CN116024247A

CN116024247A - 一种鳜蛙虹彩病毒疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN116024247A
Application number: CN202211567552.1A
Authority: CN
Inventors: 马艳平; 刘振兴; 郝乐; 冯国清
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-07
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2042-12-07
Also published as: CN116024247B

Abstract

本发明公开了一种鳜蛙虹彩病毒疫苗及其制备方法和应用，该鳜蛙虹彩病毒疫苗包含重组酵母，重组酵母包括有重组质粒，其中该重组质粒包含编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示区段的核苷酸序列，该重组酵母可制备形成可用于口服的鳜蛙虹彩病毒疫苗，该鳜蛙虹彩病毒疫苗具有很高的免疫原性和免疫保护力，能够很好地提高鳜鱼、大口黑鲈抗鳜蛙虹彩病毒能力。

Description

一种鳜蛙虹彩病毒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗病毒疫苗技术领域，具体涉及一种鳜蛙虹彩病毒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

鳜鱼(Siniperca chuatsi)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)属传统的淡水中高档养殖品种，据《中国渔业统计年鉴2022》的数据，全国大口黑鲈养殖量70.21万吨，广东产量36.86万吨，全国鳜鱼养殖量37.40万吨，广东产量14.24万吨，均居国内首位。但是鳜、鲈养殖业面临着病害频发的威胁，给鳜、鲈养殖业造成了严重的经济损失，《2022中国水生动物卫生状况报告》的数字显示，鳜鱼因病害造成的经济损失达11亿元，鲈鱼因病害造成的经济损失达17亿元。

鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus,MRV)是隶属虹彩病毒科(Iridoviridae)、蛙虹彩病毒属(Ranavirus)的20面体胞浆DNA病毒，基因组大小95.974kb，编码102个ORF，与大口黑鲈病毒(Largemouth bass virus)同源性>98％。2017年杂交鳜中报道了该病毒疫情，可造成鳜、鲈20-60％死亡率。实验室人工感染鳜鱼、大口黑鲈可造成100％死亡率。目前为止尚无针对MRV的商品化疫苗，影响了该病毒的防控。

主衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)是MRV的二十面体衣壳蛋白，其分子量约为49kDa，占病毒总蛋白的40％以上，MCP含有很多高度保守的结构域，其基因序列及其氨基酸序列的同源性是研究虹彩病毒分类及其变异的靶基因，不仅在病毒的侵染过程中发挥重要作用，而且还是病毒重要的抗原相关蛋白。

十四烷基化膜蛋白(Myristylated membrane protein,MMP)是虹彩病毒已知的囊膜蛋白，与虹彩病毒包装及其复制密切相关，条石鲷虹彩病毒(Rock bream iridovirus,RBIV)的研究表明，重组表达MMP蛋白的DNA疫苗免疫条石鲷后，条石鲷对RBIV产生了较高的免疫保护力，相对免疫保护率高达73.36％。

pYD1/酿酒酵母(EBY100)展示系统是一种展示异源蛋白的真核展示系统，酵母细胞对异源蛋白表达后将其运送至细胞外并利用二硫键将目的蛋白锚定于酵母细胞表面，使其结构更加接近病毒表面的天然蛋白，进行免疫时更加容易被免疫系统所识别。并且酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞是食品/生物安全级的真核微生物，不但能够对外源蛋白进行简单的翻译后加工修饰，而且酵母本身也是很好的免疫佐剂成分，这些优势使该系统成为口服疫苗研发的热门工具。

目前，对于鳜蛙虹彩病毒疫苗研究较少，而鉴于对疫苗的免疫原性的高要求，真正能够用于鳜鱼、大口黑鲈的鳜蛙虹彩病毒疫苗则更少见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鳜蛙虹彩病毒疫苗，该鳜蛙虹彩病毒疫苗具有很高的免疫原性和免疫保护力，能够很好地提高鳜鱼、大口黑鲈抗鳜蛙虹彩病毒能力。

