CN116036019A - 一种含负电荷脂质的核酸递运系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物递送领域，具体地，涉及脂质体载体递送mRNA。更具体的，涉及一种在细胞上递送mRNA的，由阳离子脂质体和负电荷磷脂POPS组成的脂质体纳米递送系统。本发明构建一个由阳离子脂质体为主要成分的mRNA脂质体纳米递送系统，并引入了负电荷磷脂(PS)，在保证转染效率的基础上，通过负电荷的引入中和一部分阳离子脂质所带的正电荷，进而降低整体体系的正电荷，使整个递送体系安全性增加，降低了阳离子脂质体的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及核酸药物递送系统领域，具体地，涉及脂质体载体递送mRNA，更具体的，涉及一种在细胞水平上递送mRNA的由阳离子脂质体和负电荷磷脂组成的脂质体纳米递送系统，其正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷对转染效果的影响，以及负电荷磷脂对递送系统安全性的提高。
背景技术
核酸类药物是目前发展最为迅速和前沿的领域之一，在治疗肿瘤、遗传性疾病、代谢疾病、预防性传染病等方面不断取得突破性进展。mRNA药物作为核酸药物的一种，具有亲水性强、生物活性高、不进入细胞核即可表达出相应的目的蛋白发挥作用、过程简单、高效安全的特点，理论上能够表达所有的蛋白，可治疗多种疾病。
但mRNA药物起效目前面临多种挑战和难题。首先，mRNA是一种带有负电荷的单链大分子，这样的结构使它极其脆弱，容易被体内外的RNA酶降解。其次，mRNA和细胞膜都带有负电荷，静电排斥作用使mRNA难以穿透细胞膜进入细胞内起效，而mRNA编码信息中包含了核糖体生成的序列，必须递送至细胞内才能编码蛋白。因此mRNA药物也面临着巨大挑战。
有效的递运系统可以解决mRNA起效面临的各种难题。目前已有多种mRNA递送系统，如鱼精蛋白、阳离子纳米乳液、多糖颗粒、阳离子聚合物、脂质体纳米递送系统等。其中应用最为成熟广泛的为脂质体纳米递送系统，具有保护mRNA免于降解失活，易于携带mRNA进入细胞，转染效率高，作为递送载体不受宿主限制等优势。然而脂质纳米递送系统受到脂质体材料、电荷、比例、制备工艺等多种条件的影响，制备工艺相关的核心关键参数也是mRNA递送的关键。
现阶段的脂质体mRNA递运系统存在以下两点问题，一是脂质体纳米递送材料比例复杂，制备工艺精确，和小分子递送系统不同的是，在mRNA递运系统中，一个细微参数的变动直接会影响核酸最终表达效果的有无。
其次，由于mRNA是带负电荷的生物大分子，不能自行通过细胞质进入靶细胞，一般需要带正电荷的脂质体通过电荷吸引将其装载来实现细胞递送，因此阳离子脂质体是mRNA转染起效必不可少的关键成分，但是阳离子脂质体由于具有极性头部结构，是转染过程中造成细胞毒性的主要因素，因而对临床应用研究有一定限制。
磷脂酰丝氨酸(简称PS)是一种细胞膜中普遍存在的磷脂，与一系列的细胞膜功能有关，也是大脑细胞膜的重要成分之一，影响着细胞膜的流动性和通透性，并能激活多种酶类的代谢与合成。除此之外，磷脂酰丝氨酸在细胞膜上具有净负电荷，有助于膜的不对称性，因此能够中和阳离子脂质体所带的正电荷，为降低阳离子脂质体所造成的细胞毒性提供了可能。
因此为探究影响mRNA递送的各种参数因素，以及解决上述提到的阳离子脂质体递送的安全性问题，我们要构建一个由阳离子脂质体为主要成分的mRNA脂质体纳米递送系统，并引入了负电荷磷脂(PS)，在保证转染效率的基础上，通过负电荷的引入中和一部分阳离子脂质所带的正电荷，进而降低整体体系的正电荷，使整个递送体系安全性增加，降低了阳离子脂质体的细胞毒性。并且考察了脂质体材料、电荷、比例、制备工艺等各种因素对转染效果的影响。拟解决mRNA药物起效面临的诸多难题，同时考察其安全性，使其既有效又安全，为多种疾病提供治疗方案。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种核酸递运系统，其采用阳离子脂质体和负电荷磷脂为递送载体主要材料，装载增强型绿色荧光蛋白mRNA(EGFP mRNA)后，将mRNA递送到细胞并成功表达出绿色荧光蛋白。阳离子脂质体本身所带的正电荷可以和带负电荷的mRNA以静电作用结合在一起，这是携带mRNA进入细胞所必须的，但阳离子脂质体本身带来的细胞毒性所存在的安全性问题也需要解决。本发明的又一目的在于引入负电荷磷脂，中和阳离子脂质体所带的部分正电荷，在保证了整体系统转染效率的基础上提高递送系统的安全性。除此之外，本专利还提供了脂质体主要材料、正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷等各合成制备条件对转染效果的影响。
为实现上述目的，本发明第一方面涉及一种核酸递运系统的组成，其以球状的阳离子脂质体和负电荷磷脂为载体主要材料，所述载体内含有被递送的核糖核酸。
本发明第一方面的一些实施方式中，“球状”指圆球形或类似球形。本发明第一方面的一些实施方式中，其中阳离子脂质材料优选(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷氯盐(DOTMA)，进一步优选为DOTAP；其中负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(PS)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)；其中载体中还可以包括辅助脂质材料，该辅助脂质材料选自胆固醇、DSPE-PEG2000中的一种或几种。
本发明第一方面的一些实施方式中，其中被递送的核糖核酸选自信使RNA(mRNA)，进一步优选为增强型绿色荧光蛋白mRNA(EGFP mRNA)。
本发明第一方面的一些实施方式中，球状的载体由双分子层环绕形成，其中，内分子层为亲水性，外分子层为疏水性。
本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中阳离子脂质体材料和负电荷磷脂材料的摩尔比为10:0-0:10，如10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10，优选9:1-6:4，更优选为7：3。
本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中脂质体材料为阳离子脂质体材料、负电荷磷脂材料和辅助脂质材料，其中阳离子脂质体材料、负电荷磷脂材料、辅助脂质材料的摩尔比为7:3:(0-21)，优选7:3:0、7:3:1、7:3:3、7:3:7、7:3:14、7:3:21，进一步优选为7：3：14。
本发明第一方面的一些实施方式中，核酸递运系统中总脂质与核酸质量比(g/g)为0.37-37g/g，优选0.444-35.556g/g，进一步优选0.889-26.667g/g，其中在不加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质与核酸质量比(g/g)为7.111g/g，其中在加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质与核酸质量比(g/g)为14.222g/g。
本发明第二方面涉及一种核酸递运系统合成的方法，包括如下步骤：
(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂材料(或加辅助脂质)按不同摩尔比混合后用一定量有机溶剂溶解，随后旋转蒸发掉有机溶剂，得到均匀的脂质体薄膜。
