本发明中，所述化合物2和化合物4的摩尔比优选为1：(1～6)，更优选为1：4。在本发明中，所述取代反应优选在碳酸钾、KI、PEG600、分子筛和溶剂存在条件下进行；所述溶剂优选为丙酮；所述化合物2、碳酸钾、KI、PEG600和/>分子筛的摩尔比优选为1:3:0.1:0.2:2。
在本发明中，所述取代反应优选在氩气保护条件下进行，所述取代反应的时间优选为20～56h，更优选为48h。完成所述取代反应后，本发明优选将所得产物冷却至室温后抽滤，滤饼用丙酮洗，滤液经减压浓缩除去丙酮，向残余物中加水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，用饱和碳酸钠水溶液洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得到化合物5。
得到化合物5后，本发明将所述化合物5进行重排反应，得到化合物6。
在本发明中，所述重排反应优选在N,N-二甲基苯胺为溶剂条件下进行；所述重排反应的温度优选为100～210℃，更优选为190℃，时间优选为6～24h，更优选为12h。完成所述重排反应后，本发明优选将所得产物冷却至室温后，加入6N盐酸，乙酸乙酯萃取，有机层用6N盐酸洗，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到化合物6。
得到化合物6后，本发明将所述化合物6与化合物7进行偶联反应，得到化合物8。
在本发明中，所述化合物6和化合物7的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1：1.4；所述偶联反应优选在Pd(PPh3)4、碳酸钾、溶剂和氩气存在条件下进行；所述溶剂优选为水和1,4-二氧六环；所述化合物6、Pd(PPh3)4、碳酸钾、水和1,4-二氧六环的用量比优选为1mol:0.08mol:3mol:3mL:10mL。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为40～120℃，更优选为90℃，时间优选为4～36h，更优选为24h。完成所述偶联反应后，本发明优选将所得产物冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗，滤液加水，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到粗品；粗品依次经重结晶、乙醚打浆纯化，得到化合物8。
得到化合物8后，本发明将所述化合物8进行水解反应，得到化合物9。
在本发明中，所述水解反应优选在碱性条件下进行，更优选为NaOH条件；所述碱性条件的pH值优选为13；所述水解反应所用溶剂优选为甲醇或乙醇-水，更优选为乙醇-水；本发明对所述乙醇与水的体积比优选为7:3。在本发明中，所述水解反应的温度优选为40～120℃，更优选为70℃，时间优选为1～12h，更优选为3h。完成所述水解反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温后，冰浴下滴加浓盐酸调pH值至4，抽滤，滤饼用水洗，干燥，得到化合物9。
得到化合物9后，本发明将所述化合物9与化合物10进行酰化反应，得到具有式I所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
在本发明中，所述化合物9和化合物10的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1:1；所述第一酰化反应优选在EDCI、HOBT和三乙胺存在条件下进行；所述化合物9、EDCI、HOBT和三乙胺的摩尔比优选为1:1.5:1.5:5。在本发明中，所述酰化反应所用溶剂优选为干燥的四氢呋喃或干燥的二氯甲烷，更优选为干燥的二氯甲烷。在本发明中，所述酰化反应的温度优选为0～50℃，更优选为25℃，时间优选为4～36h，更优选为24h。完成所述酰化反应后，本发明优选将所得反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到粗品。根据纯度情况进行柱层析，粗品经重结晶或乙醚打浆分离纯化，得到具有式I所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，即为SPU-ZD01～SPU-ZD10。
在本发明中，当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物具有式I所示结构时，反应路线为：
在本发明中，当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物具有式Ⅱ所示结构时：
1)当X和Y均为双键时：
将化合物6进行还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物13的结构式为
本发明将化合物6进行还原反应，得到化合物11。
在本发明中，所述还原反应所用还原剂优选为DIBAL-H，所用催化剂优选为吗啉；所用溶剂优选为四氢呋喃；所述化合物6、还原剂、催化剂和溶剂的用量比优选为1moL:2moL:2moL:100mL；所述还原反应的温度优选为-40～25℃，更优选为-15℃，时间优选为0.5～12h，更优选为1h。完成所述还原反应后，本发明优选将所得产物置于冷肼-15℃中，将反应液缓慢分批加入到6N盐酸中，放热剧烈，反应液用乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到化合物11。
得到化合物11后，本发明将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；本发明优选将所述化合物11与丙二酸进行Knoevenagel缩合反应；所述化合物11和丙二酸的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1：2。所述Knoevenagel缩合反应优选在哌啶和吡啶存在条件下进行；所述Knoevenagel缩合反应所用溶剂优选为甲苯；所述化合物11、哌啶、吡啶和溶剂的用量比优选为1moL:2moL:10moL:1mL。
在本发明中，所述Knoevenagel缩合反应的温度优选为0～110℃，更优选为110℃，时间优选为1～24h，更优选为3h。完成所述Knoevenagel缩合反应后，本发明优选将所得反应液冷却至室温后，于冰浴下缓慢倒入6N盐酸中，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，加入乙醚打浆，得到化合物12。
得到化合物12后，本发明将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13。
在本发明中，所述化合物12和化合物10的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1：1；所述酰化反应优选在EDCI、HOBT和三乙胺存在条件下进行；所述化合物12、EDCI、HOBT和三乙胺的摩尔比优选为1:1.5:1.5:5。在本发明中，所述酰化反应的温度优选为0～50℃，更优选为25℃，时间优选为4～36h，更优选为24h。在本发明中，所述第一酰化反应所用溶剂优选为干燥的二氯甲烷或四氢呋喃，更优选为干燥的二氯甲烷。
完成所述酰化反应后，本发明优选将所得反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到粗品。根据纯度情况进行柱层析，粗品经重结晶或乙醚打浆分离纯化，得到化合物13。
得到化合物13后，本发明将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，具有式II所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
在本发明中，所述化合物13和化合物7的摩尔比优选为1：(1～3)，更优选为1：1.4；所述偶联反应优选在Pd(PPh3)4、碳酸钾和氩气存在条件下进行；所述偶联反应所用溶剂优选为水和1,4-二氧六环；所述化合物13、Pd(PPh3)4和碳酸钾的摩尔比优选为1:0.08:3。本发明对所述溶剂的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整保证反应顺利进行即可。在本发明中，所述偶联反应的温度优选为40～120℃，更优选为90℃，时间优选为4～36h，更优选为24h。完成所述偶联反应后，本发明优选将所得产物冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗，滤液加水，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到粗品，粗品经重结晶、乙醚打浆纯化，得到具有式II所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，即SPU-D01～SPU-D14,SPU-D16～SPU-D28。
在本发明中，当X和Y均为双键时，具有式II所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物的反应路线为：
2)当X和Y均为单键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到化合物14；
将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物14的结构式为
本发明当X和Y均为单键时：第一还原反应、Knoevenagel缩合反应、酰化反应和偶联反应的过程与X和Y均为双键时相同，在此不再赘述。
偶联反应后，得到化合物14；将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
在本发明中，所述第二还原反应所用还原剂优选为H2，所用催化剂优选为Pd/C；所述化合物14和催化剂的摩尔比优选为1:0.1；本发明对所述还原剂的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整保证反应顺利进行即可。所述第二还原反应优选在无水乙醇为溶剂条件下进行。在本发明中，所述第二还原反应的温度优选为25～70℃，更优选为60℃，时间优选为10～15h，更优选为12h。第二还原反应后，本发明优选待反应液冷却至室温后，抽滤，滤液经减压浓缩，将所得剩余物与乙酸乙酯混合后打浆，将打浆后所得体系进行抽滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，干燥后，得到具有式II所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，即SPU-D15。
在本发明中，当X,Y均为单键时，具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类的反应路线为：
3)当X为单键、Y为双键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到化合物14；
将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式(Ⅱ)所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
第一还原反应、Knoevenagel缩合反应、酰化反应和偶联反应的过程与X和Y均为双键时相同，在此不再赘述。
偶联反应后，得到化合物14，将所述化合物14进行第二还原反应，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
在本发明中，所述第二还原反应所用还原剂优选为H2，所用催化剂优选为Pd/C；所述；所述化合物14和催化剂的摩尔比优选为1:0.1；本发明对所述还原剂的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整保证反应顺利进行即可。第二还原反应优选在无水乙醇为溶剂条件下进行。在本发明中，所述第二还原反应的温度优选为0～25℃，更优选为25℃，时间优选为4～8h，更优选为6h。第二还原反应后，本发明优选直接将反应液抽滤，滤液经减压浓缩，将所得剩余物与乙酸乙酯混合后打浆，将打浆后所得体系进行抽滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗，干燥后，得到具有式Ⅱ所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
4)当X为双键、Y为单键时：
将化合物6进行第一还原反应，得到化合物15；
将所述化合物15进行第二还原反应，得到化合物16；
将所述化合物16进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物17；
将所述化合物17与化合物10进行酰化反应，得到化合物18；
将所述化合物18与化合物7进行偶联反应，得到具有式(Ⅱ)所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物18的结构式为
本发明将化合物6进行第一还原反应，得到化合物15；所述第一还原反应所用还原剂优选为H2，所用催化剂优选为Pd/C；所述化合物6和催化剂的摩尔比优选为1:0.1；本发明对所述还原剂的用量没有特殊的限定，根据实际需求调整保证反应顺利进行即可。所述第一还原反应优选在无水乙醇为溶剂条件下进行。在本发明中，所述第一还原反应的温度优选为0～25℃，更优选为25℃，时间优选为4～8h，更优选为6h。第一还原反应后，本发明优选直接将反应液抽滤，滤液经减压浓缩，将所得剩余物与乙醚混合后打浆，将打浆后所得体系进行抽滤，滤饼用乙醚淋洗，干燥后得到化合物15。
得到化合物15后，本发明将所述化合物15进行第二还原反应，得到化合物16。
在本发明中，所述第二还原反应所用还原剂优选为DIBAL-H，所用催化剂优选为吗啉；所述化合物15、还原剂和催化剂的摩尔比优选为1:2:2；在本发明中，所述第二还原反应的溶剂优选为干燥的四氢呋喃；所述第二还原反应的温度优选为-40～25℃，更优选为-15℃，时间优选为0.5～12h，更优选为1h。完成所述第二还原反应后，本发明优选将所得产物置于冷肼-15℃中，将反应液缓慢分批加入到6N盐酸中，放热剧烈；反应液用乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，得到化合物16。
得到化合物16后，本发明将所述化合物16进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物17。本发明优选将化合物16与丙二酸进行Knoevenagel缩合反应，所述Knoevenagel缩合反应优选与上述方案相同，在此不再赘述。
得到化合物17后，本发明将所述化合物17与化合物10进行酰化反应，得到化合物18。
在本发明中，所述化合物17和化合物10进行酰化反应的过程优选与化合物12与化合物10进行酰化反应的过程相同，在此不再赘述。
得到化合物18后，本发明将所述化合物18与化合物7进行偶联反应，得到具有式II所示结构的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物。
本发明中，所述化合物18和化合物7进行偶联反应的过程优选与化合物13与化合物7进行偶联反应的过程相同，在此不再赘述。
本发明提供了上述技术方案所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物或上述技术方案所述制备方法制备得到的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物在制备神经保护药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。
在本发明中，所述神经保护药物的类型优选包括抗氧化应激、抗炎或减少NO生成药物。
在本发明中，所述神经保护药物优选包括治疗缺血性脑卒中药物或神经炎症性药物。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
化合物合成部分
化合物的熔点采用X-4型数字熔点测定仪测定，温度计未经校正。核磁共振1H-NMR采用Bruker ARX-400核磁共振仪测定，TMS为内标。液质(LC-MS-ESI)采用Agilent1100SeriesMSD Trap(SL)测定，气质(GC-MS-ESI)采用Agilent 6890-5975GC-MS测定。所用试剂均为分析纯。