实现上述目的包括如下技术方案。

一种重组质粒，所述重组质粒包含：

编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示区段的核苷酸序列。

在其中一些实施例中，所述重组质粒是以pYD1-GFP为骨架质粒。

一种重组酵母，包括有如上所述重组质粒的酵母。

在其中一些实施例中，所述酵母是酿酒酵母EBY100。

一种如上所述的重组酵母在制备鳜蛙虹彩病毒疫苗中的应用。

一种如上所述的重组酵母在制备抗鳜蛙虹彩病毒口服疫苗中的应用。

一种鳜蛙虹彩病毒疫苗，所述鳜蛙虹彩病毒疫苗是以如上所述的重组酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备形成的制剂。

在其中一些实施例中，所述制剂为口服制剂。

一种制备重组酵母的方法，包括如下步骤：

(1)构建含有编码氨基酸序列组成为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示区段的核苷酸的重组质粒；

(2)将重组质粒转化入入酵母菌中并表达，即得重组酵母。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)中，具体包括如下步骤：

利用SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6引物对扩增MCP基因序列，得到PCR产物连接入pMD18-T载体得到MCP-T质粒；利用SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10引物对扩增MMP基因序列，得到PCR产物并纯化后连接入pMD18-T载体得到MMP-T质粒；

以MCP-T质粒为模板，分别利用SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15/SEQID NO.16、SEQ NO.17/SEQ ID NO.22引物对扩增MCP编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4所示区段的核苷酸序列得到PCR产物，以MMP-T质粒为模板，利用SEQNO.21/SEQ ID NO.20引物对扩增MMP编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示区段的核苷酸序列得到PCR产物；融合PCR得到融合后PCR片段，纯化后连接入pYD1-GFP载体得到重组质粒。

本发明获得了最优的重组蛋白抗原，其集合了MCP蛋白的三个抗原表位优势区段和MMP蛋白的一个抗原表位优势区段，经过构建质粒和在重组酵母进行表达，获得了可用于口服的鳜蛙虹彩病毒疫苗，该鳜蛙虹彩病毒疫苗具有很高的免疫原性和免疫保护力，能够很好地提高鳜鱼、大口黑鲈抗鳜蛙虹彩病毒能力。

附图说明

图1是重组质粒PCR鉴定结果；其中，a图(M:DNA marker DL2,000；1:pET32a-MCP质粒PCR鉴定结果)；b图(M:DNA marker DL2,000；1:pET32a-MMP质粒PCR鉴定结果)。

图2是pET32a-MCP、pET32a-MMP诱导表达SDS-PAGE分析结果；其中，M:预染蛋白Marker；1：E.coli Rosetta空菌30℃诱导表达表达结果；2：pET32a-MMP 30℃诱导表达结果；3：pET32a-MMP 37℃诱导表达结果；4：E.coli Rosetta空菌37℃诱导表达表达结果；5：pET32a-MCP 30℃诱导表达结果；6：pET32a-MCP 37℃诱导表达结果；7：pET32a质粒诱导表达结果。

图3是MCP、MMP重组蛋白Western-blot分析结果；其中，M:蛋白Marker；1:pET32a-MCP表达蛋白；2：pET32a-MMP表达蛋白。

图4是pYD1-GFP-trunMCP/EBY100重组酵母72h表达荧光检测结果。

图5是pYD1-GFP-trunMCP/EBY100重组酵母72h表达流式检测结果。

图6是pYD1-GFP-trunMMP/EBY100重组酵母72h表达荧光检测结果。

图7是pYD1-GFP-trunMMP/EBY100重组酵母72h表达流式检测结果。

图8是pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100重组酵母72h表达荧光检测结果。

图9是pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100重组酵母72h表达流式检测结果。

图10是大口黑鲈IgM纯化结果；其中，M:蛋白Marker；1:纯化大口黑鲈IgM。

图11是重组酵母免疫攻毒存活率曲线。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

1.研究方法

1.1引物的设计与合成

根据MRV NH-1609株主衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)和十四烷基化膜蛋白(Myristylated membrane protein,MMP)序列(GenBank No.MG941005.1)设计引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2主衣壳蛋白(Major Capsid Protein，MCP)和十四烷基化膜蛋白(Myristylated membrane protein,MMP)序列分析