(2)将增强型绿色荧光蛋白mRNA的无RNA酶水溶液与薄膜以500:(12～360)ml/mg(例如500：12ml/mg、500：24ml/mg、500：48ml/mg、500：96ml/mg、500：144ml/mg、500：192ml/mg、500：240ml/mg、500：288ml/mg、500：336ml/mg、500：360ml/mg)的比例混合，得到混合物；
(3)将上述混合物超声得到核酸递运系统；
本发明第二方面的一些实施方式中，所述方法具有如下A至G中的一项或多项特征：
A.步骤(1)中，所述阳离子脂质材料选自DOTAP、DOTMA，进一步优选为(2，3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)；所述负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(PS)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)。辅助脂质选自胆固醇、DSPE-PEG2000。
B.步骤(1)中，所述有机溶剂选自氯仿、丙酮和乙醇中至少一种，优选为氯仿；
C.步骤(1)中，所述溶液中总脂质体材料和有机溶剂的比例为0.01～1mg/ml，例如0.1mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml；优选0.012-0.96mg/mL，进一步优选0.024-0.72mg/mL。
D.步骤(1)中，旋转蒸发的温度为室温；
E.步骤(2)中，所述混合物中总脂质体在水相中的浓度为0.024～0.72mg/ml，例如0.048mg/ml、0.096mg/ml、0.192mg/ml、0.384mg/ml、0.48mg/ml、0.672mg/ml；优选0.096-0.672mg/ml。
F.步骤(3)中，超声的时间为3～10分钟，例如3、4、5、6、7、8、9、10分钟；
G.核酸递运系统为本发明第一方面所述的核酸递运系统。
本发明第二方面的一些实施方式中，室温一般理解为10℃～30℃。
本发明第三方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在总浓度相同条件下，不同摩尔比所形成的核酸递运系统在Neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的摩尔比。
本发明第三方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂摩尔比范围为10:0-0:10，如10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10，优选9:1-2:8，优选9:1-6:4，更优选为7：3。
本发明第三方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
本发明第三方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第四方面涉及本发明第三方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度下的细胞活性，以及核酸递运系统为纯阳离子脂质体或纯负电荷磷脂时，不同脂质体总浓度下的细胞活性。
本发明第四方面的实施方式中，阳离子脂质体为DOTAP，负电荷磷脂为POPS，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比为7：3。
本发明第四方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比、纯阳离子脂质体、纯负电荷磷脂三种不同的递运系统在CCK-8细胞活性实验中的浓度梯度范围为0.024～0.72mg/mL，优选0.096～0.672mg/mL，更优选为0.096～0.48mg/mL，如0.096mg/mL、0.144mg/mL、0.192mg/mL、0.24mg/mL、0.288mg/mL、0.336mg/mL、0.384mg/mL、0.432mg/mL、0.48mg/mL。
本发明第四方面的实施方式中，用不同递运系统处理Neuro-2a细胞的时间为24小时。
本发明第五方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度所形成的核酸递运系统在Neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的脂质体总浓度。
本发明第五方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂在最佳摩尔比下总浓度范围为0.096～0.672mg/mL，如0.672mg/mL、0.576mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.288mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL。
本发明第五方面的实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂最佳摩尔比为7：3。
本发明第五方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第六方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质和负电荷磷脂在最佳摩尔比时，加入不同摩尔比例的辅助脂质，且保证每组总脂质体浓度相同时，所形成的核酸递运系统在Neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及加入辅助脂质后最佳转染效果时的摩尔比。
本发明第六方面的实施方式中加入的辅助脂质为胆固醇。
本发明第六方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质的摩尔比为7：3：(0-21)，优选为7：3：0、7：3：1、7：3：3、7：3：7、7：3：14、7：3：21。
本发明第六方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
本发明第六方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第七方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统中阳离子脂质、负电荷磷脂、辅助脂质在最佳摩尔比时，不同脂质体总浓度所形成的核酸递运系统在Neuro-2a细胞上转染效果的影响。以及最佳转染效果时的脂质体总浓度。
本发明第七方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质在最佳摩尔比下总浓度范围为0.024～0.72mg/mL，如0.72mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL、0.048mg/mL、0.024mg/mL。
本发明第七方面的实施方式中，阳离子脂质体、负电荷磷脂以及辅助脂质最佳摩尔比为7：3：14。
本发明第七方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第八方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统在Neuro-2a细胞上的最佳摄取时间、最佳转染时间。
本发明第八方面的一些实施方式中，所述摄取时间为将本发明第一方面所述核酸递运系统加入到提前种有Neuro-2a细胞的96孔细胞板并在0～4小时内吸走继续加新的全培养基转染至24小时，其中0～4小时为摄取时间，如0.5小时、1小时、2小时、4小时。