实施例
1)3-氯-3-甲基丁-1-炔(化合物2)的合成
向1000mL三口瓶中加入浓盐酸(600mL,7.18mol)，铜粉(4.0g,47.24mmol)，氯化亚铜(5.0g,50.51mmol)，加毕后移置冷肼降温至-15℃以下，分批加入氯化钙粉末(150g,1.35mol)，加毕后滴加2-甲基丁-3-炔-2-醇(125mL,1.28mol)，3h滴毕，滴毕后升温至0℃，继续搅拌6h后停止反应，反应液静置，分出上层，上层用水洗(50mL×2)，饱和食盐水洗(50mL)，粒装无水氯化钙干燥，得无色透明液体111g，收率85％。
2)3-溴-4-羟基苯甲酸甲酯(化合物4)的合成
向1000mL三口瓶中加入对羟基苯甲酸甲酯3(40.0g,0.26mol)，二氯甲烷(400mL)，冰盐浴降温至0℃以下，缓慢滴加溴素(14.9mL,0.29mol)，控温不超过5℃。2h滴加完毕，于室温下继续搅拌。TLC监测，24h后反应完全。停止反应，冰浴降温至0℃，向反应液中滴加饱和硫代硫酸钠淬灭未反应的溴素，至反应液变白。固体抽滤，滤饼用少量的二氯甲烷洗，水洗，干燥。滤液用水洗(40mL×2)，饱和食盐水洗(40mL)，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，合并固体共得到白色固体57.0g，收率92％，m.p.106-108℃。
3)3-溴-4-[(2-甲基丁-3-炔-2-基)氧基]苯甲酸甲酯(化合物5)的合成
向500mL单口瓶中加入3-溴-4-羟基苯甲酸甲酯4(30.0g,0.13mol)，3-氯-3-甲基丁-1-炔2(53.0g,0.52mol)，碳酸钾粉末(72.0g,0.52mol)，PEG600(15.6g,0.026mol)，KI(4.4g,0.026mol)，分子筛(5.0g)，丙酮(400mL)，氩气保护下回流反应36h，TLC显示基本反应完全，停止反应，冷却至室温后抽滤，滤饼用丙酮洗，滤液经减压浓缩除去丙酮，向残余物中加水(100mL)，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机层，用饱和碳酸钠水溶液洗(50mL×2)，水洗(50mL×2)，饱和食盐水洗(50mL)，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得到22g棕黑色油状物，不进行纯化直接用于下一步。
4)8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酸甲酯(化合物6)的合成
向250mL单口瓶中加入3-溴-4-[(2-甲基丁-3-炔-2-基)氧基]苯甲酸甲酯5(22.0g,0.070mol)，N,N-二甲基苯胺(15mL)，砂浴加热至190℃，搅拌12h，停止反应。放置室温后，加入6N盐酸(100mL)，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，有机层用6N盐酸洗(50mL×3)，水洗(50mL×2)，饱和食盐水洗(50mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到棕黑色油状物。1.5倍硅胶拌样，5倍硅胶装柱，洗脱剂为石油醚→乙酸乙酯：石油醚(1:100)得到棕色油状物15.0g，两步收率为39％。
5)8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸甲酯(化合物8a)的合成
向100mL单口瓶中加入8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-羧酸甲酯6(1.0equiv.)，芳基硼酸(1.4equiv.)，Pd(PPh3)4(0.08equiv.)，碳酸钾粉末(3.0equiv.)，水(3mL)，1,4-二氧六环(10mL)，氩气保护，90℃反应24h，TLC显示溴代物原料反应完全，停止反应，冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机层，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到黄色油状物(2.60g)，未经纯化直接用于下一步。
6)2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-甲基-6-羧酸甲酯(化合物8b)的合成
向100mL单口瓶中加入8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-羧酸甲酯6(1.0equiv.)，吡啶-3-硼酸(1.4equiv.)，Pd(PPh3)4(0.08equiv.)，碳酸钾粉末(3.0equiv.)，水(3mL)，1,4-二氧六环(10mL)，氩气保护，90℃反应24h，TLC显示溴代物原料反应完全，停止反应，冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机层，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩，粗品经乙腈重结晶得到黄色固体(0.47g,29％)。
7)2,2-二甲基-8-(3-(三氟甲氧基)苯基)-2H-甲基-6-羧酸甲酯(化合物8c)的合成
向100mL单口瓶中加入8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-羧酸甲酯6(1.0equiv.)，3-三氟甲基苯基硼酸(1.4equiv.)，Pd(PPh3)4(0.08equiv.)，碳酸钾粉末(3.0equiv.)，水(3mL)，1,4-二氧六环(10mL)，氩气保护，90℃反应24h，TLC显示溴代物原料反应完全，停止反应，冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机层，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩,粗品经乙醚/石油醚混合溶剂打浆得到米黄色固体(0.41g,51％)。
8)8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸甲酯(化合物8d)的合成
向100mL单口瓶中加入8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-羧酸甲酯6(1.0equiv.)，3,5-二甲氧基苯基硼酸(1.4equiv.)，Pd(PPh3)4(0.08equiv.)，碳酸钾粉末(3.0equiv.)，水(3mL)，1,4-二氧六环(10mL)，氩气保护，90℃反应24h，TLC显示溴代物原料反应完全，停止反应，冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机层，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩,粗品经乙醚/石油醚混合溶剂打浆得到米黄色固体(0.41g,51％)。
9)8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸(化合物9a)的合成
向100mL单口瓶中加入8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸甲酯原料(1.0equiv.)，2M氢氧化钠(10.0equiv.)，乙醇(5mL)，升温至70℃反应3h后，TLC显示反应完全。停止反应，反应液冷却至室温后倒入烧杯中，冰浴下滴加浓盐酸调pH至4，抽滤，滤饼用水洗，干燥，得到得到白色固体0.87g，两步收率52％；
10)2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-甲基-6-羧酸(化合物9b)的合成
向100mL单口瓶中加入2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-甲基-6-羧酸甲酯原料(1.0equiv.)，2M氢氧化钠(10.0equiv.)，乙醇(5mL)，升温至70℃反应3h后，TLC显示反应完全。停止反应，反应液冷却至室温后倒入烧杯中，冰浴下滴加浓盐酸调pH至4，抽滤，滤饼用水洗，干燥，得白色固体0.42g，收率93％；
11)2,2-二甲基-8-(3-(三氟甲氧基)苯基)-2H-甲基-6-羧酸(化合物9c)的合成
向100mL单口瓶中加入2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-甲基-6-羧酸甲酯原料(1.0equiv.)，2M氢氧化钠(10.0equiv.)，乙醇(5mL)，升温至70℃反应3h后，TLC显示反应完全。停止反应，反应液冷却至室温后倒入烧杯中，冰浴下滴加浓盐酸调pH至4，抽滤，滤饼用水洗，干燥，白色固体0.35g，收率90％；
12)8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸(化合物9d)的合成
向100mL单口瓶中加入8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-甲基-6-羧酸甲酯原料(1.0equiv.)，2M氢氧化钠(10.0equiv.)，乙醇(5mL)，升温至70℃反应3h后，TLC显示反应完全。停止反应，反应液冷却至室温后倒入烧杯中，冰浴下滴加浓盐酸调pH至4，抽滤，滤饼用水洗，干燥，得白色固体0.27g，两步收率35％。
实施例1
8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD01)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.20g,0.64mmol)和3-甲氧基苯胺为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经柱层析分离得到为灰色固体(73mg,27.4％)，m.p.138～139℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.79(s,1H),7.66(d,J＝1.9Hz,1H),7.52-7.51(m,3H),7.32(t,J＝8.0Hz,1H),7.14-7.13(m,2H),6.90-6.87(m,3H),6.40(d,J＝9.8Hz,1H),5.70(d,J＝9.8Hz,1H),3.83(s,3H),3.79(s,3H),1.45(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)165.1,159.1,156.4,152.7,138.5,131.3,129.3,129.0,128.9,127.1,125.0,122.1,122.0,121.7,127.6,114.8,114.1,113.0,77.4,55.4,55.2,28.0.HRMS(ESI)calcd for C26H25NO4Na[M+Na]+:438.1681,found:438.1684.
实施例2
N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶基-3-基)甲基]-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD02)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.20g,0.64mmol)和3-(氨基甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮为原料，按照通用合成方法三得到的粗品经柱层析分离得到为白色固体(97mg,32.9％)，m.p.201-203℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.94(brs,1H),7.60(s,1H),7.48(s,1H),7.28-7.25(m,1H),7.11-7.10(m,2H),6.86(dd,J＝9.8,2.1Hz,1H),6.37(d,J＝9.8Hz,1H),5.87(brs,1H),5.66(d,J＝9.7Hz,1H),4.60(brs,2H),3.88(s,3H),2.14(s,3H),1.42(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)167.6,166.3,159.1,152.2,138.7,132.2,131.0,130.8,128.9,128.8,128.7,128.6,127.3,125.0,122.3,121.8,121.4,114.6,112.9,94.9,77.1,56.1,55.1,33.5,30.5,28.0,19.1.HRMS(ESI)calcd forC27H28N2O5Na[M+Na]+:483.1896,found:483.1905.
实施例3
8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-N-[(2-氧代-2,5,6,7-四氢-1H-环戊[b]吡啶-3-基)甲基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD03)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.20g,0.64mmol)和3-(氨基甲基)-1,5,6,7-四氢-2H-环戊[b]吡啶-2-酮为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经柱层析分离得到白色固体(57mg,19.5％)。m.p.238-239℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.62(d,J＝2.0Hz,1H),7.56(t,J＝5.4Hz,1H),7.50(s,1H),7.45(d,J＝1.9Hz,1H),7.28-7.25(m,1H),7.11-7.10(m,2H),6.86-6.85(m,1H),6.36(d,J＝9.8Hz,1H),5.65(d,J＝9.8Hz,1H),4.47(d,J＝5.6Hz,2H),3.80(s,3H),2.75-2.68(m,4H),2.04-1.99(m,2H),1.42(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)166.7,164.7,159.1,152.4,138.6,138.2,131.1,129.1,129.0,128.8,126.8,124.9,124.8,122.2,121.7,121.4,120.4,114.7,112.9,77.2,55.1,40.6,30.9,29.6,28.0,22.9.HRMS(ESI)calcd for C28H28N2O4Na[M+Na]+:479.1947,found:479.1954.
实施例4
N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD04)的合成
当Ar1为吡啶，以羧酸9(0.30g,1.07mmol)和对甲氧基苯胺为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经柱层析分离得到白色固体(0.27g,65.9％)，m.p.123-125℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.80(d,J＝1.4Hz,1H),8.54-8.53(m,1H),8.14(s,1H),7.84(dt,J＝11.8,1.6Hz,1H),7.67(d,J＝2.0Hz,1H),7.56-7.53(m,3H),7.33-7.31(m,1H),6.88(d,J＝8.9Hz,2H),6.39(d,J＝9.8Hz,1H),5.71(d,J＝9.8Hz,1H),3.80(s,3H),1.43(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)165.0,156.4,152.8,149.9,148.0,136.6,133.0,131.5,131.1,129.0,127.5,125.7,125.6,123.0,122.1,121.8,121.7,114.1,77.8,55.4,28.0.HRMS(ESI)calcd for C24H23N2O3[M+H]+:387.1709,found:387.1712.