以实验室分离的MRV SH2109株DNA为模板，MCP-F/MCP-R引物对扩增MCP ORF，按照北京擎科生物科技有限公司2×High Fidelity Master Mix说明书配制PCR反应体系，其中2×High Fidelity Master Mix 25μL，MCP-F引物(10μM)1μL，MCP-R引物(10μM)1μL，模板2μL，ddH₂O 21μL，扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸8min。利用MMP-F/MMP-R引物对扩增MMP ORF，按照北京擎科生物科技有限公司2×High Fidelity Master Mix说明书配制PCR反应体系，其中2×High FidelityMaster Mix 25μL，MMP-F引物(10μM)1μL，MMP-R引物(10μM)1μL，模板2μL，ddH₂O 21μL，扩增程序为：98℃预变性5min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，35个循环；72℃再延伸8min。将上述PCR产物纯化后，按pMD18-T试剂盒说明书，连接入pMD18-T载体，并送北京擎科生物科技有限公司测序获得MRV SH2109株MCP、MMP ORF全序列，重组质粒分别命名为MCP-T、MMP-T。采用TMHMM进行跨膜结构预测；采用SignalP进行信号肽预测；采用DNAstar软件、BepiPred-2.0server进行抗原表位优势区段预测。

其中，MMP的抗原表位优势区段预测结果如下所示，其中方框是DNAstar优势抗原表位区段预测结果，波浪线是Bepipred优势抗原表位区段预测结果，加粗字体是本发明选择的1个优势抗原表位。

MCP的抗原表位优势区段预测结果如下所示，其中方框是DNAstar优势抗原表位区段预测结果，波浪线是Bepipred优势抗原表位区段预测结果，加粗字体是本发明选择的3个优势抗原表位。

由上可知，最终确定MCP 3个抗原表位优势区段，其3个抗原表位优势区段分别为：

Tyr19-Met110(SEQ ID NO.2)：

YDSLDKALYGGKDATTYFVKEHYPVGWFTKLPTAATKTSGTPAFGQHFSVGVPRSGDYVLNSWLVLKTPQIKLLAANQFNNDGTIRWTKNLM。

Leu134-Val302(SEQ ID NO.3)：

LDAWNEYTMPEAKRIGYYNMIGNTSDLVNPAPATGQAGARVLPAKNLVLPLPFFFGRDSGLALPTVTLPYNEIRITISLRSIQDLLILQHKTTGEVKPIVATDLEGGLPDTVEAHVYMTVGLVTAAERQAMSSSVRDMVVEQMQMAPVHMVNPKNATVFHADLRFSHAV。

Asn311-Ala440(SEQ ID NO.4)：

NVTHKSVGSNYTCVTPVVGAGNTVLEPALAVDPVKSASLVYENTTRLPDMSVEYYSLVQPWYYAPAIPISTGHHLYSYALSLNDPHPSGSTNFGRLTNASINVSLSAEAGTAAGGGGADNSGYKNPQKYA。

MMP 1个抗原表位优势区段，该抗原表位优势区段为：

Ser18-Asp210(SEQ ID NO.1)：

SRSDYGALYWKNYTVKNGMAFKMGSPMAYFAPSGYDAASWAGTGPPVPPFRSFPKLFQGEGEPGVRPKAAHGTNAPVAGPDKGDAYLNVTNGYYHVLGDQGWKPYGNLPGHVKGVSDSWGTDDPNANFTVSKSDRYVWVDQYAPVSGTVWKFSIETTKWEQTQPASRIAIDIPLTDTPADFNVWAYKDTTLAD。