本发明第八方面的一些实施方式中，所述转染时间为将本发明第一方面所述核酸递运系统加入到提前种有Neuro-2a细胞的96孔细胞板中直至染色拍照的时间，如0h、3h、6h、12h、24h、48h。
本发明第八方面的一些实施方式中，涉及本发明第一方面所述的核酸递运系统由阳离子脂质和负电荷磷脂在涉及本发明的第三方面最佳摩尔比为7：3的条件下制备，脂质体总浓度为涉及本发明的第五方面为0.192mg/mL。
本发明第九方面涉及本发明第一方面所述核酸递运系统的包含本发明第二方面在内的多种制备方法对转染效果的影响。
本发明第九方面的一些实施方式中，薄膜分散法即为本发明第二方面所述方法。
本发明第九方面涉及的挤推法制备方式为：在薄膜分散法制备好的脂质体/mRNA复合物的基础上，在不低于磷脂酰丝氨酸类材料相变温度的温度下，将所述超声后的混合物通过脂质体挤出器往复挤压5～40次(优选为10～30次，例如11次、13次、15次、16次、17次、18次、20次、22次、25次、28次、35次)，得到核酸递运系统；其中，所述脂质体挤出器中聚碳酸酯膜的孔径为80～200nm(优选为100～200nm，例如110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm)。
本发明第九方面涉及的混合法制备方式包括以下步骤：
(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂以最佳摩尔比混合溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜，
(2)加入无RNA酶水并超声得到空脂质体水溶液，
(3)将EGFP mRNA溶液(1mg/mL)加入与其混合得到脂质体/mRNA复合物溶液。
本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(2)中所加入的无RNA酶水和步骤(3)中的EGFP mRNA溶液总体积为500μL。
本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(3)中混合时间为5～15min,如6min、7min、8min、9min、10min，优选10min。
本发明第九方面涉及的乙醇混合法制备方式包括以下步骤：
(1)将阳离子脂质体和负电荷磷脂以最佳摩尔比混合溶于乙醇中，将EGFP mRNA取(1mg/mL)溶于无RNA酶水并置于鸡心瓶中。
(2)放入磁子，打开磁力搅拌器。
(3)用移液枪将脂质体的乙醇溶液缓慢滴加至mRNA水溶液中。
(4)滴加完成后，用旋蒸仪旋蒸除去乙醇。
本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(1)中所加入的无RNA酶水和EGFP mRNA溶液总体积为500μL，乙醇体积为水相总体积的1/3，总脂质体在水相的最终浓度为0.192mg/mL。
本发明第九方面的一些实施方式中，步骤(2)中磁力搅拌器的转速为500～1000rpm，如600rpm,700rpm,800rpm,900rpm。
本发明第十方面涉及本发明第九方面混合法制备方式制备的由阳离子脂质和负电荷磷脂所形成不同摩尔比的脂质体/mRNA复合物在Neuro-2a细胞上的转染效果。
本发明第十方面的一些实施方式中，阳离子脂质体DOTAP的绝对浓度始终保持一致为0.1328mg/mL。
本发明第十方面的一些实施方式中，阳离子脂质体和负电荷磷脂的摩尔比范围为7：0～7：14，如7：0、7：3、7：7、7：14。
本发明第十方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第十一方面涉及本发明第二方面所述核酸递运系统的合成方法。
本发明第十一方面涉及可电离脂质和负电荷磷脂在总浓度相同条件下，不同摩尔比所形成的核酸递运系统在Neuro-2a细胞上转染效果的影响。
本发明第十一方面的实施方式中，阳离子脂质体DOTAP由可电离脂质体代替，其中可电离脂质材料优选DODAP、DODMA、DLin-MC3-DMA，进一步优选为DODAP。负电荷磷脂材料选自磷脂酰丝氨酸(PS)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)。
本发明第十一方面的实施方式中，可电离脂质体和负电荷磷脂的摩尔比范围为10:0-0:10，优选9：1～2：8，进一步优选8：2～3：7，如8：2、6：4、5：5、4：6、3：7。
本发明第十一方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
本发明第十一方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明第十二方面涉及本发明第二方面所述核酸递运系统的合成方法。其中所用脂质体为可电离脂质体DODAP，未加负电荷磷脂。mRNA溶液体系为无RNA酶水或PH＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
本发明第十二方面的实施方式中，脂质体总浓度均为0.384mg/mL。
本发明第十二方面的实施方式中，转染时间为24小时。
本发明中，如无特殊说明，其中：
术语“mRNA”是指信使核糖核酸，是由DNA的一条链作为模板转录而来，携带遗传信息、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。
术语“MEM”是指最低必须培养基。
术语“EGFP mRNA”是能表达增强型绿色荧光蛋白的mRNA。
术语“PBS”是指磷酸盐缓冲溶液。
术语“Hoechst 33342”是一种用于细胞核染色的蓝色荧光染料。
术语“POPS”是指1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸。
术语“DOTAP”指(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵。
术语“DODAP”指1，2-二油酰氧基-3-(二甲氨基)丙烷。
术语“cck-8”是指一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。
术语“Neuro-2a细胞”是指小鼠神经瘤细胞。
本发明取得的有益效果：
1、本发明揭示了脂质体主要材料、正负电荷摩尔比、脂质体浓度、辅助材料、摄取时间、转染时间、制备方式、净电荷多种条件参数对EGFP mRNA在neuro-2a细胞上转染效果的影响。
2、本发明引入了负电荷磷脂材料，在保证转染效果有效性的同时，也保证了递送系统的安全性。在此次实验总脂质体浓度为0.48mg/mL时，纯DOTAP组的细胞活力仅为10％左右。而DOTAP：POPS摩尔比为7：3组的细胞活力在80％以上，可见引入负电荷磷脂材料对mRNA递运系统安全性的改善。
附图说明
为了使本发明的内容更容易倍清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为实施例1中薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的流程及复合物的结构示意图；
图2为实施例1中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DOTAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片；