实施例5
N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD05)的合成
当Ar1为3-三氟甲基苯基，以羧酸9(0.20g,5.75mmol)和对甲氧基苯胺为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经柱层析分离得到白色固体(0.19g,73.1％)，m.p.203-205℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)7.88-7.85(m,2H),7.73(d,J＝7.6Hz,1H),7.70(s,1H),7.60(d,J＝7.7Hz,1H),7.54-7.51(m,4H),6.41(d,J＝9.8Hz,1H),5.72(d,J＝9.8Hz,1H),3.80(s,3H),1.45(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.9,156.5,152.7,137.7,132.4,131.5,131.0,130.3,130.1(J＝31.7Hz),129.0,128.5,127.9,127.3,126.3(J＝4.0Hz),125.3,124.2(J＝270.1Hz),123.8(J＝3.6Hz),122.1,121.9,121.7,121.5,114.1,77.7,55.4,28.0.HRMS(ESI)calcd for C26H22F3NO3Na[M+Na]+:476.1449,found:476.1451.
实施例6
N-[(4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基]-2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD06)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.20g,0.64mmol)和3-(氨基甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮，按照通用合成方法三，粗品经柱层析分离得到白色固体(0.13g,40.8％)，m.p.222-225℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)12.95(brs,1H),7.94(brs,1H),7.85(s,1H),7.69(d,J＝7.6Hz,1H),7.62(d,J＝1.7Hz,1H),7.56(d,J＝7.6Hz,1H),7.50-7.48(m,2H),6.36(d,J＝9.8Hz,1H),5.88(s,1H),5.68(d,J＝9.8Hz,1H),4.59(d,J＝4.9Hz,2H),3.88(s,3H),2.16(s,3H),1.42(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)166.2,166.1,152.1,145.9,138.0,132.4,131.2,130.1(J＝31.8Hz),128.8,128.4,127.7,127.5,126.3(J＝18.7Hz),125.3,124.2(J＝271.1Hz),123.6(J＝4.3Hz),122.0,121.4,103.3,94.7,77.4,56.0,33.6,27.9,19.0.HRMS(ESI)calcd for C27H25F3N2O4Na[M+Na]+:521.1664,found:521.1682.
实施例7
8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD07)的合成
当Ar1为3,5-二甲氧基苯基，，以羧酸9(0.25g,0.74mmol)和对甲氧基苯胺为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经乙腈重结晶得到白色固体(0.16g,48.5％)，m.p.200-202℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.77-7.75(m,1H),7.66(d,J＝1.9Hz,1H),7.52-7.51(m,3H),6.88(d,J＝8.8Hz,2H),6.72(d,J＝2.0Hz,2H),6.47(brs,1H),6.40(d,J＝9.8Hz,1H),5.71(d,J＝9.8Hz,1H),3.82(s,6H),3.80(s,3H),1.46(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ(ppm)165.0,160.3,156.4,152.7,139.0,131.3,131.1,129.3,128.8,127.0,125.1,122.1,122.0,121.7,114.1,107.4,99.7,77.4,55.4,55.3,28.1.HRMS(ESI)calcd for C27H28NO5[M+H]+:446.1967,found:446.1979.
实施例8
N-(2-甲氧基苯基)-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD08)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.20g,0.64mmol)和邻甲氧基苯胺为原料，按照通用合成方法三得到对应化合物，粗品经柱层析分离得到白色固体(37mg,12.7％)，m.p.107-109℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.51(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),8.45(s,1H),7.72(d,J＝2.1Hz,1H),7.54(d,J＝2.2Hz,1H),7.35(t,J＝8.2Hz,1H),7.18-7.17(m,2H),7.06(td,J＝9.1,7.8,1.4Hz,1H),7.01(t,J＝7.6Hz,1H),6.92-6.90(m,2H),6.45(d,J＝9.8Hz,1H),5.72(d,J＝9.8Hz,1H),3.91(s,3H),3.86(s,3H),1.47(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.9,159.3,152.9,148.2,138.6,131.4,129.4,129.2,129.0,128.0,127.6,125.0,123.7,122.2,121.9,121.8,121.7,121.2,120.0,114.9,113.2,109.9,77.5,55.8,55.3,28.2.HRMS(ESI)calcd for C26H25NO4Na[M+Na]+:438.1681,found:438.1684.
实施例9
N-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺(SPU-ZD09)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，以羧酸9(0.8g,2.58mmol)和2-甲氧基-5-氨基苯酚为原料，按照通用合成方法三得到白色固体(0.12g,10.8％)，m.p.108-110℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.65(d,J＝1.9Hz,1H),7.62(d,J＝10.9Hz,1H),7.52(s,1H),7.18-7.14(m,4H),6.91(dd,J＝9.1,1.8Hz,1H),6.83(d,J＝8.5Hz,1H),6.42(d,J＝9.7Hz,1H),5.71(d,J＝9.8Hz,1H),5.66(d,J＝8.5Hz,1H),3.88(s,3H),3.85(s,3H),1.46(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)165.1,159.3,152.9,145.9,143.6,138.6,132.0,131.5,129.4,129.0,127.2,125.0,122.2,121.8,114.9,113.2,112.1,111.0,107.8,77.5,56.2,55.3,28.1.HRMS(ESI)calcd for C26H25NO5Na[M+Na]+:454.1625,found:454.1642.
实施例10
[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基][8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]甲酮(SPU-ZD10)的合成
当Ar1为3-甲氧基苯基，向50mL三口瓶中加入羧酸9(0.20g,0.64mmol)，DMF(2滴)，干燥的二氯甲烷(10mL)，冰浴降温至0℃滴加草酰氯的二氯甲烷溶液(0.96mmol,4mL)，滴毕后室温反应30min。TLC反应完全，减压蒸馏除去剩余草酰氯，加入干燥的二氯甲烷(5mL)备用。
向50mL三口瓶中加入4-(羟苯基)哌嗪(0.12g,0.77mmol)，三乙胺(0.20g,1.92mmol)，干燥的二氯甲烷(20mL)，冰盐浴降温至-15℃滴加上述酰氯的二氯甲烷溶液，滴毕后继续于冰盐浴下搅拌30min，TLC监测反应完全。停止反应，将反应液倒入水中(20mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到0.21g棕色油状物，柱层析分离得到白色固体(38mg,12.7％)，m.p.198-200℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.33-7.28(m,2H),7.13-7.09(m,3H),6.89(d,J＝2.0Hz,1H),6.88(d,J＝2.2Hz,2H),6.76(d,J＝8.8Hz,2H),6.36(d,J＝9.8Hz,1H),5.72(brs,1H),5.69(d,J＝9.8Hz,1H),3.85(brs,4H),3.83(s,3H),3.04(brs,4H),1.44(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)170.3,159.1,151.2,150.8,144.8,138.5,131.4,129.5,129.1,128.9,127.4,125.1,122.2,122.0,121.7,119.2,115.9,114.8,112.9,77.1,55.2,51.4,47.9,42.8,28.0.HRMS(ESI)calcd for C29H30N2O4Na[M+Na]+:493.2103,found:493.2118.
8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲醛(化合物11)的合成
向500mL三口瓶中加入吗啉(8.9g,0.10mol)，干燥的四氢呋喃(100mL)，冷肼降温至0℃，滴加1M的DIBAL-H的甲苯溶液(60mL,0.10mol)，滴毕后于0℃继续搅拌3h。缓慢滴加酯(15.0g,0.05mol)的四氢呋喃溶液(50mL)，搅拌30min后缓慢滴加1M的DIBAL-H的甲苯溶液(180mL,0.30mol)。滴毕后继续搅拌30min，TLC显示反应完全，停止反应。于冷肼-15℃中，将反应液缓慢分批加入到6N盐酸中(300mL)，放热剧烈。反应液用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，水洗(20mL×2)，饱和食盐水洗(50mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到15.6g棕色油状物，5倍硅胶柱层析分离得到黄色油状物(4.62g,34％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)9.78(brs,1H),7.87-7.86(m,1H),7.45-7.44(m,1H),6.35(d,J＝9.9Hz,1H),5.74(d,J＝9.9Hz,1H),1.52(s,6H).
(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)丙烯酸(化合物12)的合成
向100mL单口瓶中加入8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲醛11(4.87g,18.3mmol)，丙二酸(3.24g,31.1mmol)，哌啶(4mL)，吡啶(15mL)，甲苯(10mL)，分水器带水回流反应。3h后TLC反应完全，停止反应，将反应液冷却至室温后，于冰浴下缓慢倒入6N盐酸中(50mL)，乙酸乙酯萃取(100mL×3)，水洗(20mL×2)，饱和食盐水洗(50mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到7.76g黄色油状物。粗品加入乙醚(8mL)打浆得白色固体(3.7g,65.7％)。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)11.93(brs,1H),7.62(d,J＝15.9Hz,1H),7.55(d,J＝2.0Hz,1H),7.11(d,J＝1.9Hz,1H),6.30(d,J＝9.9Hz,1H),6.28(d,J＝15.8Hz,1H),5.70(d,J＝9.8Hz,1H),1.50(s,6H).ESI MS:m/z 305.8,307.8[M+H]+.
(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-氨基-6-基)-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(化合物13a)的合成
向100mL单口瓶中加入(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)丙烯酸12(2.0g,6.49mmol)，EDCI(1.87g,9.74mmol)，HOBt(1.32g,9.74mmol)，Et3N(3.28g,32.47mmol)，干燥的二氯甲烷(20mL)，室温下搅拌1h后，分别加入对甲氧基苯胺(6.49mmol)，继续于室温下搅拌24h。TLC显示反应完全，停止反应，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取(40mL×3)，合并有机层，水洗(20mL×2)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到粗品。粗品经乙醚打浆纯化得到得到浅棕色固体(1.93g,72％)。
(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-氨基-6-基)-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(化合物13b)的合成
向100mL单口瓶中加入(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)丙烯酸12(2.0g,6.49mmol)，EDCI(1.87g,9.74mmol)，HOBt(1.32g,9.74mmol)，Et3N(3.28g,32.47mmol)，干燥的二氯甲烷(20mL)，室温下搅拌1h后，分别加入2-氨基-5-甲氧基吡啶(6.49mmol)，继续于室温下搅拌24h。TLC显示反应完全，停止反应，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取(40mL×3)，合并有机层，水洗(20mL×2)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到粗品。粗品经乙醚打浆纯化得到得到得到白色固体(1.88g,70％)
(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(化合物13c)的合成
向50mL三口瓶中加入(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)丙烯酸12(1.0g,3.25mmol)，DMF(2滴)，干燥的四氢呋喃(20mL)，冰浴降温至0℃滴加草酰氯(0.62g,4.88mmol)的四氢呋喃溶液(5mL)，滴毕后室温反应30min。TLC反应完全，减压蒸馏除去剩余草酰氯，加入干燥的四氢呋喃(5mL)溶解备用。
向50mL三口瓶中加入4-氨基苯酚(0.35g,3.25mmol)，三乙胺(1.00g,9.75mmol)，干燥的四氢呋喃(20mL)，冰盐浴降温至-15℃滴加上述酰氯的四氢呋喃溶液，滴毕后继续于冰盐浴下搅拌30min，TLC监测反应完全。停止反应，将反应液倒入水中(20mL)，乙酸乙酯萃取(20mL×3)，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(20mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得到浅棕色固体0.93g，收率42.3％。
(E)-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(化合物13d)的合成
向100mL三口瓶中加入羧酸12(2.0g,6.49mmol)，DMF(5滴)，干燥的四氢呋喃(10mL)，冰浴降温至0℃滴加草酰氯(2.47g,19.48mmol)的四氢呋喃(5mL)溶液，滴毕后室温反应60min。TLC反应完全，减压蒸馏除去剩余草酰氯，加入干燥的四氢呋喃(30mL)溶解备用。
向250mL三口瓶中加入1-(4-羟苯基)哌嗪(3.47g,19.48mmol)，三乙胺(1.97g,19.48mmol)，四氢呋喃(100mL)，蒸馏水(50)，冷肼降温至-20℃滴加上述酰氯的四氢呋喃溶液，控制温度不高于-10℃，滴毕后继续搅拌30min，TLC监测反应完全。停止反应，减压浓缩除去大部分四氢呋喃，向残余物中加入水(50mL)，室温搅拌10min，抽滤，滤饼用水洗，干燥得棕色固体3.18g，收率105％。
通用合成方法六(Suzuki-Miyaura偶联)
向100mL单口瓶中加入13(1.0equiv.)，芳基硼酸(1.4equiv.)，Pd(PPh3)4(0.08equiv.)，碳酸钾粉末(3.0equiv.)，水(3mL)，1,4-二氧六环(10mL)，氩气保护，90℃反应24h，TLC显示溴代物原料反应完全，停止反应，冷却至室温，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(20mL×2)，合并有机层，水洗(10mL×2)，饱和食盐水洗(10mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得粗品，经硅胶柱层分离纯化得到目标化合物。
实施例11
(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D01)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13a(0.30g,0.73mmol)和3-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(26mg,8.1％)，m.p.158-160℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.66(d,J＝15.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.50(s,1H),7.37(s,1H),7.32(t,J＝7.7Hz,1H),7.12(s,1H),7.10(d,J＝11.2Hz,2H),6.89(dd,J＝7.6,1.7Hz,1H),6.86(d,J＝8.6Hz,2H),6.42(d,J＝15.4Hz,1H),6.33(d,J＝9.8Hz,1H),5.66(d,J＝9.8Hz,1H),3.84(s,1H),3.78(s,1H),1.44(s,1H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.1,159.1,156.3,151.5,1414.5,138.7,131.3,131.2,130.1,129.6,128.9,127.2,125.5,122.1,121.8,121.7,121.5,118.6,114.9,114.1,112.8,55.4,55.2,28.0.HRMS(ESI)calcd forC28H27NO4Na[M+Na]+:464.1838,found:464.1850.