1.3表达载体构建

1.3.1 MCP、MMP原核表达载体构建与表达

以MCP-T质粒为模板，MCP-FEcoRI/MCP-RSalI为引物，按1.2配制PCR反应体系和1.2反应程序扩增MCP ORF。以MMP-T质粒为模板，MMP-FEcoRI/MMP-RSalI为引物，按1.2配制PCR反应体系和1.2反应程序扩增MMP ORF。将上述扩增产物分别通过EcoRI/SalI双酶切后插入到同样双酶切的pET32a(+)载体，转化大肠杆菌(Echerichia coli)DH5α感受态菌株，涂布Amp⁺LB固体平板，37℃倒置培养过夜，PCR筛选阳性克隆并测序验证后，提取阳性质粒转入E.coli Rosetta(DE3)感受态菌株，涂布Amp⁺LB固体平板，37℃倒置培养过夜，挑取阳性转化菌株，接种于Amp⁺抗性的5mL LB液体培养基中培养过夜，再按1:100比例接种于100mL LB新鲜液体培养基中，37℃、220r·min^–1震荡培养至菌液OD₆₀₀达到0.4-0.5后，加入1mM IPTG分别于30℃、37℃诱导表达，离心收集菌体参照Novagen PET系统手册进行可溶性分析与蛋白纯化。纯化蛋白经BCA蛋白定量试剂盒定量后，于-80℃保存。

1.3.2 MMP抗原优势表位重组酵母表达载体构建

根据1.2MMP抗原优势表位预测结果，以MMP-T质粒为模板，MMP-F(52)-EcoRI/MMP-R(630)-XhoI引物对扩增MMP 1个抗原优势表位区段(SEQ ID NO.1)，按1.2配制PCR反应体系，反应程序采用：98℃预变性5min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸20s，35个循环；72℃再延伸8min，4℃保存。PCR产物纯化后，EcoRI、XhoI双酶切，与经相同双酶切后的pYD1-GFP载体连接(pYD1-GFP质粒为实验室前期构建，参见文献：Ma et al.,2020,Res vet sci,2020，130:184-192)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态菌株，涂布Amp⁺LB固体平板，37℃倒置培养过夜，PCR筛选阳性克隆并测序验证后，重组质粒命名为pYD1-GFP-trunMMP。

1.3.3 MCP抗原优势表位重组酵母表达载体构建

根据1.2MCP抗原优势表位预测结果，以MCP-T质粒为模板，分别利用MCP-1F(55)-EcoRI/MCP-1R(330)、MCP-2F(400)/MCP-2R(906)、MCP-3F(931)/MCP-3R(1320)-XhoI引物对扩增MCP 3个抗原优势表位区段(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)。MCP 3个抗原优势表位区段PCR扩增体系配制参照1.2进行，反应程序均采用：98℃预变性5min；98℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸15s，35个循环；72℃再延伸8min，4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，将符合预期的扩增片段分别切胶纯化，SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4对应的纯化片段等体积混合，进行第一轮融合PCR扩增，反应体系为2×High FidelityMaster Mix 25μL、SEQ ID NO.2对应的纯化片段8μL、SEQ ID NO.3对应的纯化片段8μL、SEQIDNO.4对应的纯化片段8μL、ddH₂O 1μL，反应程序采用：98℃预变性5min；98℃变性15s，48℃退火15s，72℃延伸45s，16个循环；72℃再延伸8min。然后以第一轮融合后的PCR产物为模板，以MCP-1F(55)-EcoRI/MCP-3R(1320)-XhoI为引物，进行第二轮PCR扩增，反应体系为2×High Fidelity Master Mix 25μL、MCP-1F(55)-EcoRI引物1μL、MCP-3R(1320)-XhoI引物1μL、第一轮融合后的PCR产物1μL、ddH₂O 22μL，反应程序采用98℃预变性5min；98℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；72℃再延伸8min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将符合预期的目的片段切胶回收纯化，EcoRI、XhoI双酶切，与经相同双酶切后的pYD1-GFP载体连接，16℃连接过夜，连接产物转入大肠杆菌DH5α菌株，涂布Amp⁺LB固体平板，37℃倒置培养过夜，PCR筛选阳性克隆并测序验证后提取质粒，重组质粒命名为pYD1-GFP-trunMCP。