图3为实施例1中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DOTAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图4为实施例2中纯DOTAP、纯POPS、DOTAP：POPS＝7：3的摩尔比分别处理Neuro-2a细胞24小时的细胞活性统计图；
图5为实施例3中薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图；
图6为实施例3中DOTAP：POPS摩尔比为7：3，脂质体总浓度分别为0.672mg/mL,0.576mg/mL,0.48mg/mL,0.384mg/mL,0.288mg/mL,0.192mg/mL,0.096mg/mL时转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片；
图7为实施例3中和图6相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图8为实施例4中薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图；
图9为实施例4中DOTAP：POPS:胆固醇摩尔比分别为7：3：0，7：3：1，7：3：3，7：3：7，7：3：14，7：3：21,且保证各组总脂质体浓度均为0.48mg/mL，EGFP mRNA浓度为0.027mg/mL时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片；
图10为实施例4中和图9相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图11为实施例5中DOTAP：POPS：胆固醇摩尔比为7：3：14，脂质体总浓度分别为0.672mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL、0.048mg/mL、0.024mg/mL时转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片；
图12为实施例5中和图11相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图13为实施例6中摄取实验流程图；
图14为实施例6中摄取0.5h,1h,2h,4h时高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片；
图15为实施例6中和图14相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图16为实施例7中不同时间转染实验流程图；
图17为实施例7中转染时间为0h,3h,6h,12h,24h,48h时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片；
图18为实施例7中和图17相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图19为实施例8中不同方法的脂质体/EGFP mRNA复合物的制备流程；
图20为实施例8中四种不同制备方式下，转染时间为24h时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片；
图21为实施例8中和图20相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图22为实施例9中采用混合法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的制备流程图(以纯DOTAP为例)及形成的复合物结构示意图；
图23为实施例9中四种不同比例下，高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片；
图24为实施例9中和图23相同的条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图25为实施例10中薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的流程图。
图26为实施例10中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DODAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片；
图27为实施例10中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DODAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图；
图28为实施例11中薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的流程图。
图29为实施例11中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，纯DODAP用不同溶液体系制备的脂质体/EGFP mRNA复合物转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片；
图30为实施例11中脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，纯DODAP用不同溶液体系制备的脂质体/EGFP mRNA复合物转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：DOTAP/POPS不同摩尔比对EGFP mRNA转染效果的影响(薄膜超声法)
(1)细胞培养：将Neuro-2a细胞以3×105细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔100微升消化好的细胞悬液，使用含10％的胎牛血清(FBS)和1％双抗的MEM培养基在37℃CO2细胞培养箱中培养24小时。24小时后换液，每孔100μL新培养基。
(2)实验分组：DOTAP:POPS摩尔比为10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10以及空白组共12组，脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DOTAP和POPS以10：0到0：10的摩尔比混合，且每组脂质体的总质量均为240μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每种摩尔比的脂质体总浓度为0.48mg/mL，最终形成11组不同比例的脂质体/mRNA复合物。制备流程及形成的脂质体/mRNA复合物结构示意图如图1所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入(1)培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，空白组加入等体积的PBS溶液。继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图2、图3所示。
(5)实验结果：
图1a为薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的流程图，以纯DOTAP/EGFPmRNA的制备过程为例，在将鸡心瓶上的脂质体薄膜超声的过程中，脂质体薄膜从鸡心瓶的壁上脱落下来，排列成球状双分子层结构，将水溶液中的EGFP mRNA包裹在球状结构的内部。图1b为DOTAP：POPS摩尔比为10：0时所制备的复合物结构示意图；图1c为DOTAP：POPS摩尔比为9：1，8：2，7：3，6：4时所制备的复合物结构示意图；图1d为DOTAP：POPS摩尔比为5:5时所制备的复合物结构示意图；图1e为DOTAP：POPS摩尔比为4:6,3:7,2:8,1:9时所制备的复合物结构示意图；图1f为DOTAP：POPS摩尔比为0:10时所制备的复合物结构示意图。