实施例12
(E)-3-[8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D02)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和3,5-二甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(0.19g,41.7％)，m.p.87-90℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.66(d,J＝15.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.49(s,1H),7.38(s,1H),7.08(s,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,2H),6.72(s,2H),6.47(s,1H),6.42(d,J＝15.4Hz,1H),6.33(d,J＝9.8Hz,1H),5.67(d,J＝9.8Hz,1H),3.83(s,6H),3.79(s,3H),1.44(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.1,160.2,156.3,151.4,141.4,139.3,131.3,131.1,129.9,129.7,127.2,125.6,122.1,121.9,121.5,118.6,114.1,107.4,99.5,55.4,55.3,28.1.HRMS(ESI)calcd for C29H29NO5Na[M+Na]+:494.1943,found:494.1960.
实施例13
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D03)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和吡啶-3-硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(0.11g,27.5％)，m.p.172-174℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.78(s,1H),8.56(d,J＝4.4Hz,1H),7.91(s,1H),7.83(d,J＝7.7Hz,1H),7.67(d,J＝15.4Hz,1H),7.56(d,J＝8.0Hz,2H),7.35-7.32(m,1H),7.29(s,1H),7.12(s,1H),6.86(d,J＝8.5Hz,2H),6.48(d,J＝15.4Hz,1H),6.32(d,J＝9.8Hz,1H),5.67(d,J＝9.8Hz,1H),3.78(s,3H),1.42(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.0,156.3,151.5,149.9,147.9,140.9,136.6,133.2,131.4,131.3,129.4,127.6,126.2,126.1,123.0,121.9,121.8,121.5,119.1,114.1,77.5,55.4,28.0.HRMS(ESI)calcd for C26H24N2O3Na[M+Na]+:435.1685,found:435.1690.
实施例14
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-4-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D04)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和吡啶-4-硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到黄色固体(0.21g,52.5％)，m.p.215-217℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.65(d,J＝3.0Hz,2H),8.39(d,J＝6.8Hz,1H),7.68(d,J＝15.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.2Hz,2H),7.49(d,J＝4.5Hz,2H),7.35(s,1H),7.15(s,1H),6.88(d,J＝8.6Hz,2H),6.57(d,J＝15.4Hz,1H),6.34(d,J＝9.8Hz,1H),5.70(d,J＝9.8Hz,1H),3.79(s,3H),1.44(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.0,156.2,151.5,149.0,145.7,140.5,131.6,131.4,128.8,127.7,127.1,126.5,124.1,122.0,121.8,121.5,119.5,114.1,77.7,55.4,28.1.HRMS(ESI)calcd for C26H25N2O3[M+H]+:413.1860,found:435.1881.
实施例15
(E)-4-(6-{3-[(4-甲氧基苯基)氨基]-3-氧代丙-1-烯-1-基}-2,2-二甲基-2H-色烯-8-基)苯甲酸甲酯(SPU-D05)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和对甲氧羰基苯硼酸频哪醇酯为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(0.22g,48.9％)，m.p.148-150℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.04(d,J＝8.2Hz,2H),7.91(s,1H),7.66(d,J＝15.4Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,4H),7.30(s,1H),7.08(s,1H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),6.49(d,J＝15.4Hz,1H),6.27(d,J＝9.8Hz,1H),5.65(d,J＝9.8Hz,1H),3.93(s,3H),3.76(s,3H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)167.1,164.2,156.3,151.4,142.1,141.1,131.4,131.3,129.9,129.2,129.1,128.6,128.5,127.4,125.9,121.9,121.8,121.6,119.0,114.1,77.4,55.4,52.1,28.0.HRMS(ESI)calcdfor C29H27NO5Na[M+Na]+:492.1790,found:492.1781.
实施例16
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(嘧啶-5-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D06)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和5-嘧啶硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(0.13g,32.5％)，m.p.161-163℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)9.17(s),8.92(s,2H),7.77(s,1H),7.67(d,J＝15.4Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,2H),7.31(s,1H),7.18(s,1H),6.86(d,J＝8.30Hz,2H),6.50(d,J＝15.4Hz,1H),6.33(d,J＝9.8Hz,1H),5.70(d,J＝9.8Hz,1H),3.78(s,3H),1.44(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)163.8,157.0,156.5,156.4,151.5,140.6,131.6,131.2,131.1,128.9,127.8,126.8,122.5,122.0,121.6,119.5,114.1,78.0,55.4,28.1.HRMS(ESI)calcd for C25H23N3O3Na[M+Na]+:436.1632,found:436.1652.
实施例17
(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(2-甲氧基嘧啶-5-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D07)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和2-甲氧基-5-嘧啶硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(0.27g,62.8％)，m.p.153-154℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.68(s,1H),7.78(s,1H),7.66(d,J＝15.4Hz,1H),7.56(d,J＝7.8,2H),7.27(s,1H),7.14(s,1H),6.86(d,J＝8.2H,2H),6.50(d,J＝15.4Hz,1H),6.32(d,J＝9.8Hz,1H),5.69(d,J＝9.8Hz,1H),4.07(s,3H),3.78(s,3H),1.43(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.5,163.9,158.9,156.3,151.4,140.8,131.5,131.3,128.7,127.7,126.2,124.6,122.7,121.9,121.7,121.6,119.3,114.1,77.8,55.4,54.9,28.1.HRMS(ESI)calcd for C26H25N3O4Na[M+Na]+:466.1737,found:466.1746.
实施例18
(E)-N-(4-甲氧基苯基)-3-[8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙烯酰胺(SPU-D08)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和2-甲氧基-5-吡啶硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(0.25g,58％)，m.p.141-143℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.34(s,1H),7.75(dd,J＝7.0,1.5Hz,1H),7.67(d,J＝15.4Hz,1H),7.61(s,1H),7.29(s,1H),7.11(s,1H),6.86(d,J＝8.6Hz,2H),6.79(d,J＝8.6Hz,1H),6.45(d,J＝15.4Hz,1H),6.32(d,J＝9.8Hz,1H),5.67(d,J＝9.8Hz,1H),3.99(s,3H),3.79(s,3H),1.43(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.0,163.1,156.3,151.5,146.6,141.2,139.6,131.3,129.5,127.4,126.3,126.2,125.5,122.0,121.8,121.5,118.8,114.1,110.0,77.4,55.4,53.5,28.0.HRMS(ESI)calcdfor C27H27N2O4[M+H]+:443.1965,found:443.1979.
实施例19
(E)-3-{2,2-二甲基-8-[4-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-基}-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D09)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和4-三氟甲基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到黄色固体(0.31g,63％)，m.p.182-184℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.69(s,1H),7.66-7.62(m,4H),7.53(d,J＝7.7Hz,2H),7.45(s,1H),7.33(s,1H),7.16(s,1H),6.87(d,J＝8.2Hz,2H),6.45(d,J＝15.4Hz,1H),6.34(d,J＝9.8Hz,1H),5.69(d,J＝9.8Hz,1H),3.78(s,3H),1.43(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)163.9,156.3,151.4,141.2,141.0,131.4,131.2,130.1,129.5,129.0(q,J＝32.0Hz),128.3,127.4,125.9,124.8(q,J＝3.7Hz),124.2(d,J＝270.2Hz),121.9,121.9,121.5,118.8,114.1,77.5,55.4,28.0.HRMS(ESI)calcdfor C28H24F3NO3Na[M+Na]+:502.1600,found:502.1615.
实施例20
(E)-3-{2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-基}-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D10)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和3-三氟甲基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(0.32g,70％)，m.p.138-140℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.85(s,1H),7.70(s,1H),7.68(d,J＝15.1Hz,1H),7.58(d,J＝7.7Hz,1H),7.53-7.50(m,3H),7.42-7.40(m,1H),7.36(s,1H),7.15(s,1H),6.87(d,J＝8.7Hz,2H),6.46(d,J＝15.4Hz,1H),6.35(dd,J＝9.8,1.9Hz,1H),5.69(d,J＝9.8Hz,1H),3.79(s,3H),1.43(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.0,156.5,151.5,141.3,138.1,132.4,131.4,131.3,130.3(q,J＝32.2Hz),129.7,128.5,128.3,127.5,127.0,126.3(q,J＝4.0Hz),126.0,124.3(d,J＝270.1Hz),123.8(q,J＝4.0Hz),122.1,122.0,121.6,119.0,114.2,77.5,55.5,28.1.HRMS(ESI)calcd for C28H24F3NO3Na[M+Na]+:502.1600,found:502.1616.
实施例21
(E)-3-[8-(4-羟基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰(SPU-D11)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和对羟基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(73mg,7％)，m.p.215-217℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.97(s,1H),9.51(s,1H),7.61(d,J＝7.6Hz,2H),7.48(d,J＝15.5Hz,1H),7.41-7.39(m,3H),7.27(s,1H),6.91(d,J＝7.6Hz,2H),6.84(d,J＝7.3Hz,2H),6.70(d,J＝15.3Hz,1H),6.50(d,J＝9.4Hz,1H),5.84(d,J＝9.5Hz,1H),3.73(s,3H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.8,157.2,155.7,150.9,139.8,133.1,132.0,130.6,130.5,129.8,129.7,128.0,127.9,124.9,122.4,122.2,121.4,121.0,120.7,115.4,115.3,114.4,114.3,77.4,55.6,28.1.HRMS(ESI)calcdfor C27H25NO4Na[M+Na]+:450.1676,found:450.1688.
实施例22
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(2,4,6-三氟苯基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺(SPU-D12)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和2,4,6-三氟苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(35mg,10.4％)，m.p.134-136℃。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ(ppm)7.64(d,J＝15.4Hz,1H),7.52(d,J＝6.2Hz,2H),7.31(s,1H),7.29(d,J＝7.8Hz,1H),7.13(s,1H),6.87(d,J＝8.8Hz,2H),6.76(d,J＝8.3Hz,1H),6.37(d,J＝15.4Hz,1H),6.30(d,J＝9.8Hz,1H),6.65(d,J＝9.8Hz,1H),3.80(s,3H),1.44(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.2,156.4,154.8,141.7,131.4,131.3,129.1,127.5,126.1,121.8,121.7,121.3,118.3,116.8,114.2,55.5,28.2.
