CN116023502A - 共表达延胡索酸水合酶的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述嵌合抗原受体还表达延胡索酸水合酶FH。通过共表达FH，本发明的嵌合抗原受体的抗肿瘤作用得以增强。以CD19抗体为例，共表达FH的抗CD19嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能更高效的用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。

Description

共表达延胡索酸水合酶的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及一种共表达延胡索酸水合酶(FH，Fumarate hydratase)的嵌合抗原受体(CAR)及其在治疗广谱性肿瘤中的应用。

背景技术

2021年初，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)公布数据表明，2020年全球新发癌症病例1929万例，死亡病例996万例。中国新发癌症病例457万例，死亡病例300万例，新发癌症人数位居全球第一。全球科学家致力于肿瘤疗法研究，其中，免疫治疗继化疗和靶向治疗后，成为肿瘤治疗的第三次革命。2013年《科学》杂志将肿瘤免疫治疗列为十大科学突破之首，2015年又将肿瘤免疫联合治疗列为最值得关注的四项科学进展之一。

肿瘤免疫治疗是指应用免疫学的原理和方法，提高肿瘤的免疫原性，利用自身的免疫系统攻击肿瘤细胞，从而抑制或杀伤肿瘤细胞。按其治疗策略分为两大类：免疫检查点抑制剂(如CTLA-4、PD-1、PD-L1等)和细胞免疫治疗(如CAR T等)。CAR T细胞全称为嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell)，治疗原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(Scfv)与CD3-链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR T细胞，能够特异性地靶向肿瘤细胞。CAR T与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。作为新型前沿治疗手段，CAR T治疗主要由中美引领发展，中国的表现尤为突出，截至2019年5月，全球CAR T治疗临床试验登记项目507项，主要分布在中国和美国，分别占试验总数的44.2％和36.7％。CAR T治疗的概念最早于1989年提出，至今三十年CAR T疗法历经四代技术革新。经过多年研究，CAR T疗法在临床上获得巨大成功，尤其是血液型肿瘤治疗取得了巨大的成就，多个产品已经批准上市。例如2017年FDA批准了两种靶向CD19 CAR T药物用于治疗幼儿或成人复发或难治性B细胞前体急性淋巴细胞白血病(ALL)，意味着CART治疗成为肿瘤新的合法的治疗策略。

尽管目前在CAR T治疗肿瘤领域捷报不断，但是CAR T细胞治疗肿瘤过程中仍然面临着诸多问题，其中，CAR T细胞浸润到肿瘤中发挥功能是导致CAR T疗法仅在小部分病人中有效果的主要原因，并直接导致了CAR T疗法在治疗过程中的局限性。因此，促进CAR T细胞浸润和激活、发挥功能成为CAR T治疗有效性至关重要的一步。

延胡索酸水合酶FH(Fumarate hydratase)编码三羧酸循环中的线粒体蛋白，为L-苹果酸水合酶，其可逆地催化延胡索酸水化为L-苹果酸。

发明内容

本发明人经过深入研究发现，延胡索酸水合酶FH的基因突变或低表达在多种肿瘤中高发，尤其对肾癌的发展起重要作用。肿瘤病人和小鼠模型均显示，FH可能促进CD8⁺T细胞杀伤肿瘤的功能。进一步的研究证实，通过过表达FH来降低延胡索酸的水平，能够促进CAR T细胞激活和改善治疗肿瘤的效果。

因此，在一个方面，本发明提供一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述嵌合抗原受体还表达延胡索酸水合酶FH(Fumaratehydratase)。

在一些实施方案中，在本发明嵌合抗原受体中，其中所述延胡索酸水合酶FH在所述胞外结构域的N端或C端和/或在所述胞内结构域的N端或C端表达。

在一些实施方案中，在本发明嵌合抗原受体中，所述胞外结构域包含抗原识别结构域(scFv)和铰链区，所述胞内结构域包含共刺激结构域和/或信号转导结构域，优选地所述嵌合抗原受体还包含信号肽、小分子标签(优选Strep II)、自剪切肽或它们的组合，更优选地：

1)所述抗原识别结构域(scFv)特异性识别CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD133、CD138、BCMA、CEA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EpCAM、GD2、GPC3、HER2、MSLN、MG7、MUC1、NY-ESO-1、LMP1、PSMA、Fra、NKG2D1、BCMA、IL13Rα2、LeY、CD70、B7-H3、ROR1或PSCA；

2)所述铰链区来源于IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区；

3)所述跨膜结构域来源于CD4、CD8α、CD28或CD3ζ；

4)所述共刺激结构域来源于CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)；和/或

5)所述信号转导结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链。

在一些实施方案中，在本发明嵌合抗原受体中，其中所述嵌合抗原受体从N端至C端依次包含信号肽、单链抗体ScFv(优选靶向CD19)、StrepII、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链、P2A肽和FH。

在另一方面，本发明提供编码根据本发明所述的嵌合抗原受体的重组载体和/或分离的多核苷酸，优选所述载体是转座子载体、逆转录病毒载体、DNA载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。