图2为脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DOTAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片。
图3为脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DOTAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图2可知，递送系统净电荷为正和为零则可实现mRNA的有效转染，即DOTAP和POPS的摩尔比大于等于1时，可成功将EGFP mRNA递送到细胞，并且使其成功表达出绿色荧光蛋白。
由图3可知，在脂质体总浓度相同的条件下，纯DOTAP组的转染效果最高，且显著高于DOTAP：POPS摩尔比大于等于1的其他组。DOTAP：POPS摩尔比为7：3的转染效果显著高于6:4和5：5组，但与9：1和8：2组相比，无显著性差异，只有偏高的趋势。
实施例2：DOTAP、POPS、DOTAP：POPS＝7：3细胞活力考察。
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)细胞活性实验：称取脂质体适量，并用适量氯仿在鸡心瓶内旋蒸，用无RNA酶水超声，使脂质体的浓度为2.9mg/mL，用小型脂质体挤出器将其挤推通过0.1μm孔径的聚碳酸脂膜，反复挤推10次。将推好的脂质体用含10％的胎牛血清(FBS)和1％双抗的MEM培养基稀释10倍，得到浓度为0.29mg/mL的稀释液，随后依次用上述培养基将此稀释液稀释为原浓度的0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2倍，将上述细胞中的原培养基吸走，之后将9个浓度的脂质体稀释液以及空白培养基按浓度从低到高的的顺序从左往右依次加入上述细胞中，每个浓度设6个复孔，每孔250μL，继续放细胞培养箱处理24小时。24小时之后，将孔内液体吸走，用培养基和cck-8试剂以10：1的体积比配置混合液，每孔110μL，放回细胞培养箱继续孵育1小时后，用酶标仪在450nm处测量吸光度值。DOTAP、POPS、DOTAP：POPS＝7：3不同浓度的脂质体细胞活性如图4所示。
(3)实验结果：
图4从左到右依次为纯DOTAP、纯POPS、DOTAP：POPS＝7：3的摩尔比分别处理Neuro-2a细胞24小时的细胞活性统计图，每种脂质体的总浓度梯度均设为：0.096mg/mL、0.144mg/mL、0.192mg/mL、0.24mg/mL、0.288mg/mL、0.336mg/mL、0.384mg/mL、0.432mg/mL、0.48mg/mL。
由图4可知，CCK-8细胞实验验证了正电荷对体系的影响，虽然高的正电荷有利于体系的转染，但是同时其对细胞膜的强干扰导致细胞的存活率较低，在此次实验总脂质体浓度为0.48mg/mL时，纯DOTAP组的细胞活力仅为10％左右。而DOTAP：POPS摩尔比为7：3组的细胞活力在80％以上。单纯的DOTAP浓度在达到0.288mg/mL时，约65％的细胞凋亡，而同浓度下的负电荷材料则没有该现象。而DOTAP在总脂质体浓度下降到最高浓度的一半0.24mg/mL时，细胞活性也仅为70％左右，可见其毒性之大。因此，综合转染数据可知，通过体系电荷的调整，在DOTAP摩尔比为70％的条件下，mRNA可以实现有效的转染，同时细胞的存活率在90％以上，在保证转染效果有效性的同时，也保证了递送系统的安全性，因此，DOTAP和POPS以7:3的摩尔比是满足递送系统有效性和安全性的最佳条件，负电荷材料的适当加入，不影响转染效率，同时能提高递送系统的安全性。
实施例3：DOTAP/POPS最佳摩尔比脂质体总浓度对EGFP mRNA转染效果的影响(薄膜超声法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：DOTAP和POPS脂质体总浓度分别为0.672mg/mL、0.576mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.288mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL共7组，DOTAP和POPS摩尔比均为7：3。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，设置脂质体的总质量分别为336μg、288μg、240μg、192μg、144μg、96μg、48μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每组脂质体总浓度分别为0.672mg/mL、0.576mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.288mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL，最终形成7组不同浓度的脂质体/mRNA复合物。制备流程如图5所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图6、图7所示。
(5)实验结果：
图5为薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图。
图6为DOTAP：POPS摩尔比为7：3，脂质体总浓度分别为0.672mg/mL,0.576mg/mL,0.48mg/mL,0.384mg/mL,0.288mg/mL,0.192mg/mL,0.096mg/mL时转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片。
图7为上述条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图6、图7可知，脂质体的总浓度并非越高越好，过高的浓度可能影响mRNA的释放与转染。在不添加胆固醇组分的情况下，决定电荷的DOTAP和POPS两种主要脂质(摩尔比为7:3)总浓度在低于0.48mg/mL时也可实现EGFP mRNA的有效转染，在浓度为0.192mg/mL时效果最好，且比其它组均显著偏高。
实施例4：DOTAP/POPS最佳摩尔比基础上加入辅助脂质胆固醇不同比例对转染效果的影响(薄膜超声法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：DOTAP:POPS：胆固醇摩尔比为7：3：0、7：3：1、7：3：3、7：3：7、7：3：14、7：3：21共6组，脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DOTAP、POPS、胆固醇以7：3：0、7：3：1、7：3：3、7：3：7、7：3：14、7：3：21的摩尔比(共6组)混合，且每组脂质体的总质量均为240μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每种摩尔比的脂质体总浓度为0.48mg/mL，最终形成6组不同比例的脂质体/mRNA复合物。制备流程如图8所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图9、图10所示。
(5)实验结果：