实施例23
(E)-3-[8-(4-氟苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D13)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13(0.40g,1.00mmol)和对氟苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(27mg,6％)，m.p.213-215℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.87(s,1H),9.22(s,1H),7.62-7.60(m,2H),7.49(s,1H),7.47-7.46(m,2H),7.43(d,J＝2.0Hz,1H),7.29-7.26(m,2H),7.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.69(s,1H),6.52(d,J＝9.9Hz,1H),5.87(d,J＝9.8Hz,1H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.5,161.8(d,J＝242.8Hz),153.7,150.7,139.1,133.6(d,J＝3.2Hz),132.1,131.5,131.4,131.3,130.0,128.4,128.1,125.4,122.2,122.1,77.5,28.0.HRMS(ESI)calcd for C26H22FNO3Na[M+Na]+:438.1476,found:438.1490.
实施例24
(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D14)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13(0.40g,1.00mmol)和3-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(212mg,51％)，m.p.211-214℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.86(s,1H),9.21(s,1H),7.49-7.45(m,4H),7.36(t,J＝8.1Hz,1H),7.33(d,J＝1.7Hz,1H),7.14-7.13(m,2H),6.92(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),6.73-6.69(m,3H),6.51(d,J＝9.9Hz,1H),5.86(d,J＝9.8Hz,1H),3.81(s,3H),1.41(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.5,159.3,153.7,150.8,139.2,138.7,132.0,131.5,130.1,129.5,129.3,128.1,125.4,122.2,121.7,121.1,121.0,115.5,114.9,113.4,77.5,55.4,28.1.HRMS(ESI)calcd for C27H25NO4Na[M+Na]+:450.1676,found:450.1683.
实施例25
(E)-N-[4-(苄氧基)苯基]-3-{2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-基}丙烯酰胺的合成
以(E)-N-[4-(苄氧基)苯基]-3-(8-溴-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基)丙烯酰胺(0.40g,1.00mmol)和3-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(0.30g,67％)。
3-{2,2-二甲基-8-[3-(三氟甲基)苯基]苯并吡喃-6-基}-N-(4-羟基苯基)丙酰胺(SPU-D15)的合成
向100mL单口瓶中加入化合物14(0.30g,0.54mmol)，5％Pd-C(30mg)，无水乙醇(20mL)，氩气置换三次，氢气置换三次，升温至60℃搅拌12h。TLC监测反应完全，待反应液冷却至室温后，抽滤，滤液经减压浓缩得浅黄色固体，粗品经硅胶柱层析分离得到白色固体(0.12g,48％)，m.p.128-130℃。11H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.84(s,1H),7.65(d,J＝7.6Hz,1H),7.51(d,J＝7.6Hz,1H),7.45(t,J＝7.7Hz,1H),7.15(d,J＝8.3Hz,2H),7.11(s,1H),7.01(s,1H),6.94(s,1H),6.69(d,J＝8.3Hz,2H),6.25(s,1H),2.97(t,J＝7.4Hz,2H),2.78(t,J＝6.5Hz,2H),2.62(t,J＝7.5Hz,2H),1.79(t,J＝6.6Hz,2H),1.29(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)171.2,153.3,149.3,139.2,132.6,131.4,129.9(d,J＝32.0Hz),129.7,129.3,128.4,128.3,128.1,126.4(q,J＝3.6Hz),124.3(d,J＝270.5Hz),123.1(q,J＝3.4Hz),122.8,121.8,115.7,74.6,39.5,32.5,30.9,26.7,22.7.HRMS(ESI)calcd forC27H26F3NO3Na[M+Na]+:492.1757,found:492.1770.
实施例26
(E)-3-[8-(3-氯苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D16)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13d(0.40g,1.00mmol)和3-氯苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(68mg,16％)，m.p.222-224℃。1HNMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.65(d,J＝15.3Hz,1H),7.54(s,1H),7.42(d,J＝7.3Hz,1H),7.36-7.31(m,3H),7.15(s,1H),6.85(brs,2H),6.81-6.78(m,3H),6.38(d,J＝9.8Hz,1H),5.70(d,J＝9.8Hz,1H),3.88-3.81(m,4H),3.07(s,4H),1.44(s,6H).HRMS(ESI)calcd for C30H29ClN2O3Na[M+Na]+:523.1759,found:523.1775.
实施例27
(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D17)的合成
当R1为4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯酚，向100mL单口瓶中加入13(0.64g,1.38mmol)，2-氟-5-吡啶硼酸(0.58g,4.14mmol)，Pd(PPh3)4(0.16g,0.14mmol)，碳酸钾粉末(0.57g,4.13mmol)，水(4.5mL)，1,4-二氧六环(15mL)，氩气置换三次，升温至90℃反应24h，TLC显示反应完全，停止反应。将反应液冷却至室温后，硅藻土抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗(30mL)，滤液加水(20mL)，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取(30mL×2)，合并有机层，水洗(30mL×2)，饱和食盐水洗(30mL)，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩得0.74g黄色固体。1.5倍硅胶拌样，10倍硅胶装柱，梯度洗脱EA:PE＝10:1→EA:PE＝1:1，得到淡黄色固体(0.47g,71％)，m.p.248-250℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.89(s,1H),8.43(s,1H),8.18(t,J＝6.4Hz,1H),7.70(s,1H),7.53(s,1H),7.48(d,J＝15.2Hz,1H),7.28-7.25(m,1H),7.23(s,1H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),6.67(d,J＝8.5Hz,2H),6.49(d,J＝9.8Hz,1H),5.87(d,J＝9.8Hz,1H),3.84(brs,2H),3.70(brs,2H),2.97(brs,4H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.0,162.5(d,J＝234.4Hz),151.9,150.9,147.8(d,J＝14.8Hz),144.4,143.1(d,J＝8.1Hz),141.5,132.2,131.4(d,J＝4.3Hz),130.2,128.8,127.0,124.8,122.2(d,J＝23.7Hz),118.9,116.8,116.0,109.4(d,J＝37.5Hz),77.9,51.5,50.8,45.6,42.2,28.1.HRMS(ESI)calcd for C29H28FN3O3Na[M+Na]+:508.2007,found:508.2001.化合物SPU-D17的纯度用Shimadzu 2010A HPLC测定，纯度98.4％(面积归一化法)。色谱柱为Agilent ZORBA×80A Extend-C18(4.6×150mm,5μm)，流动相MeCN/H2O＝60％/40％，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，保留时间为4.498min。
实施例28
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D18)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13(0.40g,1.00mmol)和吡啶-3-硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(183mg,46％)，m.p.155-156℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.89(s,1H),9.22(s,1H),8.78(d,J＝1.7Hz,1H),8.56(dd,J＝4.7,1.3Hz,1H),7.99-7.98(m,1H),7.52-7.48(m,5H),7.40(d,J＝1.7Hz,1H),6.75-6.72(m,3H),6.54(d,J＝9.9Hz,1H),5.89(d,J＝9.8Hz,1H),1.41(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.0,153.3,150.5,149.4,148.1,138.6,136.4,132.6,131.8,131.1,129.8,128.0,125.6,125.4,123.3,121.9,121.6,120.9,120.7,115.1,77.4,27.7.HRMS(ESI)calcd forC25H23N2O3[M+H]+:399.1703,found:399.1701.
实施例29
(E)-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D19)的合成
当R1为4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯酚，以13(0.30g,1.00mmol)和3-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(70mg,22％)，m.p.223-224℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.89(s,1H),7.59(d,J＝1.9Hz,1H),7.49(d,J＝5.2Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H),7.35(t,J＝7.9Hz,1H),7.21(d,J＝15.4Hz,1H),7.14-7.12(m,3H),6.92(dd,J＝8.2,2.2Hz,1H),6.82(d,J＝8.9Hz,2H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),6.48(d,J＝9.8Hz,1H),3.83(brs,2H),3.80(s,3H),3.70(brs,2H),2.96(brs,4H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.1,159.4,151.9,150.9,144.4,141.8,138.8,132.0,130.6,129.5,129.3,128.5,126.1,122.3,122.1,122.0,118.9,116.5,116.0,115.1,113.4,77.4,60.2,55.5,51.5,50.8,45.6,42.2,28.2.HRMS(ESI)calcd for C31H32N2O4Na[M+Na]+:519.2254,found:519.2293.
实施例30
(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D20)的合成
当R1为4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯酚，以13(0.30g,1.00mmol)和3-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(213mg,67％)，m.p.70-72℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.25(s,1H),8.05(d,J＝7.8Hz,1H),7.68(d,J＝15.4Hz,1H),7.56(s,1H),7.37(s,1H),7.32(t,J＝8.2Hz,1H),7.12(s,1H),7.11-7.10(m,2H),6.90(dd,J＝7.9,1.3Hz,1H),6.74(d,J＝8.9Hz,1H),6.43(d,J＝15.4Hz,1H),6.34(d,J＝9.8Hz,1H),5.67(d,J＝9.8Hz,1H),3.92(s,3H),3.85(s,3H),1.44(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.5,160.9,159.1,151.7,142.2,138.7,138.1,132.1,131.2,130.1,130.1,129.7,129.0,128.9,127.0,125.6,122.1,121.9,121.7,117.8,114.9,112.8,110.6,77.2,55.2,53.6,28.0.HRMS(ESI)calcd for C27H27N2O4[M+H]+:443.1965,found:443.1983.
实施例31
(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D21)的合成
当R1为4-氨基苯酚时，以13(0.30g,1.00mmol)和苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(180mg,60％)，m.p.180-182℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)8.25(s,1H),8.06(d,J＝7.1Hz,1H),7.69(d,J＝15.4Hz,1H),7.54-7.51(m,3H),7.42(t,J＝1.6Hz,2H),7.36(s,1H),7.33-7.32(m,1H),7.12(s,1H),6.74(d,J＝8.9Hz,1H),6.44(d,J＝9.8Hz,1H),5.67(d,J＝9.8Hz,1H),3.92(s,3H),1.43(s,6H).13C NMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.6,160.9,151.8,142.4,138.1,137.4,132.4,131.3,130.4,130.0,129.3,129.1,128.0,127.1,127.0,125.5,122.1,121.9,117.8,110.7,77.3,53.7,28.1.HRMS(ESI)calcdfor C26H25N2O3[M+H]+:413.1860,found:413.1866.
实施例32
(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰(SPU-D22)的合成
当R1为对甲氧基苯胺，以13(0.40g,0.97mmol)和苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(100mg,25％)，m.p.162-163℃。1H NMR(600MHz,CDCl3):δ(ppm)7.67(d,J＝15.3Hz,1H),7.54-7.53(m,4H),7.40(t,J＝6.6Hz,3H),7.36-7.32(m,2H),7.12(s,1H),6.86(d,J＝8.2Hz,2H),6.42(d,J＝15.4Hz,1H),6.34(d,J＝15.4Hz,1H),5.67(d,J＝9.7Hz,1H),3.78(s,3H),1.43(s,6H).13CNMR(150MHz,CDCl3):δ(ppm)164.1,156.3,151.5,141.6,137.4,131.3,131.2,130.2,129.9,127.9,127.2,127.0,125.3,122.1,121.8,121.5,118.5,114.1,77.2,55.4,28.0.HRMS(ESI)calcd for C27H26NO3[M+H]+:412.1907,found:412.1910.