在另一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体免疫细胞，其过表达延胡索酸水合酶FH。

在一些实施方案中，根据本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞其表达根据本发明所述的嵌合抗原受体或根据本发明所述的重组载体和/或分离的多核苷酸；或其中在不同的表达载体中分别表达嵌合抗原受体(其本身不表达延胡索酸水合酶FH)和延胡索酸水合酶FH。

在一些实施方案中，根据本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体或同种异体的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK细胞、表达TCR的细胞、树突状细胞或NK-T细胞，优选CAR T细胞。

在另一方面，本发明提供一种药物组合物或试剂盒，其包含根据本发明所述的嵌合抗原受体、根据本发明所述的重组载体和/或分离的多核苷酸、或根据本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞或根据本发明所述的药物组合物，优选所述疾病或病症是癌症，更优选是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌或中枢神经系统癌。

在本发明的另一方面，本发明提供降低细胞中延胡索酸生成的试剂(例如，延胡索酸水合酶FH)在制备抗肿瘤药物中的应用，优选所述肿瘤是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌或中枢神经系统癌。优选地，所述药物在CAR T疗法中使用，或者与另一种抗肿瘤药物和/或CAR T细胞药物/疗法联用。

在本发明的另一方面，本发明还提供一种增强CAR T细胞药物或疗法的治疗效果/杀伤肿瘤的方法，所述方法包括降低肿瘤细胞中延胡索酸的生成或含量或表达水平。优选所述肿瘤是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌或中枢神经系统癌。

附图说明

图1.肾癌病人中的FH低表达伴随更差的生存率；

图2.FH低表达的肾癌病人伴随更低的功能性CD8⁺T细胞浸润；

图3.在小鼠肿瘤细胞中敲低FH，显著抑制功能性CD8⁺T细胞的浸润，促进肿瘤生长；

图4.在肿瘤微环境中，肿瘤细胞中FH的减少，导致微环境中积累大量的延胡索酸；

图5.延胡索酸有效抑制CD8⁺T细胞的激活；

图6.延胡索酸可以琥珀酸化CD8⁺T细胞中的ZAP70蛋白；

图7.延胡索酸可以抑制ZAP70的活性；

图8.延胡索酸可以抑制ZAP70下游信号通路的活性；

图9.肿瘤微环境中积累的延胡索酸，可抑制ZAP70及CD8⁺T细胞激活，阻断CD8⁺T细胞杀伤肿瘤的功能；

图10.实施例中抗-CD19 CAR的DNA片段的示意图；

图11.实施例中抗-CD19 CAR-FH的DNA片段的示意图；

图12.实施例中PTK-EF1α-抗-CD19 CAR质粒图谱；

图13.实施例中PTK-EF1α-抗-CD19 CAR-FH质粒图谱；

图14.抗-CD19 CAR T和抗-CD19 CAR-FH T细胞的CAR表达效率；

图15.在抗CD19 CAR-T细胞培养过程中，降低FH的添加量显著阻断CAR-T细胞对Raji细胞系的杀伤能力；

图16.降低FH对降低CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ、TNF-α、Granzyme B释放；

图17.肿瘤细胞系敲低FH对显著降低CAR-T细胞体内抗肿瘤能力；

图18.FHi会显著降低CAR-T细胞的抗肿瘤能力；

图19.抗-CD19 CAR-FH T细胞对Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji体外杀伤结果示意图；

图20.抗-CD19 CAR-FH T细胞与Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji体外共孵育后细胞因子IFN-γ、TNF-α、Granzyme B释放的结果示意图；

图21.抗-CD19 CAR-FH T细胞体内抗肿瘤能力结果示意图。

序列表说明

本发明实施例中使用的具体序列如下：

SEQ ID NO.1抗-CD19-scfv氨基酸序列

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTV

SEQ ID NO.2抗-CD19-scfv核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACCGGGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTCAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAACACACTGCCCTACACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCTCCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAGGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCCAGCCAGAGCCTGAGCGTGACCTGCACCGTGAGCGGCGTGAGCCTGCCCGACTACGGCGTGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCCAGGAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTG

SEQ ID NO.3信号肽(SP)氨基酸序列

MDFQVQIFSFLLISASVIMSRMA

SEQ ID NO.4信号肽(SP)核苷酸序列

ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATGTCTAGAATGGCC

SEQ ID NO.5 CD8铰链的氨基酸序列

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO.6 CD8铰链的核苷酸序列

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT

SEQ ID NO.7 CD28跨膜区(CD28TM)的氨基酸序列

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV

SEQ ID NO.8 CD28跨膜区(CD28TM)的核苷酸序列

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG

SEQ ID NO.9 CD28胞内结构域(CD28ICD)的氨基酸序列

RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO.10 CD28胞内结构域(CD28ICD)的核苷酸序列

AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC

SEQ ID NO.11胞内共刺激域4-1BB的氨基酸序列

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO.12胞内共刺激域4-1BB的核苷酸序列

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

SEQ ID NO.13 CD3ζ的氨基酸序列

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO.14 CD3ζ的核苷酸序列CD3ζ的核苷酸序列

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

SEQ ID NO.15 P2A肽的氨基酸序列

ATNFSLLKQAGDVEENPGP

SEQ ID NO.16 P2A肽的核苷酸序列

GCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGACCC

SEQ ID NO.17 FH的氨基酸序列

MYRALRLLARSRPLVRAPAAALASAPGLGGAAVPSFWPPNAARMASQNSFRIEYDTFGELKVPNDKYYGAQTVRSTMNFKIGGVTERMPTPVIKAFGILKRAAAEVNQDYGLDPKIANAIMKAADEVAEGKLNDHFPLVVWQTGSGTQTNMNVNEVISNRAIEMLGGELGSKIPVHPNDHVNKSQSSNDTFPTAMHIAAAIEVHEVLLPGLQKLHDALDAKSKEFAQIIKIGRTHTQDAVPLTLGQEFSGYVQQVKYAMTRIKAAMPRIYELAAGGTAVGTGLNTRIGFAEKVAAKVAALTGLPFVTAPNKFEALAAHDALVELSGAMNTTACSLMKIANDIRFLGSGPRSGLGELILPENEPGSSIMPGKVNPTQCEAMTMVAAQVMGNHVAVTVGGSNGHFELNVFKPMMIKNVLHSARLLGDASVSFTENCVVGIQANTERINKLMNESLMLVTALNPHIGYDKAAKIAKTAHKNGSTLKETAIELGYLTAEQFDEWVKPKDMLGPK

SEQ ID NO.18 FH的核苷酸序列

ATGTACCGAGCACTTCGGCTCCTCGCGCGCTCGCGTCCCCTCGTGCGGGCTCCAGCCGCAGCCTTAGCTTCGGCTCCCGGCTTGGGTGGCGCGGCCGTGCCCTCGTTTTGGCCTCCGAACGCGGCTCGAATGGCAAGCCAAAATTCCTTCCGGATAGAATATGATACCTTTGGTGAACTAAAGGTGCCAAATGATAAGTATTATGGCGCCCAGACCGTGAGATCTACGATGAACTTTAAGATTGGAGGTGTGACAGAACGCATGCCAACCCCAGTTATTAAAGCTTTTGGCATCTTGAAGCGAGCGGCCGCTGAAGTAAACCAGGATTATGGTCTTGATCCAAAGATTGCTAATGCAATAATGAAGGCAGCAGATGAGGTAGCTGAAGGTAAATTAAATGATCATTTTCCTCTCGTGGTATGGCAGACTGGATCAGGAACTCAGACAAATATGAATGTAAATGAAGTCATTAGCAATAGAGCAATTGAAATGTTAGGAGGTGAACTTGGCAGCAAGATACCTGTGCATCCCAACGATCATGTTAATAAAAGCCAGAGCTCAAATGATACTTTTCCCACAGCAATGCACATTGCTGCTGCAATAGAAGTTCATGAAGTACTGTTACCAGGACTACAGAAGTTACATGATGCTCTTGATGCAAAATCCAAAGAGTTTGCACAGATCATCAAGATTGGACGTACTCATACTCAGGATGCTGTTCCACTTACTCTTGGGCAGGAATTTAGTGGTTATGTTCAACAAGTAAAATATGCAATGACAAGAATAAAAGCTGCCATGCCAAGAATCTATGAGCTCGCAGCTGGAGGCACTGCTGTTGGTACAGGTTTAAATACTAGAATTGGCTTTGCAGAAAAGGTTGCTGCAAAAGTGGCTGCACTTACAGGCTTGCCTTTTGTCACTGCTCCGAATAAATTTGAAGCTCTGGCTGCTCATGACGCTCTGGTTGAGCTCAGTGGAGCCATGAACACTACTGCCTGCAGTCTGATGAAGATAGCAAATGATATTCGATTTTTGGGTTCTGGTCCTCGGTCAGGTCTGGGAGAATTGATCTTGCCTGAAAATGAACCAGGAAGCAGTATCATGCCAGGCAAGGTGAACCCTACTCAGTGTGAAGCAATGACCATGGTTGCAGCCCAAGTCATGGGGAACCATGTTGCTGTCACTGTCGGAGGCAGCAATGGACATTTTGAGTTGAATGTTTTCAAGCCAATGATGATTAAAAATGTGTTACACTCAGCCAGGCTGCTGGGGGATGCTTCAGTTTCCTTTACAGAAAACTGCGTGGTGGGAATCCAGGCCAATACAGAAAGGATCAACAAGCTGATGAATGAGTCTCTAATGTTGGTGACAGCTCTCAATCCTCATATAGGGTATGACAAGGCAGCAAAGATTGCTAAGACAGCACACAAAAATGGATCAACCTTAAAGGAAACTGCTATCGAACTTGGCTATCTCACAGCAGAGCAGTTTGACGAATGGGTAAAACCTAAGGACATGCTGGGTCCAAAGTGA