图8为薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图
图9为DOTAP：POPS:胆固醇摩尔比分别为7：3：0，7：3：1，7：3：3，7：3：7，7：3：14，7：3：21,且保证各组总脂质体浓度均为0.48mg/mL，EGFP mRNA浓度为0.027mg/mL时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片。
图10为上述条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图9、图10可知，7：3：14组的转染效果最好，均显著高于添加胆固醇的其他比例组，且和不加胆固醇的组相比无显著性差异。从以上结果可看出，在维持了电荷比例脂质体的条件下，胆固醇的添加，能稳定脂质体的结构，在达到体系摩尔比约14/24的时候，可实现最佳的转染效果，过高的胆固醇的添加，由于过于稀释了主要脂质体(DOTAP和POPS)在整体体系中的含量，反而不利于整体的转染效果。另外，主要脂质体(DOTAP和POPS)在体系中的含量对整体的转染效果没有决定性的影响，留出了比例空间给随后的其他功能性组分的添加。
实施例5：DOTAP/POPS/胆固醇最佳摩尔比不同脂质体总浓度对EGFP mRNA转染效果的影响(薄膜超声法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：DOTAP、POPS和胆固醇脂质体总浓度分别为0.72mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL、0.048mg/mL、0.024mg/mL共7组，DOTAP：POPS:胆固醇摩尔比均为7：3：14。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DOTAP、POPS和胆固醇以7：3：14的摩尔比混合，设置脂质体的总质量分别为360μg、240μg、192μg、96μg、48μg、24μg、12μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFPmRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每组脂质体总浓度分别为0.72mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL、0.048mg/mL、0.024mg/mL，最终形成7组不同浓度的脂质体/mRNA复合物。制备流程如图8所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图11、图12所示。
(5)实验结果：
图11为DOTAP：POPS：胆固醇摩尔比为7：3：14，脂质体总浓度分别为0.72mg/mL、0.48mg/mL、0.384mg/mL、0.192mg/mL、0.096mg/mL、0.048mg/mL、0.024mg/mL时转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片。
图12为上述条件转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图11、图12可知，进一步考察加入胆固醇后效果，在选用最佳比例即7:3:14时，当浓度为0.384mg/mL时效果最佳。在该递运系统中，脂质体含量占10/24，实际脂质体的浓度为0.16mg/mL，与非胆固醇添加时脂质体最佳转染浓度(0.192mg/mL)接近，证明在递运系统中，核心影响因素是带电荷的DOTAP和POPS组分。
实施例6：DOTAP/POPS最佳摩尔比-EGFP mRNA不同时间摄取实验(薄膜超声法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：摄取0.5h、1h、2h、4h组。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，且使脂质体的总质量为96μg，溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每组脂质体总浓度均为0.192mg/mL，最终形成4组完全相同的脂质体/mRNA复合物。实验流程如图13所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱分别处理0.5小时、1小时、2小时、4小时之后，将每个孔内的液体全部吸走，PBS洗三遍，加入新的培养基继续培养至24小时。用Hoechst33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图14、图15所示。
(5)实验结果：
图13为摄取实验流程图。
图14为摄取0.5h,1h,2h,4h时高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片。
图15为上述实验荧光定量结果。
图14、图15显示0.5h和1h内，EGFP mRNA很少量被细胞摄取，至少需要2h才较多被细胞摄取，4h可大量被细胞摄取。
实施例7：DOTAP/POPS最佳摩尔比-EGFP mRNA不同时间对转染效果的影响(薄膜超声法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：转染0h、3h、6h、12h、24h、48h组。
(3)薄膜超声法制备脂质体-EGFP mRNA复合物：称取DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，且使脂质体的总质量为96μg，溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每组脂质体总浓度均为0.192mg/mL，最终形成6组完全相同的脂质体/mRNA复合物。实验流程如图16所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱分别处理0小时、3小时、6小时、12小时、24小时、48小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图18、图19所示。
(5)实验结果：
图16为不同时间转染实验流程图。
图17为转染时间为0h,3h,6h,12h,24h,48h时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片。
图18为上述实验荧光定量结果。
图17、图18显示EGFP mRNA至少需要12h才可以实现有效转染，6小时及以下均不能表达出绿色荧光蛋白，24小时转染效果最佳，且显著高于其他时间组，48小时后，相比于24小时转染效果下降，可能时因为细胞活性变差，绿色荧光蛋白降解的原因。
实施例8：DOTAP/POPS-EGFP mRNA不同制备方式考察
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：薄膜分散法、挤推法、混合法、乙醇混合法组。