实施例33
(E)-3-[8-(4-羟基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺(SPU-D23)的合成
当R1为4-氨基苯酚时，以13(0.30g,1.00mmol)和4-羟基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到白色固体(65mg,21％)，m.p.234-236℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)10.13(s,1H),9.51(s,1H),8.46(d,J＝2.1Hz,1H),8.10(dd,J＝8.8,2.3Hz,1H),7.52(d,J＝15.6Hz,1H),7.41(s,1H),7.39(s,2H),7.29(s,1H),6.84-6.82(m,3H),6.69(d,J＝15.7Hz,1H),6.50(d,J＝9.8Hz,1H),5.85(d,J＝9.8Hz,1H),3.83(s,3H),1.40(s,6H).13CNMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)164.3,160.0,157.2,151.1,140.4,137.8,132.0,131.6,130.9,130.6,130.0,129.7,128.0,127.8,124.9,122.4,122.2,120.0,115.4,110.6,77.4,53.6,28.1.HRMS(ESI)calcd for C26H24N2O4Na[M+Na]+:451.1628,found:451.1652.
实施例34
(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D24)的合成
当R1为4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯酚，以13(0.30g,1.00mmol)和吡啶-3-硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(64mg,21％)，m.p.204-206℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.89(s,1H),8.78(s,1H),8.55(s,1H),7.98(d,J＝6.6Hz,1H),7.69(s,1H),7.52-7.48(m,3H),7.25(d,J＝15.1Hz,1H),6.83(d,J＝7.6Hz,2H),6.67(d,J＝7.6Hz,2H),6.49(d,J＝9.5Hz,1H),5.87(d,J＝9.5Hz,1H),3.84(brs,2H),3.70(brs,2H),2.97(brs,4H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.1,151.9,151.0,150.0,148.5,144.4,141.6,137.0,133.1,132.1,130.3,128.8,126.9,126.1,123.7,122.1,122.0,118.9,116.8,116.0,77.8,51.5,50.9,45.5,42.2,28.1.HRMS(ESI)calcd forC29H30N3O3[M+H]+:468.2282,found:468.2301.
实施例35
(E)-3-[8-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D25)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13(0.40g,1.00mmol)和4-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(98mg,23％)，m.p.249-251℃。1HNMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.86(s,1H),9.20(s,1H),7.52(d,J＝8.6Hz,2H),7.49-7.46(m,3H),7.40(d,J＝1.0Hz,1H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.6Hz,2H),6.72(d,J＝8.8Hz,2H),6.69(d,J＝15.9Hz,1H),6.50(d,J＝9.8Hz,1H),5.85(d,J＝9.8Hz,1H),3.81(s,3H),1.40(s,6H).13CNMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.6,159.0,153.8,150.9,139.4,132.0,131.9,131.9,131.6,130.6,129.9,129.7,129.3,129.2,128.1,125.0,122.4,122.3,121.2,120.9,115.6,114.1,77.4,55.6,28.1.HRMS(ESI)calcd for C27H25NO4Na[M+Na]+:450.1676,found:450.1684.
实施例36
(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-羟基苯基)丙烯酰胺(SPU-D26)的合成
当R1为2-氨基-5-甲氧基吡啶，以13(0.40g,1.00mmol)和4-甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(90mg,22％)，m.p.192-194℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.88(s,1H),9.21(s,1H),8.43(s,1H),8.19(t,J＝6.5Hz,1H),7.51-7.48(m,4H),7.41(s,1H),7.28(d,J＝7.3Hz,1H),6.73-6.71(m,3H),6.53(d,J＝9.8Hz,1H),5.89(d,J＝9.8Hz,1H),1.41(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)163.5,162.6(d,J＝234.8Hz),153.8,150.9,147.7(d,J＝15.0Hz),143.0(d,J＝7.8Hz),139.0,132.3,131.6,130.2,128.5,126.0,124.9,122.4,122.0,121.5,121.2,115.6,109.5(d,J＝37.3Hz),78.0,28.2.HRMS(ESI)calcd for C25H21FN2O3Na[M+Na]+:439.1428,found:439.1435
实施例37
(E)-3-[8-(3,5-二甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D27)的合成
当R1为4-氨基苯酚时，以13(0.30g,1.00mmol)和3,5-二甲氧基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(120mg,36％)，m.p.244-245℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.87(s,1H),7.59(d,J＝1.6Hz,1H),7.49-7.47(m,2H),7.20(d,J＝15.3Hz,1H),6.82(d,J＝8.8Hz,2H),6.72(d,J＝2.1Hz,2H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),6.48(brs,1H),6.47(s,1H),5.85(d,J＝9.8Hz,1H),3.83(brs,2H),3.79(s,6H),3.70(brs,2H),2.96(brs,4H),1.41(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.1,160.5,151.9,150.8,144.4,141.8,139.4,132.0,130.6,129.3,128.4,126.1,122.3,122.1,118.9,116.5,116.0,107.7,99.9,77.4,55.6,51.5,50.8,45.6,42.2,28.2.HRMS(ESI)calcd for C32H34N2O5Na[M+Na]+:549.2360,found:549.2377.
实施例38
(E)-3-[8-(3-三氟甲基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮(SPU-D28)的合成
当R1为4-氨基苯酚时，以13(0.30g,1.00mmol)和3-三氟甲基苯硼酸为原料，按照通用合成方法六，得到淡黄色固体(130mg,38％)，m.p.220-222℃。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.88(s,1H),7.92(s,1H),7.87(d,J＝7.1Hz,1H),7.73-7.69(m,3H),7.55(d,J＝1.4Hz,1H),7.51(d,J＝15.2Hz,1H),7.24(d,J＝15.3Hz,1H),6.83(d,J＝8.8Hz,2H),6.50(d,J＝9.8Hz,1H),5.88(d,J＝9.8Hz,1H),3.84(brs,2H),3.70(brs,2H),2.97(brs,4H),1.40(s,6H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ(ppm)165.1,151.9,144.4,141.6,138.3,133.6,132.1,130.5,129.8,129.3(q,J＝31.3Hz),128.8,127.7,126.7,126.2(q,J＝3.7Hz),124.8(d,J＝270.6Hz),124.2(q,J＝3.4Hz),123.9,122.2,122.1,118.9,116.8,116.0,77.8,51.5,50.8,45.6,42.2,28.1.HRMS(ESI)calcd for C31H29FN2O3Na[M+Na]+:557.2022,found:557.2060.
测试例1
1、化合物对BV2细胞毒性试验
1.1实验试剂见表1：
表1实验药品与试剂
1.2实验原理
MTT属于四氮唑盐类，用于检测细胞的存活和生长。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以还原外源性MTT成为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，然后沉积在细胞中，而死细胞则不能还原。DMSO可以溶解细胞中的甲臜，然后用酶联免疫检测仪在570nm波长处检测光吸收值，可间接反映活细胞数量。
1.3实验方法
1)细胞培养
细胞用完全培养基(DMEM+10％FBS)培养传代：待细胞生长至融合度90％后，弃去原培养基，不含FBS的培养基洗一次，加入0.25％胰酶消化后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀；离心(800rpm离心5min)；弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，按合适比例接种到培养皿。标上细胞名称、代次和传代日期后置于37℃培养箱静置培养。
2)MTT实验
细胞铺板：细胞培养传代至生长状态良好、融合度90％左右，开始用于实验。胰酶消化细胞，800rpm离心5min，弃上清，用新鲜培基(DMEM+10％FBS)重悬，并计数，以每孔3000个细胞的密度接种至96孔细胞培养板，置于37℃ 5％CO2培养箱培养过夜。
样品配制：取样品20μL于V孔板A行中，做好标记，其余各孔加12μLDMSO，按照3倍连续稀释方法稀释至G孔，每次稀释均震荡均匀。上药时，每个浓度取5μL加入到120μL培基(25倍稀释)，同时做DMSO对照孔，振荡混匀。取培养过夜的细胞，除去培养基，每孔加入195μL的DMEM，再分别加入5μL稀释好的含相应浓度化合物的培基，随后将培养板置于37℃ 5％CO2培养箱培养过夜。
表2药物板型分布
检测：除去原液，每孔加100μL含MTT(0.5mg/mL)的新鲜无血清DMEM培基后，继续培养。4h后除去原液，每孔加入100μL DMSO，避光震荡10min，置于多功能读数仪读取552/690nm波长的吸光值。
细胞存活率计算公式：
用软件GraphPad Prism 6.0分析数据，化合物对细胞增殖的抑制活性以细胞存活率和化合物浓度为坐标绘图。IC50以S形剂量反应曲线方程拟合，曲线方程为：Y＝100/[1+10^(LogC-LogIC50)]，C是化合物浓度。
所得结果见表3。
表3不同化合物对BV2细胞的细胞毒性
表3的结果显示，38个SPU系列化合物中，22个化合物对BV2细胞的毒性较小，半数毒性浓度(Median toxicity concentration,TC50)大于100μM；14个化合物具有一定细胞毒性，TC50在1～10μM之间；化合物SPU-D11和SPU-D23表现出较大的细胞毒性，TC50分别为0.9μM和0.44μM。
2、化合物抗氧化试验
2.1药品与试剂见表4
表4实验药品与试剂
2.2实验原理
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)是一种稳定的自由基，为紫色结晶。稳定DPPH自由基在乙醇溶液中呈深紫色，在517nm波长处有一强吸收，DPPH可以捕获或清除其它的自由基，使其颜色逐渐消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。因此，通过吸光度的变化可以衡量待测化合物的清除自由基能力。
2.3实验方法
1)试剂配制
所筛选样品粉末用DMSO溶解为10mM的溶液，然后按样品与乙醇1:9的体积配成不同浓度的溶液(DMSO的含量为10％)。
DPPH母液：称取0.0079gDPPH粉末溶于20mL的无水乙醇制成浓度为1mM的母液，4℃避光保存备用。使用时用无水乙醇稀释至0.2mM。
槲皮素溶液：称取5mg槲皮素溶于1mL的DMSO中，取100μL加DMSO 900μL稀释为0.5mg/mL，分装至小管内，每管40μL，使用时再与乙醇1:9的体积加无水乙醇360μL配制(DMSO的含量为10％)。
溶剂对照组：DMSO与无水乙醇按1:9体积比例混合(DMSO的含量为10％)，现用现配。