1.3.4 MMP、MCP抗原优势表位重组酵母融合表达载体构建

根据1.2MCP抗原优势表位预测结果，以MCP-T质粒为模板，分别利用MCP-1F(55)-EcoRI/MCP-1R(330)、MCP-2F(400)/MCP-2R(906)、MCP-3F(931)/MCP-3Roverlap引物对扩增MCP 3个抗原优势表位区段(SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)。以MMP-T质粒为模板，利用MCP-MMPoverlap/MMP-R(630)-XhoI引物对扩增MMP 1个抗原优势表位区段(SEQ IDNO.1)。SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4区段采用1.3.2、1.3.3反应程序。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，将扩增的片段切胶纯化，等体积混合，进行第一轮融合PCR扩增，反应体系为2×High Fidelity Master Mix 25μL、SEQ ID NO.2对应的纯化片段6μL、SEQ ID NO.3对应的纯化片段6μL、SEQ ID NO.4对应的纯化片段6μL、SEQ ID NO.1对应的纯化片段6μL、ddH₂O 1μL，反应程序采用98℃预变性5min；98℃变性20s，47℃退火20s，72℃延伸50s，16个循环；72℃再延伸8min。然后以融合后的PCR产物为模板，以MCP-1F(55)-EcoRI/MMP-R(630)-XhoI为引物，进行第二轮融合PCR扩增，反应体系为2×HighFidelity Master Mix 25μL、MCP-1F(55)-EcoRI引物1μL、MP-R(630)-XhoI引物1μL、第一轮融合后的PCR产物1μL、ddH₂O 22μL，反应程序采用98℃预变性5min；98℃变性20s，62℃退火20s，72℃延伸50s，35个循环；72℃再延伸8min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将符合预期的目的片段切胶回收纯化，EcoRI、XhoI双酶切后，与经EcoRI、XhoI双酶切后的pYD1-GFP载体连接，16℃连接过夜后，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态菌株，涂布Amp⁺LB固体平板，37℃倒置培养过夜，PCR筛选阳性克隆并测序验证后提取质粒，重组质粒命名为pYD1-GFP-trunMCP-MMP。

1.4 EBY100转化及表达条件优化

分别取15μL pYD1-GFP-trunMMP、15μL pYD1-GFP-trunMCP、15μLpYD1-GFP-trunMCP-MMP质粒按酵母转化试剂盒说明书，转化入酿酒酵母EBY100感受态细胞，涂布在含2％葡萄糖YNB固体筛选平板上，30℃倒置培养48h。待长出单菌落后，挑取单菌落至至4mL含2％葡萄糖YNB液体培养基中，30℃，200rpm/min震荡培养24h后，按酵母质粒提取试剂盒提取DNA，分别用MMP-F(52)-EcoRI/MMP-R(630)-XhoI引物对、MCP-1F(55)-EcoRI/MCP-3R(1320)-XhoI引物对、MCP-1F(55)-EcoRI/MMP-R(630)-XhoI引物对，以上述PCR反应体系和扩增条件进行PCR鉴定阳性重组酵母，并测序验证。重组酵母分别命名为pYD1-GFP-trunMMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100，加入终体积为30％的甘油保种，保种菌液存于-80℃。