(3)用不同方法制备脂质体/mRNA复合物:(1)薄膜分散法：称取DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，且使脂质体的总质量为96μg，溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每组脂质体总浓度均为0.192mg/mL，最终形成制备好的脂质体/mRNA复合物。(2)挤推法：在薄膜分散法制备好的脂质体/mRNA复合物的基础上，用小型脂质体挤出器将其挤推通过0.1μm孔径的聚碳酸脂膜，反复挤推10次。(3)混合法：称取DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，且使脂质体的总质量为96μg，溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜，加入486.5μL无RNA酶水并超声5min得到空脂质体水溶液，随后将13.5μL EGFP mRNA(1mg/mL)加入与其混合10min得到脂质体/mRNA复合物溶液。(4)乙醇混合法：将DOTAP、POPS以7：3的摩尔比混合，且使脂质体的总质量为96μg溶于166μL乙醇中，将EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水并置于鸡心瓶中，放入磁子，打开磁力搅拌器使转速为1000rmp,用移液枪将脂质体的乙醇溶液缓慢滴加至mRNA水溶液中，滴加完成后，用旋蒸仪旋蒸除去乙醇。
(4)细胞转染：将上述四种方法制备好的脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。
(5)实验结果
图19为不同方法的脂质体/EGFP mRNA复合物的制备流程。
图20为四种不同制备方式下，转染时间为24h时的高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片。
图21为上述实验荧光定量结果。
图20、图21显示薄膜分散法和混合法可实现EGFP mRNA的有效转染，而在薄膜分散法的基础上增加了挤推这一步操作的挤推法几乎没有绿色荧光蛋白的表达，这说明挤推过程可将形成的脂质体/mRNA复合物破坏，也可能将mRNA截留在了聚碳酸脂膜上。乙醇混合法类似于微流控的合成方法，未转染出绿色荧光蛋白可能是因为转速等参数不合适，或者残留的乙醇未除干净，对细胞造成了损害，从而导致转染失败。薄膜分散法和混合方法均能实现良好的转染效果，由于脂质体形成了磷脂双分子结构，带电荷的头部既可以裸露在球状外壳的表面，也可以聚集在球状脂质体内部，这两种制备方式导致带负电的mRNA被包裹在脂质体内部和粘在脂质体球状外壳表面，说明在单纯的体外环境下，没有体内各种复杂的环境，mRNA即使未被包裹，仅粘在脂质体外壳表面也可以实验细胞的高效转染。
实施例9：DOTAP/POPS净电荷对EGFP mRNA转染效果的影响(混合法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：DOTAP:POPS摩尔比为7：0、7：3、7：7、7：14共4组，每组中DOTAP的浓度均为0.1328mg/mL。
(3)用混合法制备脂质体/mRNA复合物:保持DOTAP脂质体总量不变，在脂质体体系中逐渐增加POPS的比例，称取DOTAP、POPS以7：0、7：3、7：7、7：14的摩尔比混合，使每组DOTAP的质量固定为66.4μg，溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜，加入486.5μL无RNA酶水并超声5min得到空脂质体水溶液，随后将13.5μL EGFPmRNA(1mg/mL)加入与其混合10min得到脂质体/mRNA复合物溶液。
(4)细胞转染：将制备好的四组脂质体/mRNA复合物加入上述培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst 33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。
(5)实验结果
图22为采用混合法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的制备流程图(以纯DOTAP为例)。图22b-e分别为DOTAP：POPS摩尔比为7：0，7：3，7：7，7：14时制备好的脂质体/mRNA复合物结构示意图。
图23为四种不同比例下，高内涵拍摄的Neuro-2a细胞转染效果图片。
图24为上述实验荧光定量结果。
图23、图24结果显示，随着体系内POPS的比例的升高，即使DOTAP的量不变，转染效率逐渐降低，与7：3组相比，纯DOTAP有十分高的转染效率，然而二者比例达到7：7，即净电荷为0时，转染效率大大降低，仅有一点点，而在比例为7：14时，整个体系内净电荷为负，不能实现mRNA的有效转染，固定了核心的正电荷脂质体的用量，调整负电荷的用量，说明影响mRNA转染效果的是总脂质体的净电荷量而不是总脂质体中带正电荷的量，证明在脂质体递送体系中，决定转染效果的，是核心材料占整个脂质体系统的比例，而不是其单一用量。
实施例10：DODAP/POPS不同摩尔比对EGFP mRNA转染效果的影响(薄膜分散法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：DODAP:POPS摩尔比为8：2、6：4、5：5、4：6、3：7共5组，每组中脂质体总浓度均为0.48mg/mL。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取DODAP和POPS分别以8：2、6：4、5：5、4：6、3：7的摩尔比混合，且每组脂质体的总质量均为240μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每种摩尔比的脂质体总浓度为0.48mg/mL，最终形成5组不同比例的脂质体/mRNA复合物。制备流程及形成的脂质体/mRNA复合物结构示意图如图25所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入(1)培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，空白组加入等体积的PBS溶液。继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图2、图3所示。
(5)实验结果：
图25为薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图。
图26为脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DODAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片。
图27为脂质体总浓度均为0.48mg/mL时，DODAP：POPS不同摩尔比转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图26图27可知，将阳离子脂质体DOTAP替换成可电离脂质体DODAP，且依旧用薄膜分散法制备时，无论是怎样的摩尔比都无法实现mRNA的有效转染。其原因可能是可电离脂质体本身不带净电荷，需要柠檬酸-柠檬酸钠酸性缓冲液中的氢离子将其电离带正电荷才可发挥阳离子脂质体的作用，与带负电荷的mRNA相结合，而仅用中性的水作为溶剂不能够净电吸引带负电荷的mRNA。
实施例11：DODAP不同溶液体系对EGFP mRNA转染效果的影响(薄膜分散法)
(1)细胞培养见实施例1(1)
(2)实验分组：纯DODAP无RNA酶水组、纯DODAP柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液组。每组中脂质体总浓度均为0.384mg/mL。