SEQ ID NO.19敲低FH的shRNA的核苷酸序列

CGCTGAAGTAAACCAGGATTACTCGAGTAATCCTGGTTTACTTCAGCGTTTTT

具体实施方式

除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。对于本领域的定义和术语，特别推荐技术人员参考Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor出版社，Plainsview，New York(1989)；以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York(1999)。

关于延胡索酸水合酶FH的表达，意指其两个水平上的表达：一为DNA水平上的表达；二为RNA水平上的表达。

术语“过表达”是指当基因/蛋白表达(转录)的严格控制被打乱时，基因可能不恰当被“关闭”，或以高速度进行转录。高速转录导致大量mRNA产生。对于本发明的“延胡索酸水合酶FH”的过表达而言，是指其DNA或RNA或蛋白质表达水平在本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞(表达根据本发明所述的嵌合抗原受体或根据本发明所述的重组载体和/或分离的多核苷酸的嵌合抗原受体免疫细胞)中比对照(不表达根据本发明所述的嵌合抗原受体或根据本发明所述的重组载体和/或分离的多核苷酸的对应嵌合抗原受体免疫细胞)至少高30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或300％，或者甚至是对照中延胡索酸水合酶FH的DNA或RNA或蛋白质表达水平的4、5、6、7、8、9、10倍或以上。用于检测基因/蛋白表达水平的技术和试剂是本领域技术人员公知的。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体(CAR)”是特异性识别靶抗原(例如癌细胞上的靶抗原)的蛋白质。当与靶抗原结合时，CAR可以激活免疫细胞以攻击并破坏带有该抗原的细胞(例如癌细胞)。CAR还可以并入共刺激或信号传导结构域，以增加其效力。典型地，嵌合抗原受体包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。

关于嵌合抗原受体所述的术语“胞外结构域”，其由抗原识别结构域(即负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv))及一段起连接作用的铰链区(hinge)构成。抗原识别结构域是CAR特异性结合肿瘤抗原的基础，其主要结构是scFv，由单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)通过多肽连接而成，保留有抗体对抗原的特异性和亲和力。目前大部分CAR T研究是靶向TAA的，如包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD133、CD138、BCMA、CEA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EpCAM、GD2、GPC3、HER2、MSLN、MG7、MUC1、NY-ESO-1、LMP1、PSMA、Fra、NKG2D1、BCMA、IL13Rα2、LeY、CD70、B7-H3、ROR1或PSCA等。本发明中所使用的scFv可来源于小鼠，也可以是人源化的scFv。

关于嵌合抗原受体所述的术语“铰链区”，其连接scFv和跨膜结构域，大多数CAR的铰链区由IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区衍变而来。铰链区的长度取决于靶细胞抗原表位的位置及暴露程度。

关于嵌合抗原受体所述的术语“跨膜结构域”，其将CAR的细胞外结构域与细胞内信号转导结构域连接，并将受体锚定到T细胞膜上。常用的跨膜结构域来源于CD4，CD8α，CD28和CD3ζ。

关于嵌合抗原受体所述的术语“共刺激结构域”，其通常来自CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)，可实现协同刺激分子和细胞内信号的双重活化，使T细胞持续增殖并释放细胞因子，提高T细胞的抗肿瘤能力。

关于嵌合抗原受体所述的术语“信号转导结构域”，其通常为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链，含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAMs)，发挥T细胞信号转导功能。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体在N端包含信号肽。在一些实施例中，所述信号肽包含与SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述信号肽包含SEQ ID NO.4编码的氨基酸序列。在一些实施例中，所述信号肽由包含SEQ ID NO.4的核苷酸序列编码。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体在抗原识别结构域(scFv)的C端还包含用于蛋白检测/标记/纯化用的小分子标签(优选Strep II)。

在一些实施方案中，本发明的嵌合抗原受体还包含延胡索酸水合酶FH。在一些实施方案中，所述延胡索酸水合酶FH可以在所述胞外结构域的N端或C端和/或在所述胞内结构域的N端或C端表达。备选地，延胡索酸水合酶FH和胞外结构域或胞内结构域可以表达为融合蛋白，或者延胡索酸水合酶FH和胞外结构域或胞内结构域之间可以存在连接肽(诸如自剪切肽，优选P2A肽)。