接种甘油保种的重组表达酵母菌至4mL含2％葡萄糖YNB液体培养基中，30℃，180rpm/min震荡培养24h后，按1:100比例接种至200mL含2％葡萄糖YNB新鲜液体培养基中，30℃，180rpm/min继续震荡培养24h，无菌条件下，取5mL测定菌液OD₆₀₀读值。剩余菌液3,000g×5min离心后，去掉上清，菌体经无菌PBS清洗3次，接种到含2％半乳糖YNB新鲜培养基中，使OD₆₀₀读值≈0.6，放于20℃震荡培养箱，180rpm/min诱导表达，分别于诱导后24h、48h、72h，无菌条件下，分别取诱导菌体10mL，3000g离心5min，弃掉上清液，菌体用无菌PBS清洗3次，10mL PBS悬浮菌体，取10μL倒置荧光显微镜观察重组酵母表达情况，取1mL流式细胞术分析重组酵母荧光表达比例。取最佳表达条件下的重组酵母菌，3,000g×5min离心，收集菌液，无菌PBS清洗3次后，计数。

1.5重组酵母作为抗MRV口服候选疫苗效果评价

免疫前试验大口黑鲈(10g±2g)于500L蓝桶中暂养一周，并利用PCR技术检测试验鱼MRV携带情况，确保试验鱼不携带MRV。pYD1-GFP-trunMMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100、pYD1-GFP/EBY100重组酵母以及EBY100空白酵母分别以1×10⁸cfu/尾剂量，灌胃免疫大口黑鲈，并设置空白对照组，免疫两周后，每组取5条抽血，分离血清，-80℃保存备用。取各组试验鱼50尾，100μL MRV强毒株(1×10⁷TCID₅₀/mL)进行攻毒试验，每天观察发病症状和记录死亡率，并于试验结束后，计算相对免疫保护率。

1.6大口黑鲈血清特异性抗体检测ELISA方法的建立

1.6.1大口黑鲈血清IgM的纯化

采集大口黑鲈血清，与4mol/L NaCl(pH 8.3)等体积混合，取1mL加入2mol/L NaCl(pH 8.3)平衡后的rProteinA预装柱，室温静置15min，2mol/LNaCl(pH 8.3)洗涤10个柱床，0.05mol/L Gly洗脱，收集洗脱液，1:50加入Tris-HCl(pH 8.0)调节pH。纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析。

1.6.2小鼠抗大口黑鲈IgM多克隆抗体制备

以1.6.1纯化的大口黑鲈IgM为免疫原免疫Balb/C小鼠，共免疫3次，每次间隔10d，第1次抗原加等体积的弗氏完全佐剂，后2次加等体积的弗氏不完全佐剂，抗原免疫剂量为50μg/只，免疫途径为背部和腹部皮下多点注射。采血前3天用不加佐剂抗原腹腔注射加强免疫，剂量为100μg/只。免疫完成后摘除眼球采血，分离血清并采用rProtein A纯化小鼠抗大口黑鲈IgM多克隆抗体，-80℃保存。

1.6.3 ELISA测定血清效价

取1.3.1原核表达纯化的MCP、MMP蛋白(1μg)作为包被抗原，4℃包被过夜，PBST清洗5次，加入100μL 5％脱脂奶粉37℃封闭2h，分别加入免疫后大口黑鲈血清，30℃作用2h，PBST清洗5次，加入100μL 1:5000稀释的小鼠抗大口黑鲈IgM多克隆抗体，37℃作用1h，PBST清洗5次，加入100μL 1:10000稀释的HRP-山羊抗小鼠IgG，37℃作用1h，PBST清洗5次后，TMB显色，酶标仪测定OD₄₅₀读值。

2.结果

2.1 MCP、MMP抗原表位优势区段分析

MRV SH2109株MCP ORF全长1392bp，编码464个氨基酸。MMP ORF全长741bp，编码247个氨基酸。SignalP信号肽预测结果显示MCP和MMP蛋白均未包含信号肽，TMHMM预测结果显示MCP和MMP蛋白均未包含跨膜结构。DNA star软件分析蛋白质二级结构、氨基酸亲水性、表面可能性、抗原性指数等参数，初步预测了MCP、MMP蛋白抗原表位优势区段，结合BepiPred-2.0预测结果，最终确定MMP蛋白1个抗原表位优势区段，为Ser18-Asp210(SEQ IDNO.1)；确定MCP 3个抗原表位优势区段，分别为Tyr19-Met110(SEQ ID NO.2)、Leu134-Val302(SEQ ID NO.3)、Asn311-Ala440(SEQ ID NO.4)。