2)操作步骤
样本检测组(A0)：50μLDPPH溶液+50μL样品液的吸光度值；
样品颜色对照组(A1)：50μL无水乙醇+50μL样品液的吸光度值；
溶剂对照组(A2)：50μLDPPH溶液+50μL10％DMSO的无水乙醇的吸光度值；同时设3个复孔，于25℃培养箱孵育30min，然后测定其517nm波长处的吸光度值。
按以下公式计算DPPH自由基清除率，同时以槲皮素作为阳性对照。
清除率P(％)＝[1-(A0-A1)/A2]×100％
所得结果见表5。
表5SPU化合物的自由基清除活性a
a用DPPH法在1mM下测定自由基清除率。
表5结果显示，38个SPU系列化合物中，13个化合物对DPPH的清除率大于70％，其中化合物SPU-ZD10(90.02％)、SPU-D16(92.78％)、SPU-D17(92.89％)、SPU-D19(89.64％)、SPU-D24(89.32)、SPU-D27(91.58％)、SPU-D28(91.65％)。槲皮素属于黄酮醇类化合物，具有很强自由基清除作用。以槲皮素为阳性对照，结果显示6个化合物对自由基的清除率与槲皮素(89.41％)相近。
表6化合物的自由基清除活性
采用DPPH法进一步考察化合物在1mM浓度时对DPPH自由基清除率大于50％的化合物的量效关系，结果如表6所示。活性筛选共发现7个化合物的EC50小于100μM，具有明显的抗氧化作用。构效关系显示：SPU-ZD和SPU-D系列化合物R1为1-(4-羟基苯基)哌嗪基的化合物对自由基有很好的清除效果，EC50小于100μM；R1或Ar为对羟基苯基的化合物对自由基清除具有中等作用，EC50值在100～350μM之间。
3、化合物抑制BV2细胞产生NO试验
3.1药品与试剂见表7
表7实验用品
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3.2实验原理
NO在水溶液中极易被氧化成生成NO2-。在酸性条件下，NO2-与对氨基苯磺酰胺发生重氮化反应生成重氮化合物，然后与N-(1-萘基)乙烯二胺发生偶联反应，生成有颜色的产物，该浓度与NO浓度具有线性关系，在540nm波长处有最大光吸收峰。
3.3实验方法
1)样品配置
样品用DMSO稀释至待测浓度的1000倍，保存于-20℃。使用前，1μL样品加入999μLDMEM，混匀后待用。
2)标准曲线的绘制
以NaNO2标准的稀释液的浓度为横坐标，光密度(OD)值为横坐标，绘制标准曲线。
3)细胞复苏和培养
从液氮罐中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。融化后的细胞加入5mL完全培养基(DMEM+10％灭活FBS)，800rmp离心5min，弃去上清后均匀接种至完全培养基中。
待细胞生长至融合度90％后，弃去原培养基，不含FBS的培养基洗一次，加入0.25％胰酶消化后，加入完全培养基终止消化，吹打均匀；离心(800rpm离心5min)；弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，按合适比例接种到培养皿。标上细胞名称、代次和传代日期后置于37℃培养箱静置培养。
4)种板及上药
实验设计：溶剂对照组(C)、模型组(M)和实验组。
0.25％胰酶-EDTA消化细胞，用含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×106/mL，均匀接种至96孔板，每孔100μL，接种后放入培养箱培养24h。
按照设定的分组DMSO组、模型组(M)和样品组，分别加入198μL无血清DMEM、含0.1％DMSO的无血清DMEM和含药无血清DMEM，每个样品设3个复孔，置37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，除正常对照组和DMSO组加入2μL无血清DMEM培养基外，其余各组分别加入2μLLPS(终浓度为1μg/ml)，终体积为200μL，继续孵育20～24h。
5)NO检测
用DMEM无血清培养基稀释标准品，并加入到新的96孔细胞培养板，每孔100μL；取100μL细胞培养液上清加到新的96孔细胞培养板。所有孔加入50μL GriessA试剂，震荡混匀，反应2分钟。再加入50μL Griess B试剂避光震荡反应10min。在540nm/630nm处测每孔的光吸收值。
根据待测化合物的OD值，利用标准曲线计算得到对应的NO浓度，所得结果见表8。
表8SPU化合物对LPS诱导的BV2细胞NO生成的抑制活性
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表8结果显示38个SPU系列化合物中，大部分化合物对LPS刺激BV2细胞产生NO的抑制能力较弱，抑制率小于20％。部分化合物在高浓度下反而促进NO的产生合物SPU，如化合物SPU-D01～SPU-D10。SPU-D12、17、18、24对LPS刺激BV2细胞产生NO具有一定的抑制作用，抑制率在20％～50％之间，而且表现出浓度依赖性。化合物SPU-D24对LPS刺激BV2细胞产生NO的抑制作用最强，在10μM浓度时的抑制率是46.51％。
4、化合物抑制BV2细胞释放炎症因子试验
4.1药品与试剂见表9
表9实验用品
4.2实验方法
实验设分为溶剂对照组(C)、模型组(M)和样品组。
1)细胞种板：细胞用0.25％胰酶-EDTA消化，含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×105/mL，均匀接种至24孔板，每孔400μL细胞悬液，含10000个细胞，种板后放入37℃5％CO2培养箱培养24h。
2)样品配制：1μL受试样品用加入999μL DMEM，混匀后使用；DMSO用DMEM稀释1000倍，用于C组和M组。
3)给药：培养24h后，取出24孔板，吸去上清液，溶剂对照组和模型组加入495μL含0.1％DMSO的无血清DMEM，样品组加入495μL稀释后的样品，加药完毕后将24孔板放入培养箱培养1h。
4)LPS刺激：1h后，M组和样品组加入5μL 100μg/mLLPS(终浓度为1μg/mL)，C组加入5μL含0.1％DMSO的无血清的DMEM培养基，加药完毕后将24孔板放入培养箱继续培养18h。
5)检测：所有孔上清稀释15倍后，按照ELISA试剂盒说明书进行检测。
抑制率计算公式：
所得结果见表10。
表10化合物对LPS诱导的BV2细胞细胞因子产生的抑制活性
表10结果显示，高浓度的化合物SPU-ZD01、SPU-ZD07、SPU-D03、SPU-D04、SPU-D08、SPU-D11、SPU-D17、SPU-D20～SPU-D28对LPS刺激BV2释放TNF-α有较好的抑制作用，抑制率均大于50％。当浓度降低时，抑制率有不同程度的降低，部分化合物在低浓度时显示出促进BV2释放TNF-α的作用。SPU-ZD01在10μM浓度时，对LPS刺激BV2释放TNF-α和IL-6均有较好的抑制作用，抑制率分别为78.57％和48.12％，但是在1μM浓度时，反而促进两种细胞因子的释放。化合物SPU-D23对LPS刺激BV2释放TNF-α的抑制作用最强，在1μM和0.1μM浓度时的抑制率分别为93.24％和43.18％。
化合物对LPS刺激BV2释放IL-6的抑制率如表10所示，只有化合物SPU-ZD05、SPU-ZD07、SPU-D23、SPU-D26在高浓度时有较好的抑制的能力，抑制率大于50％，但其低浓度抑制活性不明显，甚至有促炎的作用。大部分化合物对LPS刺激BV2释放IL-6没有抑制作用，甚至具有不同程度的促进作用。
综上分析，化合物SPU-ZD07、SPU-D23和SPU-D26对LPS刺激BV2释放的TNF-α和IL-6均有一定抑制作用，对两种细胞因子的抑制率均大于50％。
5、化合物抗OGD诱导PC12细胞损伤作用的试验
5.1实验材料见表11
表11实验用品
5.2实验方法
1)实验分组
实验设空白对照组、溶剂对照组(DMSO组)、模型组、模型+给药组。
2)操作步骤
将细胞以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，含10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度为1×105个/mL，均匀接种至96孔板，每孔100μL，接板后放入培养箱培养24h。培养24h后，吸去上清液，加入100μL无糖DMEM培养基，于5％CO2+95％N2，37℃孵育4h，后加入相应的含药培养基100μL，于正常培养箱孵育24h，同时设三个复孔。
(1)空白对照组：每孔加入100μLDMEM培养基；
(2)溶剂对照组：每孔加入100μL含有DMSO的DMEM培养基；
(3)模型组：每孔加入100μL无糖DMEM培养基；
(4)模型+给药组：每孔加入100μL无糖DMEM培养基。
OGD 4h结束后，在模型+给药组中，每孔加入相应的含药培养基100μL(用无糖配制2X药物)，加药完毕后将96孔板放入正常培养箱培养24h，对照组加入相应的DMEM培养基，以及模型组加入相应的无糖DMEM培养基。
24h时后，去除孔内液体，给予配制好的MTS孵育2h后，于490nm处检测吸光值。
所有数据采用Graphpad Prism 5软件进行统计，以Mean±SEM表示，对于两组间的比较用Students’t检验，当三组或三组以上比较时用单因素方差分析，后检验采用Dunnett’s test,P<0.05认为有统计学意义，所得结果见图1～2。
由图1可以看出，与缺氧缺糖/复氧复糖(OGD/R)组相比，化合物SPU-D02、SPU-D05、SPU-D07和SPU-D10在50μM的浓度时，对OGD诱导PC12细胞的存活率分别为77.4％、73.2％、87.6％和73.8％，具有统计学意义上的保护作用。
由图2可以看出，化合物SPU-D02(25～100μM)、SPU-D05(50～100μM)、SPU-D07(25～100μM)、SPU-D10(12.5～50μM)在OGD诱导PC12细胞损伤模型上具有保护作用。
6药代动力学试验
6.1实验仪器见表12
表12实验用品
6.2实验试剂见表13
表13实验用品
6.3实验动物
SPF级SD大鼠36只，雌雄各半，体重200～250g，购于青龙山动物繁殖场，动物生产许可证编号20180004030364。动物饲养于江苏康缘药业股份有限公司南京研究院实验动物中心，其饲养于温度24±2℃、相对湿度60±10％、12h光照和12h黑暗交替的环境中，期间自由进食和饮水。
6.4实验方法
(1)溶液配制
标准溶液的配制：取SPU-D17适量，精密称定，加入甲醇超声溶解，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。
内标溶液的配制：取氯霉素对照品约5mg，精密称定，置5mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0mg/mL的储备液。再用甲醇稀释成浓度为3μg/mL的内标(IS)溶液。
(2)血浆样品前处理
取大鼠血浆样品50μL，加入5μL的内标溶液，再加入500μL的乙酸乙酯萃取，充分振荡，12000rpm离心3min，取上清液挥干，然后用100μL的70％的甲醇溶液复溶，14000rpm离心10min，取上清液进样分析。
(3)分析条件
色谱条件：色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(3.0×50mm,1.8μm)；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；流动相为A(0.1％甲酸水溶液)-B(乙腈)，洗脱梯度；进样量：3μL。
表14梯度洗脱条件
(4)质谱条件
选用电喷雾离子源(ESI)，设定源参数分别为：喷雾电压(IonSprayVoltage/IS)-4500V；辅助气1(Ion Source Gas 1/GS 1,N2)40Arb；辅助气2(Ion Source Gas 2/GS 2,N2)60Arb；辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃；气帘气(Curtain Gas/CUR)20Arb；碰撞气(Collision Gas/CAD,N2)8Pa；扫描方式为多重离子反应监测(MRM)；正离子模式。
表15离子对、DP和CE的检测
(5)动物给药及血浆样本采集
a)给药剂量
口服给药组10mg/kg；静脉给药组10mg/kg。
b)溶液的配制
SPU-D17静脉注射给药溶液：精密称取SPU-D17适量，用5％DMSO-5％吐温80-90％生理盐水配制成浓度2mg/mL的溶液，供静脉给药用。
c)给药方案与样品采集
SPU-D17：取SD大鼠12只，随机分成A、B两组，雌雄各半，给药前禁食12h，自由饮水。其中A组为SPU-D17静脉注射给药组，B组为DF13静脉注射给药组，给药剂量为10mg/kg(2mg/mL,0.5mL/100g)。分别于给药前与给药后2min、5min、10min、15min、30min、45min、1h、2h、4h由眼底静脉丛采血0.3mL，收集于肝素钠处理的离心管内，8000rpm离心5min，分离血浆于-80℃冰箱保存。
数据处理均由AB Sciex Multi Quant 2.1软件自动计算获得，并采用DAS 3.0药代动力学软件，以非房室模型统计分析不同给药组SPU-D17在大鼠体内的主要药动学参数。绝对生物利用度的计算公式如下：
(式中D为给药剂量，iv和og分别表示静脉注射给药和灌胃给药)
所得结果见表16。
表16静脉给药10mg/kg后SD大鼠体内化合物的血浆浓度
药代动力学预实验显示，化合物SPU-D17经口服给药后，在大鼠血浆中暴露量极低，基本低于定量下限，无法准确定量。因此，正式试验中仅开展SPU-D17经静脉注射给药后的药代动力学研究。SD大鼠经单次口服(po)和尾静脉注射(iv)给药(10mg/kg)后，化合物SPU-D17在大鼠体内的血药浓度如表16所示，平均血浆浓度-时间(Concentration-Time)曲线如图3所示。
表17大鼠静脉注射SPU-D17的药代动力学
SD大鼠经iv给药10mg/kg后，化合物SPU-D17的药代动力学参数如表17所示。大鼠单次iv给药SPU-D17后，大鼠体内暴露量为4269±2222μg*h/L，消除半衰期(t1/2z)为1.0±0.4h，血浆清除率(CLz)为2.7±1.1L/h/kg。
上述结果表明，静脉注射给药后化合物在大鼠血浆中存在一定暴露量，SPU-D17静脉注射给药半衰期为1.0±0.4h，不宜作为口服剂型。
7.脑组织分布试验