延胡索酸水合酶FH(Fumarate hydratase)编码三羧酸循环中的线粒体蛋白，其基因突变或低表达在多种肿瘤中高发，尤其对肾癌的发展起重要作用。临床上发现，在肾癌病人(kidney chromophobe(KICH),kidney renal papillary cell carcinoma(KIRP))中，FH低表达伴随更差的生存率(图1)，并且FH低表达伴随肿瘤浸润的CD8⁺T细胞功能基因(GZMA,GZMB,IFNG,MIKI67)表达的抑制(图2)。在小鼠肿瘤细胞B16-OVA(黑色素瘤细胞)中敲低FH，显著抑制肿瘤中功能性CD8⁺T细胞的浸润，促进肿瘤生长(图3)。体外实验发现，FH低表达的肿瘤细胞培养基，可以有效抑制CD8⁺T细胞的激活和功能(图4)。进一步机制研究发现，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞中FH的减少，导致肿瘤微环境中积累大量的延胡索酸(图4)。并且，外源加入FH的底物——延胡索酸衍生物(dimethyl fumarate,DMF)或使用FH抑制剂(FHi,Fumarate hydratase-IN-1,MCE,HY-100004)积累内源延胡索酸，均有效的抑制CD8⁺T细胞的激活(图5)。延胡索酸可以琥珀酰化ZAP70蛋白(图6)，抑制ZAP70及其下游信号通路的活性(图7，图8)。此外，通过处理FH抑制剂或DMF积累延胡索酸，有效的抑制了CD8⁺T细胞激活，阻断CD8⁺T细胞杀伤肿瘤的功能(图9)。

基于上述发现，本发明人通过过表达FH来降低延胡索酸的水平，从而促进CAR T细胞激活和改善治疗肿瘤效果。

因此，本发明提供一种共表达FH的嵌合抗原受体(CAR)，携带靶向CD19的ScFv序列的CAR T细胞可以有效的杀伤任何表面表达CD19的肿瘤细胞，提高了杀伤肿瘤的效率。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供的嵌合型抗原受体CAR，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8铰链、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链；优选地，在CD3ζ链的C端进一步拼接有P2A肽和FH；所述能够识别肿瘤细胞表面的CD19抗原的单链抗体ScFv核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD8铰链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD28跨膜区、CD28胞内结构域的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示，胞内共刺激域4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在本发明的一些实施例中，从N端到C端顺次拼接信号肽、单链抗体ScFv、strepII、CD8铰链、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB、CD3ζ链、P2A肽、FH，优选地，单链抗体ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选地，所述单链抗体ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，优选地，所述P2A肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述FH的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述FH的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

本发明的第二目的是提供一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，以病毒和非病毒表达载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒或转座子载体；优选地，以病毒载体PTK-EF1α为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒载体；所述病毒载体PTK-EF1α是以PTK(Addgene,#36976)载体为骨架，将CMV启动子替换为EF1α启动子后得到的载体。

本发明的第三目的是提供嵌合型抗原受体的免疫细胞，由上述的嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或上述的重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到嵌合型抗原受体的免疫细胞，免疫细胞选自脐带血、外周血或iPSC来源的T细胞、NK细胞、NKT细胞、αβT细胞、γδT细胞、CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞，优选为外周血来源的T细胞，即得到以CD19为靶点治疗广谱性肿瘤的CAR T细胞，当所述嵌合型抗原受体CAR的单链抗体ScFv结合CD19时，同时过表达FH蛋白，所述表达嵌合型抗原受体的免疫细胞表现出更强的抗肿瘤活性。优选地，利用CRISPR、RNA干扰等技术联合嵌合型抗原受体元件的表达达到对免疫细胞的改造。

在一些实施例中，表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行体外功能检测时，选择为细胞膜表面表达CD19蛋白的细胞系。

在一些实施例中，本发明提供一种药物组合物或试剂盒，其包含本发明的嵌合抗原受体、重组载体和/或分离的多核苷酸、或嵌合抗原受体免疫细胞；和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物或试剂盒还包含另外的活性剂。在一些实施例中，所述另外的活性剂是化疗剂、PD-1抑制剂、预防或减少细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的生物反应调节剂、细胞因子等等。

在一些实施例中，本发明提供一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本发明的嵌合抗原受体免疫细胞或本发明的药物组合物，优选所述疾病或病症是癌症，更优选是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌、中枢神经系统癌。结构域和药学上可接受的赋形剂。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供一种共表达FH的嵌合抗原受体(CAR)，携带靶向CD19的ScFv序列的CAR T细胞可以有效的杀伤任何表面表达CD19的肿瘤细胞，提高了杀伤肿瘤的效率；

2、本发明还提供一种共表达FH的嵌合抗原受体(CAR)方法，是将分离得到的免疫细胞激活3天后再感染表达嵌合抗原受体的慢病毒，进一步地，表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行体外功能检测时，所选择的细胞系为细胞膜外高表达或中表达CD19靶点的细胞系，这样对表达嵌合型抗原受体的免疫细胞的杀瘤效果评价更为科学。

实施例

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：小鼠肿瘤细胞中敲低FH显著抑制功能性CD8+T细胞的浸润并且促进肿瘤生长

从图1中可以看出，肾透明细胞癌病人和肾乳头细胞癌病人中，基于GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)数据库中FH的表达，我们根据FH的表达高低分成两组，发现FH表达量低的病人Kaplan-Meier生存曲线效果差。

图2的散点图显示，在8个肾细胞癌病人的单细胞测序数据(SCP1288)中，FH在肿瘤细胞中的表达量与肿瘤浸润的CD8⁺T细胞中功能基因(GZMA,GZMB,IFNG,和MIKI67)的表达量成正相关。图中展示了Pearson相关系数(r)和p值。