(3)薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物：称取纯DODAP，每组脂质体的总质量均为192μg，分别溶于一定量氯仿中，用旋转蒸发仪旋蒸直到在鸡心瓶上形成一层均匀的薄膜。EGFP mRNA取13.5μL(1mg/mL)溶于486.5μL无RNA酶水或PH＝4的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，混匀后加入到旋蒸好的鸡心瓶中，在超声仪中超声5min,使每种摩尔比的脂质体总浓度为0.384mg/mL，最终形成2组不同溶液体系的脂质体/mRNA复合物。制备流程及形成的脂质体/mRNA复合物结构示意图如图28所示。
(4)细胞转染：将脂质体/mRNA复合物加入(1)培养好的细胞中，每组设3个复孔，每个复孔150μL，空白组加入等体积的PBS溶液。继续放细胞培养箱处理24小时。用Hoechst33342对细胞核染色，使用IXM-C型高内涵成像分析系统观察EGFP mRNA的表达并用10倍镜拍摄。每组的荧光照片及定量分析如图2、图3所示。
(5)实验结果：
图28为薄膜超声法制备脂质体/EGFP mRNA复合物的结构及流程图。
图29为脂质体总浓度为0.384mg/mL时，不同溶液体系制备的脂质体/mRNA复合物转染Neuro-2a细胞以10倍比例拍摄的高内涵荧光照片。
图30为脂质体总浓度为0.384mg/mL时，不同溶液体系制备的脂质体/mRNA复合物转染Neuro-2a细胞的荧光定量统计图。
由图29图30可知，纯阳离子脂质体DODAP无论在中性的无RNA酶缓冲液体系还是在PH＝4的酸性柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系均无法实现mRNA的有效转染。这说明薄膜超声法的制备方式可能不适用于可电离脂质体。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (19)
1.一种核酸递运系统，其特征在于，该核酸递运系统包括载体以及载体内被递送的核糖核酸，其中载体包括球状的阳离子脂质体、负电荷磷脂。
2.根据权利要求1所述的核酸递运系统，其中阳离子脂质体选自DOTAP、DOTMA，进一步优选为DOTAP。
3.根据权利要求1所述的核酸递运系统，其中负电荷磷脂选自磷脂酰丝氨酸(PS)，进一步优选为1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰丝氨酸(POPS)。
4.根据权利要求1所述的核酸递运系统，其中被递送的核糖核酸选自信使RNA(mRNA)，进一步优选为增强型绿色荧光蛋白mRNA(EGFP mRNA)。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸递运系统，其中阳离子脂质体可被可电离脂质体替代，可电离脂质体选自DODAP、DODMA、DLin-MC3-DMA，进一步优选为DODAP。
6.根据权利要求1-5任一项所述的核酸递运系统，其中载体中还可以包括辅助脂质，该辅助脂质选自胆固醇、DSPE-PEG2000中的一种或几种。
7.根据权利要求1-4任一项所述的核酸递运系统，其中阳离子脂质体和负电荷磷脂的摩尔比为10:0-0:10，优选9:1-6:4，进一步优选为7：3。
8.根据权利要求5所述的核酸递运系统，其中可电离脂质体和负电荷磷脂的摩尔比为10:0-0:10，优选9:1-2:8，进一步优选为8:2-3:7。
9.根据权利要求6所述的核酸递运系统，其中阳离子脂质体或可电离脂质、负电荷磷脂、辅助脂质的摩尔比为7:3:(0-21)，优选7:3:0、7:3:1、7:3:3、7:3:7、7:3:14、7:3:21，进一步优选为7：3：14。
10.根据权利要求1-9任一项所述的核酸递运系统，该核酸递运系统中总脂质体材料与核酸质量比(g/g)为0.37-37g/g，优选0.444-35.556g/g，进一步优选0.889-26.667g/g，其中在不加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质体材料与核酸质量比(g/g)为7.111g/g，其中在加入辅助脂质条件下具有最佳转染效果的总脂质体材料与核酸质量比(g/g)为14.222g/g。
11.如权利要求1-10中任一项所述核酸递运系统的制备方法，包括如下步骤：(1)根据产物结构选择阳离子脂质体、可电离脂质体、负电荷磷脂、辅助脂质中的几种作为原料，按照摩尔比称取上述所选原料混合后共同溶于一定量有机溶剂中，旋蒸后得到均匀的脂质体薄膜；(2)将核糖核酸mRNA的无RNA酶水溶液体系与脂质体薄膜以500:(12-360)ml/mg的比例混合，得到混合物；(3)将上述混合物超声形成脂质体/mRNA复合物，即所述核酸递运系统。
12.如权利要求1-10中任一项所述核酸递运系统的制备方法，包括如下步骤：(1)根据产物结构选择阳离子脂质体、可电离脂质体、负电荷磷脂、辅助脂质中的几种作为原料，按照摩尔比称取上述所选原料混合后共同溶于一定量有机溶剂中，旋蒸后得到均匀的脂质体薄膜；(2)将核糖核酸mRNA的无RNA酶水溶液体系与脂质体薄膜以500:(12-360)ml/mg的比例混合，得到混合物；(3)将上述混合物超声处理形成脂质体/mRNA复合物，在不低于所述负电荷磷脂材料相变温度的温度下，将所述脂质体/mRNA复合物通过脂质体挤出器往复挤压5-40次得到核酸递运系统；其中，所述脂质体挤出器中聚碳酸酯膜的孔径为80-200nm。
13.如权利要求1-10中任一项所述核酸递运系统的制备方法，包括如下步骤：(1)根据产物结构选择阳离子脂质体、可电离脂质体、负电荷磷脂、辅助脂质中的几种作为原料，按照摩尔比称取上述所选原料混合后共同溶于一定量有机溶剂中，旋蒸后得到均匀的脂质体薄膜；(2)加入无RNA酶水超声得到空脂质体溶液；(3)将核糖核酸mRNA加入与空脂质体溶液混合得到脂质体/mRNA复合物溶液，即所述核酸递运系统。
14.如权利要求1-10中任一项所述核酸递运系统的制备方法，包括如下步骤：(1)根据产物结构选择阳离子脂质体、可电离脂质体、负电荷磷脂、辅助脂质中的几种作为原料，按照摩尔比称取上述所选原料混合后共同溶于一定量乙醇中；(2)磁力搅拌下，用移液枪将上述脂质体的乙醇溶液缓慢滴加至核糖核酸mRNA的无RNA酶水溶液体系中；(3)滴加完成后，旋蒸除去乙醇得到脂质体/mRNA复合物，即所述核酸递运系统。
15.根据权利要求11-14任一项所述核酸递运系统的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述溶液中总脂质体材料和有机溶剂的比例为0.01-1mg/ml，优选0.012-0.96mg/mL，进一步优选0.024-0.72mg/mL。
16.根据权利要求11-14任一项所述核酸递运系统的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述混合物或脂质体溶液中总脂质体的浓度为0.024～0.72mg/ml，优选0.096-0.672mg/ml。
17.根据权利要求1-10中任一项所述的核酸递送系统的用途，其特征在于，该核酸递送系统能在细胞上实现有效转染。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述细胞包括Neuro-2a细胞、293T细胞、PC-12细胞、Hela细胞中的一种或多种。
19.如权利要求17-18任一项所述的用途，所述转染方法包括以下步骤：(1)常规细胞转染；(2)细胞摄取时间转染(3)探究最佳总时间转染；(4)细胞活性实验方法；其特征在于，所述细胞上摄取时间为0-4小时，优选4小时；所述细胞上转染时间为0-48小时，优选24小时；核酸递送系统在细胞活性试验中的浓度梯度为0.024～0.72mg/mL，优选0.096～0.672mg/mL，进一步优选0.096～0.48mg/mL。
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