2.2 MCP、MMP原核表达

pET32a-MCP编码MCP全长蛋白、其融合蛋白理论分子量为77kDa。pET32a-MMP编码MMP全长蛋白、其融合蛋白理论分子量为54kDa。

重组质粒转化E.coli Rosetta感受态细胞，挑取单菌落经PCR鉴定并送测序，如图1所示，由PCR鉴定结果证实上述重组质粒读码框架正确。

经1mM IPTG,37℃、30℃诱导温度摸索，如图2所示，在不同条件下，pET32a-MCP、pET32a-MMP均得到有效表达，并且均在30℃、1mM IPTG条件下，表达量最高。经可溶性分析，重组融合蛋白呈包涵体形式表达；经抗His标签鼠单克隆抗体Western-blot分析，如图3所示，pET32a-MCP在77kDa处、pET32a-MMP在54kDa处，杂交到明显的条带。

2.3 MCP优势区段酵母表达

选择MCP蛋白3个抗原表位优势区段Tyr19-Met110(SEQ ID NO.2)、Leu134-Val302(SEQ ID NO.3)、Asn311-Ala440(SEQ ID NO.4)的55-330、400-906、931-1320编码核苷酸片段，以MCP-T质粒为模板，设计引物分别扩增三个抗原优势表位区段，经融合PCR得到融合片段，共1176bp。并将纯化后的PCR片段连接入pYD1-GFP载体，转化EBY100，经PCR和测序鉴定后，重组酵母命名为pYD1-GFP-trunMCP/EBY100。

pYD1-GFP-trunMCP/EBY100经半乳糖诱导，表达重组酵母菌，经24h、48h、72h诱导后，如图4和图5所示，72h表达量最高，流式细胞术分析重组酵母表达比例为16.0％。

2.4 MMP优势区段酵母表达

选择MMP蛋白1个抗原表位优势区段Ser18-Asp210(SEQ ID NO.1)的52-630bp编码核苷酸片段，以MMP-T质粒为模板，设计引物扩增MMP52-630bp片段，纯化目的片段后连接pYD1-GFP载体，转化EBY100，经PCR和测序鉴定后，重组酵母命名为pYD1-GFP-trunMMP/EBY100。pYD1-GFP-trunMMP/EBY100经半乳糖诱导，表达重组酵母菌，经24h、48h、72h诱导后，如图6和图7所示，72h表达量最高，流式细胞术分析重组酵母表达比例为31.2％。

2.5 MCP-MMP优势区段融合酵母表达

选择MCP ORF 55-330、400-909、931-1320bp片段，MMP ORF 52-630bp编码核苷酸片段，以MCP-T质粒为模板，设计引物分别扩增MCP三个片段；以MMP-T质粒为模板，设计引物扩增MMP ORF 52-630bp片段，融合PCR得到四个片段融合后PCR片段，纯化后连接入pYD1-GFP载体，转化EBY100，经PCR和测序鉴定后，重组酵母命名为pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100。pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100经半乳糖诱导，表达重组酵母菌，经24h、48h、72h诱导后，如图8和图9所示，72h表达量最高，流式细胞术分析重组酵母表达比例为19.0％。

2.6大口黑鲈血清IgM的纯化与小鼠抗大口黑鲈多克隆抗体的制备

如图10所示，SDS-PAG显示在>70kDa附近出现明显条带，为大口黑鲈IgM重链，以纯化的大口黑鲈IgM分3次免疫小鼠，加强免疫后3天，摘除眼球采血，ELISA检测表明，制备的鼠抗血清效价>1:320,000。