基于上述发现，我们在小鼠黑色素瘤细胞B16-OVA细胞中利用shRNA技术敲低FH基因的表达构建稳定细胞系(敲低FH的shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)。将该敲低稳定细胞系移植C57BL/6小鼠后评估小鼠皮下成瘤情况(图3，A)，结果显示，敲低FH的B16-OVA细胞移植瘤生长速度、肿瘤大小显著高于野生型的B16-OVA细胞(图3，B)。通过对该移植小鼠中肿瘤浸润的CD8⁺T细胞和CD44⁺CD8⁺T细胞进行流式分析发现，敲低FH的肿瘤中CD8⁺T细胞和CD44⁺CD8⁺T细胞均显著性减少(图3，C)。并且，敲低FH的肿瘤中CD8⁺T细胞的细胞因子INF-γ，TNFα和GZMB的表达均显著降低(图3，D)。

我们进一步使用培养B16-OVA细胞培养24小时后的培养基培养CD8⁺T细胞(图4，A)。结果显示，敲低FH的B16-OVA细胞培养基显著抑制CD8⁺T细胞的激活(图4，B)和细胞因子的表达(图4，C)。使用液相色谱-质谱联用技术检测敲低FH的肿瘤细胞外间隙中延胡索酸(Fumarate)的含量，结果显示(图4，D)延胡索酸的含量在敲低FH的肿瘤中明显上升。

我们还发现，用延胡索酸类似物MMF(延胡索酸单甲酯，monomethyl fumarate)或DMF(延胡索酸二甲酯，dimethyl fumarate)(图5，A)或FHi(Fumarate hydratase-IN-1,MCE,HY-100004)(图5，B)处理CD8⁺T细胞1小时后，CD8⁺T细胞的激活显著受到抑制，且该抑制作用具有浓度依赖性。

我们进一步发现，在HEK 293T细胞(Takara)中过表达Flag-ZAP70蛋白，延胡索酸、MMF、DMF或FHi处理后，裂解细胞富集Flag-ZAP70蛋白，通过免疫印迹法检测发现ZAP70蛋白被琥珀酰化修饰(抗2SC抗体，Discovery antibody(crb2005017))(图6，A)。纯化的Flag-ZAP70蛋白孵育延胡索酸，质谱鉴定琥珀酰化修饰位点为C96和C102(图6，B)。

进一步地，我们发现上述琥珀酰化修饰抑制ZAP70酶活。在293T细胞中过表达Flag-ZAP70蛋白，裂解细胞富集Flag-ZAP70蛋白，孵育DMF30分钟后，检测ZAP70酶活，发现DMF随着浓度梯度的增加，逐渐抑制ZAP70酶活(参见图7)。

我们将小鼠CD8⁺T细胞与不同浓度的FHi(图8，A)或DMF(图8，B)孵育1小时后，用抗CD3/CD28抗体激活细胞，免疫印迹法检测T细胞激活信号通路活性。结果显示，ZAP70蛋白Y394位的磷酸化及其下游蛋白磷酸化被FHi和DMF阻断。

我们还将C57BL/6小鼠皮下移植B16-OVA细胞，辐照清除小鼠CD8⁺T细胞后，向小鼠体内尾静脉注射OT-I CD8⁺T细胞，并腹腔注射DMSO(Ctrl)或FHi(25mg/kg小鼠)或灌胃处理DMF(50mg/kg小鼠)四天后，腹腔注射OVA肽段激活OT-I CD8⁺T细胞，评估小鼠皮下成瘤情况(图9，A)。结果显示，FHi和DMF处理的肿瘤生长速度和大小显著高于对照组(图9，B和图9，C)。并且，FHi和DMF处理的肿瘤微环境中的延胡索酸显著增加(图9，D)。FHi和DMF处理的肿瘤中，浸润的CD44⁺CD8⁺T细胞均显著性减少(图9，E)。并且，FHi和DMF的处理导致CD8⁺T细胞细胞因子INF-γ，TNFα和GZMB的表达显著性降低(图9，F)。

综上，我们可以得出结论，延胡索酸水合酶FH的基因突变或低表达在多种肿瘤中高发，尤其对肾癌的发展起重要作用。肿瘤病人和小鼠模型均显示，FH可能促进CD8⁺T细胞杀伤肿瘤的功能。

实施例2：PTK-EF1α-CD19、PTK-EF1α-CD19-FH、质粒的构建

1、分别人工合成片段CD19、FH，人工合成SP、strepII-CD8铰链-CD28TM+ICD-4-1BB-CD3ζ片段。

2、采用Overlap PCR扩增分别以SP、CD99和CD8铰链-CD28TM+ICD-4-1BB-CD3ζ，或以SP、CD99和CD8铰链-CD28TM+ICD-4-1BB-CD3ζ+P2A肽+FH为模版，获得带有酶切位点EcoRI和BamH I的CD99-CAR和CD99-CAR-FH片段的结构示意图分别如图10、图11所示。