脑组织分布研究所用的实验仪器材料和试剂、实验动物、溶液配置、色谱条件、质谱条件与6.药代动力学试验相同，此处不再赘述。
7.1实验方法
1)给药方案与样品采集
SPU-D17给药方案：取SD大鼠12只，雌雄各半，给药前禁食12h，自由饮水。静脉注射给药，给药剂量为10mg/kg(2mg/mL，0.5mL/100g)。分别于给药后5min、30min、1h处死取出脑组织，保存于-80℃冰箱保存。
2)脑组织样品前处理
取大鼠脑组织样品适量，按1:10加入生理盐水研磨成匀浆液备用；取脑组织匀浆液50μL，加入5μL的内标溶液，再加入500μL的乙酸乙酯萃取，充分振荡，12000rpm离心3min，取上清液挥干，然后用100μL的70％的甲醇溶液复溶，14000rpm离心10min，取上清液进样分析。
7.2实验结果
通过对SD大鼠单次静脉注射(10mg/kg)给予化合物SPU-D17，评估其在脑组织的分布情况，结果如表18所示。
表18化合物SPU-D17在SD大鼠脑组织中的含量
由表18可知，给药5min后，SPU-D17在脑组织分布量达到3606.67±1084.50ng/g，含量随时间逐渐减少，消除速度相对较慢。由此可见，静脉注射给药后，SPU-D17能通过血脑屏障。
8.急性毒性试验
8.1实验动物
健康ICR小鼠，雌雄各半，SPF级，18～22g，购于河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，许可证号为SCXK(豫)2020-0005。动物饲养于江苏康缘药业股份有限公司南京研究院实验动物中心，其饲养于温度24±2℃、相对湿度60±10％、12h光照和12h黑暗交替的环境中，期间自由进食和饮水。
8.2实验试剂与药品
表19实验用品
8.3实验方法
(1)药物配置
准确称量SPU-D17，先将其溶解于DMSO和吐温80(1:1)的混合溶媒中，待其全部溶解后，再向混合溶媒中添加9倍体积的生理盐水进行稀释，最终得到1.25mg/mL,2.5mg/mL和5mg/mL的药物溶液，分别作为给药剂量的低、中、高剂量。
(2)分组、饲养和给药
ICR小鼠适应性喂养一周后，按体重将雌、雄小鼠各自随机分配为4组(n＝8)：正常对照组(Vehicle)、SPU-D17高中低三个剂量组(SPU-D17-High、SPU-D17-Medium、和SPU-D17-Low)各组均以10mL/kg的给药体积进行单次尾静脉注射。
(3)小鼠的生理状况和体重变化
给药后立即观察30min，监测小鼠是否出现不良反应或死亡；同时在1h、2h、4h、8h各观察1次，监测小鼠是否出现不良反应或死亡。此后每日监测并记录小鼠日常活动情况、精神状态，每周称量并记录每组小鼠的体重。
(4)小鼠脏器指数的检测
在给药2周后，对各组小鼠进行大体解剖，取出每只小鼠的心、肝、脾、肺、肾，同时用生理盐水冲洗，并用医用纱布吸干水分，置入EP管中保存待测。根据公式计算脏器指数，如下：
脏器指数(％)＝脏器重量/体重×10％
8.4数据统计
实验数据以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，用GraphPad Prism 8.4软件进行统计，多组间比较采用单因素方差ANOVA法分析，方差齐性采用LSD法，P<0.05视为显著性差异。
8.5实验结果
图4中(a)为SP-D17高中低剂量组对雄性小鼠体重的影响；(b)为SP-D17高中低剂量组对雌性小鼠体重的影响。
图5为化合物SPU-D17对雌雄小鼠的脏器指数影响，由图5可知，各给药组雌雄小鼠的肺、脾脏、心脏和肝脏指数与空白组相比均没有显著性差异；然而雌性小鼠的中剂量组(25mg/kg)和高剂量组(50mg/kg)的肾脏指数与空白组相比显著性增加。上述数据表明：SPU-D17的中剂量组和高剂量组可能会影响雌性小鼠的肾脏发育。中等剂量和高剂量组与空白组存在显著性差异。*P<0.5％,***P<0.01％。
综合上述体重和脏器指数变化，25mg/kg和50mg/kg剂量的化合物SPU-D17可能会影响雌性小鼠肾脏的正常发育，具体的原因需要进一步的验证。另外，由于化合物的最大溶解度为5mg/mL，最大的给药剂量为50mg/kg，在此剂量下并没有得到小鼠半数致死量(LD50)。
由以上实施例可知：
1、本发明提供的化合物的细胞毒性：38个SPU系列化合物中，22个化合物的细胞毒性较小，TC50大于100μM；14个化合物具有一定细胞毒性，TC50在1～10μM之间；化合物SPU-D11和SPU-D23表现出较大的细胞毒性，TC50分别为0.9μM和0.44μM。
2、化合物的自由基清除率：化合物浓度在1mM时，13个SPU系列化合物对DPPH的清除率大于70％，其中化合物SPU-ZD10(90.02％)、SPU-D16(92.78％)、SPU-D17(92.89％)、SPU-D19(89.64％)、SPU-D24(89.32)、SPU-D27(91.58％)、SPU-D28(91.65％)对自由基的清除率高。
3、化合物抑制BV2细胞释放NO活性：SPU系列化合物中，大部分化合物对LPS刺激BV2细胞产生NO的抑制能力较弱，抑制率小于20％。化合物SPU-D12、17、18、24对LPS刺激BV2细胞产生NO具有一定的抑制作用，抑制率在20％～50％之间，而且表现出浓度依赖性。化合物SPU-D24对LPS刺激BV2细胞产生NO的抑制作用最强，在10μM浓度时的抑制率是46.51％。
4、化合物抑制BV2释放TNF-α活性：SPU系列化合物中，高浓度的化合物SPU-ZD01、SPU-ZD07、SPU-D03、SPU-D04、SPU-D08、SPU-D11、SPU-D17、SPU-D20～SPU-D28对LPS刺激BV2释放TNF-α均有较好的抑制作用，抑制率均大于50％。当浓度降低时，抑制率有不同程度的降低，部分化合物在低浓度时显示出促进BV2释放TNF-α的作用。化合物SPU-D23对LPS刺激BV2释放TNF-α的抑制作用最强，在1μM和0.1μM浓度时的抑制率分别为93.24％和43.18％。
5、化合物抑制BV2释放IL-6活性：高浓度的化合物SPU-ZD05、SPU-ZD07、SPU-D23、SPU-D26，对LPS刺激BV2释放IL-6有较好的抑制的作用，抑制率大于50％。量效关系研究发现5个活性显著的化合物(SPU-ZD07、SPU-D23、SPU-D26、DF13、DF15)，其中SPU-D23细胞毒性较大(TC50＝0.44μM)，需要进一步结构修饰。
6、抗氧化抗炎活性筛选小结：7个化合物具有抗氧化活性(SPU-D16、SPU-D19、SPU-D24、SPU-D27、SPU-D28、SPU-ZD10)；2个化合物可以抑制BV2细胞释放TNF-α(SPU-D17、SPU-D23)；3个化合物可以抑制BV2细胞释放IL-6(SPU-D23、SPU-D26、SPU-ZD07)。其中化合物SPU-D17兼有抗氧化和抑制TNF-α释放活性，化合物SPU-D23兼有抑制TNF-α和IL-6释放活性。
7、OGD诱导PC12细胞损伤模型活性研究：与OGD/R组相比，化合物SPU-D02、SPU-D05、SPU-D07和SPU-D10在50μM的浓度时，OGD诱导PC12细胞的存活率分别为77.4％、73.2％、87.6％和73.8％，具有统计学意义上的保护作用。量效关系研究显示化合物SPU-D02(25～100μM)、SPU-D05(50～100μM)、SPU-D07(25～100μM)、SPU-D10(12.5～50μM)在OGD诱导PC12细胞损伤模型上具有一定的统计学意义上的保护作用。
8、药代动力学研究：静脉注射给药后，化合物在大鼠血浆中均存在一定暴露量，SPU-D17静脉注射给药半衰期为1.0h。
9、脑组织分布研究：静脉注射给药后，化合物SPU-D17能通过血脑屏障，在脑组织分布相对较好。
10、急性毒性研究：SPU-D17在25mg/kg和50mg/kg剂量下可能会影响雌性小鼠肾脏的正常发育，显示出非常好的开发前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，其特征在于，为8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺、8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-4-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、(E)-3-[8-(3-氯苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺、(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺或(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮。
2.根据权利要求1所述的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物，其特征在于，还包括所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物药学上可接受的盐。
3.权利要求1或2所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物为8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺或8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺时：
将化合物1进行第一卤代反应，得到化合物2；
将化合物3进行第二卤代反应，得到化合物4；
将所述化合物2和化合物4进行取代反应，得到化合物5；
将所述化合物5进行重排反应，得到化合物6；
将所述化合物6与化合物7进行偶联反应，得到化合物8；
将所述化合物8进行水解反应，得到化合物9；
将所述化合物9与化合物10进行酰化反应，得到所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物7的结构式为所述化合物8的结构式为/>
所述化合物9结构式：
所述化合物7～9中Ar1为间甲氧基苯基、间三氟甲基苯基或代表连接位点；
所述化合物10为对甲氧基苯胺；
当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物为(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-4-基)-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺、(E)-3-[8-(3-氯苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-3-[8-(6-氟吡啶-3-基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]丙-2-烯-1-酮、(E)-3-[8-(3-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(5-甲氧基吡啶-2-基)丙烯酰胺、(E)-3-[8-(苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-基]-N-(4-甲氧基苯基)丙烯酰胺或(E)-3-[2,2-二甲基-8-(吡啶-3-基)-2H-色烯-6-基]-1-[4-(4-羟基苯基)哌嗪-1-基]丙-2-烯-1-酮时：
将化合物6进行还原反应，得到化合物11；
将所述化合物11进行Knoevenagel缩合反应，得到化合物12；
将所述化合物12与化合物10进行酰化反应，得到化合物13；
将所述化合物13与化合物7进行偶联反应，得到所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物；
所述化合物7的结构式为Ar1为间甲氧基苯基、苯基、间氯苯基、/>或/>·代表连接位点；
所述化合物10为对甲氧基苯胺、2-氨基-5-甲氧基吡啶或4-1-哌嗪苯酚。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物为8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺或8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺时，所述第一卤代反应的温度为-40～10℃，时间为2～16h；所述第二卤代反应的温度为-40～10℃，时间为16～32h；所述取代反应在氩气保护条件下进行；所述取代反应的时间为20～56h。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，当所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物为8-(3-甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺、N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-8-[(3-三氟甲基)苯基]-2H-色烯-6-甲酰胺或8-(3,5-二甲氧基苯基)-N-(4-甲氧基苯基)-2,2-二甲基-2H-色烯-6-甲酰胺时，所述重排反应的温度为100～210℃，时间为6～24h；所述偶联反应的温度为40～120℃，时间为4～36h；所述酰化反应的温度为0～50℃，时间为4～36h。
6.权利要求1或2所述2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物或权利要求3～5任一项所述制备方法制备得到的2,2-二甲基苯并吡喃类衍生物在制备神经保护药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述神经保护药物包括治疗缺血性脑卒中药物或神经炎症性药物。
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| CN101094830A (zh) * | 2004-12-30 | 2007-12-26 | 塞诺菲—安万特德国有限公司 | 用作cxcr2抑制剂、治疗炎症的稠合双环甲酰胺衍生物 |
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2023
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