2.7 pYD1-GFP-trunMMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100作为口服疫苗载体的应用研究

收集半乳糖诱导表达72h的pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMMP/EBY100重组酵母，以1×10⁸cfu/尾剂量口服灌胃免疫大口黑鲈鱼苗，并设置pYD1-GFP/EBY100对照、EBY00对照以及空白对照组，如图11所示，免疫后pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMMP/EBY100组相对免疫保护率分别为56.0％、28.0％、24.0％。

2.8特异性血清抗体检测ELISA方法的应用

以本研究制备的小鼠抗大口黑鲈IgM多克隆抗体为检测抗体，分别以纯化的重组MCP、MMP为包被抗原，建立间接ELISA方法检测pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMMP/EBY100组免疫血清抗体效价，结果表明pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100组5尾免疫大口黑鲈血清OD₄₅₀值分别为0.482、0.512、0.495、0.484、0.579。pYD1-GFP-trunMCP/EBY100组5尾免疫大口黑鲈血清OD₄₅₀值分别为0.345、0.318、0.309、0.294、0.376。pYD1-GFP-trunMMP/EBY100组5尾免疫大口黑鲈血清OD₄₅₀值分别为0.302、0.344、0.307、0.294、0.282，未免疫血清(pYD1-GFP/EBY100对照、EBY00对照以及空白对照组)OD₄₅₀值为0.072～0.094，P/N>2.1。

由上可知，本发明获得了最优的重组蛋白抗原，其集合了MCP蛋白的三个抗原表位优势区段和MMP蛋白的一个抗原表位优势区段，经过构建质粒和在重组酵母进行表达，获得了可用于口服的鳜蛙虹彩病毒疫苗，该鳜蛙虹彩病毒疫苗具有很高的免疫原性和免疫保护力，能够很好地提高鳜鱼、大口黑鲈抗鳜蛙虹彩病毒能力。

进一步地，免疫后pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100、pYD1-GFP-trunMCP/EBY100、pYD1-GFP-trunMMP/EBY100组相对免疫保护率分别为56.0％、28.0％、24.0％，可知，pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100重组酵母的疫苗保护效果最好。

由ELISA结果表明，pYD1-GFP-trunMCP-MMP/EBY100重组酵母能够诱导有意义的体液免疫应答，具有作为鳜蛙虹彩病毒疫苗的潜力。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含：

所述重组质粒包含：编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示区段的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是以pYD1-GFP为骨架质粒。

3.一种重组酵母，其特征在于，包括有权利要求1或权利要求2所述重组质粒的酵母。

4.如权利要求3所述的重组酵母，所述酵母是酿酒酵母EBY100。

5.权利要求3或权利要求4所述的重组酵母在制备鳜蛙虹彩病毒疫苗中的应用。

6.权利要求3或权利要求4所述的重组酵母在制备抗鳜蛙虹彩病毒口服疫苗中的应用。

7.一种鳜蛙虹彩病毒疫苗，其特征在于，所述鳜蛙虹彩病毒疫苗是以权利要求3或权利要求4所述的重组酵母为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备形成的制剂。

8.如权利要求7所述的鳜蛙虹彩病毒疫苗，所述制剂为口服制剂。

9.一种制备重组酵母的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)构建含有编码氨基酸序列组成为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示区段的核苷酸的重组质粒；

(2)将重组质粒转化入酵母菌中并表达，即得重组酵母。

10.如权利要求9所述的制备重组酵母的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，包括如下步骤：

以MCP-T质粒为模板，分别利用SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15/SEQ IDNO.16、SEQ NO.17/SEQ ID NO.22引物对扩增MCP编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4所示区段的核苷酸序列得到PCR产物；以MMP-T质粒为模板，利用SEQNO.21/SEQ ID NO.20引物对扩增MMP编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示区段的核苷酸序列得到PCR产物，融合PCR得到融合后PCR片段，纯化后连接入pYD1-GFP载体得到重组质粒。