其中，信号肽(SP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，CD8铰链的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，CD28TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.7，CD28ICD的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，FH的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，更优选地，信号肽(SP)的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，CD8铰链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，CD28TM的核苷酸序列如SEQ ID NO.8，CD28ICD的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，4-1BB的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，CD3ζ的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述F2A肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示，FH的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

3、将质粒PTK881-EF1α-Kan使用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并割胶回收置于Eppendorf管内，用Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段，并测定产物的纯度和浓度。

4、将片段以1:2摩尔比加入Eppendorf管加入ExnaseⅡ连接酶(Vazyme)与同源重组酶5×CEⅡbuffer，37℃反应0.5小时；将连接液取出10μL加入100μL DH5α感受态细胞冰浴30min后42℃热激90s，完成后加入500μL SOC培养基37℃、220rpm培养2小时；2小时后将Eppendorf管4000g离心1min移除400μL多余液体。将剩余液体涂布在LB平板37℃培养12小时；在平板上挑取单菌落，接种到5mL LB液体培养基中37℃、220rpm培养12小时。

5、用Axygen小提试剂盒提取质粒，获得质粒PTK881-EF1α-CD19、PTK881-EF1α-CD19-FH；送生工生物工程(上海)股份有限公司科技公司一代测序验证无误后，进行含质粒PTK-EF1α-CD19、PTK-EF1α-CD19-FH的完整图谱示意图分别如图12、图13所示。分别取20μL(500ng)质粒DNA，外送测序，根据原始种子序列，检查质粒生产所得产品的目的基因有无发生改变，稳定的工艺下，工作种子在进行发酵培养放大过程中，目的基因不会发生改变，可用于下一环节的生产和正确表达蛋白。

实施例3：PTK-EF1α-CD19、PTK-EF1α-CD19-FH慢病毒载体的制备与活滴检测

1、慢病毒载体的制备

在多层细胞培养瓶(Hyperflask)接入130.0～140.0×106数目的293T细胞(Takara)，共560mL DMEM完全培养基(50mL胎牛血清、5mL Antibiotic-Antimycotic(100×))，在37℃含5％CO₂培养箱中培养24小时。分别将混有320μg质粒(PTK-EF1α-CD19、PTK-EF1α-CD19-FH：pLP1质粒(Invitrogen)：pLP2质粒(Invitrogen)：Plp/VSV-G质粒(Invitrogen)＝12：10：5：6)的DMEM完全培养基加入960μg PEI管中，漩涡震荡,室温平衡10min。分别将上述35mL PEI与质粒的混合液与525mL DMEM完全培养基混匀，换入上述多层细胞培养瓶中。将多层细胞培养瓶置于37℃含5％CO2培养箱培养3天后，收集细胞培养上清液。

分别将上清液4000rpm(或3000g)离心30min后，向离心后上清中加入cryonase酶(Takara)置于4℃。6个小时后，使用0.22μm的滤膜对慢病毒上清液进行抽滤，4℃于30000g离心2.5h。去除上清，加入1mL T细胞培养基重悬沉淀。重悬后，留20μL做病毒活性滴度检测，剩余慢病毒浓缩液分装，标记为Lenti3-CD19-CAR、Lenti3-CD19-CAR-FH并置于-80℃保存备用。

2、慢病毒载体活性滴度检测

原理：商业化的靶向FCM63的抗体用作细胞表面CAR表达的验证，通过流式细胞仪检测到的荧光信号间接反应了CAR在293T细胞中的表达情况。

方法：在6孔板中接入5.0×10⁵个/孔293T细胞，慢病毒浓缩液每孔分别加入0.1μL、0.5μL、1μL，并设1个阴性对照。置于37℃含5％CO2培养箱内培养。三日后，用Versene溶液(Gibco)收集293T细胞送流式细胞学检测CAR阳性293T细胞比例，并换算得到PTK-EF1α-CD19、PTK-EF1α-CD19-FH慢病毒浓缩液活性滴度。

目前的慢病毒浓缩液活性滴度在1×10⁸～10×10⁸(TU/mL)范围内，检测分析结果见表1。表明各个慢病毒载体均能获得较高的活性滴度，可用于后续的嵌合抗原受体免疫细胞的制备。

表1慢病毒活性滴度检测分析结果

样品编号	活性滴度(TU/mL)
		Lenti3-CD19-CAR	<![CDATA[5.1×10<sup>8</sup>]]>
Lenti3-CD19-CAR-FH	<![CDATA[5.8×10<sup>8</sup>]]>

实施例4：抗-CD19 CAR T、抗-CD19-FH CAR T细胞的制备

1、CAR T细胞制剂制备：

采集健康供者外周血(本实验室志愿者捐献)100mL，采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞。计数后，使用适量CD3 MicroBeads,human(美天旎)分选CD3阳性细胞，并以1.0～2.0×10⁶个/mL密度在T细胞完全培养液(OpTmizer^TMCTS^TMT-Cell Expansion BasalMedium，OpTmizer^TMCTS T-Cell Expansion Supplement(Invitrogen)，500IU/mL的IL-2(双鹭药业)中培养，同时按每10⁶个细胞加入25μl Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Invitrogen)活化T细胞。

48小时(Day2)后，按MOI为3分别加入Lenti3-CD19-CAR、Lenti3-CD19-CAR-FH慢病毒载体进行转导，混匀后置于CO₂培养箱孵育，4小时后补加适量的T细胞完全培养基进行培养。

慢病毒转导24小时后将转导后的细胞换入新鲜T细胞完全培养液，并调整活细胞密度为1.0-2.0×10⁶个/mL，继续培养扩增10～20天，每天进行观察和计数，并根据计得的细胞数量进行补液扩大培养，始终保持细胞培养密度为1.0-2.0×10⁶个/mL。

2、抗-CD19 CAR T、抗-CD19-FH CAR T细胞转导效率检测

取1.0×10⁶个转导后T细胞，与1μg/mL FITC-Protein-L室温孵育30分钟，生理盐水清洗两次后，通过流式细胞仪检测FITC荧光信号，测量FITC阳性细胞比率，反映了CAR T细胞在总细胞中的比率。抗-CD19 CAR T、抗-CD19-FH CAR T细胞转导效率检测结果如图14所示。图14表明成功制备CAR T细胞，而且抗-CD19 CAR T细胞、抗-CD19-FH CAR T细胞的CAR表达效率分别为16.3％、16.9％。

实施例5：FH对抗-CD19 CAR-T细胞体内外功能影响

1.体外杀瘤检测：

采用钙黄绿素检测法(陶嫦立.Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立.doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2014.10014.中国免疫学杂志)分别对T细胞、抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19 CAR-FH-T细胞进行体外杀瘤功能检测，靶细胞为CD19阳性、敲低FH的shFH-Raji(构建方法同实施例1)。

取适量靶细胞，调整靶细胞Raji(B急性淋巴肿瘤细胞系Raji(购自于国家生物医学实验细胞资源库))和CD19阳性、敲低FH的shFH-Raji培养密度分别为2×10⁵/mL，培养24h后离心获得靶细胞的上清液。取适量抗-CD19 CAR-T分别用上述两种细胞系的上清液重悬，孵育24h待用。

24h后取适量的靶细胞shFH-Raji，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.5×10⁵/mL个细胞，按25:1的效靶比分别加入抗-CD19 CAR-T(Raji)(在Raji细胞培养基中孵育24h后)、抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)(在肿瘤细胞上清液中孵育24h后)，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。

T细胞、抗-CD19 CAR-T(Raji)细胞、抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)细胞对CD19高表达的肿瘤细胞系shFH-Raji体外杀伤裂解结果如图15所示。由以上体外杀瘤结果可知，抗-CD19 CAR-T(Raji)、抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)中，抗-CD19 CAR-T(Raji)的杀伤显著高于抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)，所以可知，抗-CD19 CAR-T(Raji)和抗-CD19 CAR-T(shFHRaji)细胞的杀伤能力与T细胞相比均显著提高，说明它们均对CD19阳性肿瘤细胞系具有体外杀伤性功能。更重要的是抗-CD19 CAR-T(Raji)细胞的杀伤能力要明显高于抗-CD19CAR-T(shFH Raji)细胞，说明CAR-T细胞培养液中FH对于CAR-T细胞的抗肿瘤功能有着显著的影响。

2.体外细胞因子检测：

取适量靶细胞，调整靶细胞Raji和shFH-Raji培养密度为2×10⁵/mL，培养24h后离心获得靶细胞的上清液。取适量抗-CD19 CAR-T分别用上述两种细胞系的上清液重悬，孵育24h待用。

取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.05×10⁵/mL个靶细胞，按25:1的效靶比加入抗-CD19 CAR-T(Raji)(在T细胞培养基中孵育24h后)、抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)(在肿瘤细胞上清液中孵育24h后)，200g离心30秒，37℃孵育18小时。孵育完成后取上清，分别检测上清中IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的浓度。

T细胞、抗-CD19 CAR-T(Raji)细胞、抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)细胞与CD19高表达细胞系shFH-Raji体外孵育后IFN-γ，TNF-α和Granzyme B分泌结果分别如图16所示，与杀瘤结果一致，抗-CD19 CAR-T(Raji)和抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)细胞分泌的IFN-γ，TNF-α和Granzyme B与T细胞相比均显著提高，说明其对CD19阳性肿瘤细胞系的体外杀伤性功能。更重要的是，抗-CD19 CAR-T(Raji)细胞的IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的释放量要明显高于抗-CD19 CAR-T(shFH Raji)细胞，说明CAR-T细胞培养液中FH的减少能够显著降低CAR-T的体外杀瘤能力。

3.肿瘤细胞系敲低FH对CAR-T细胞体内抗肿瘤功能的影响：

为了验证肿瘤细胞系敲低FH对CAR-T细胞体内的抗肿瘤功能，我们使用分别使用正常的FH阳性的细胞系和敲低FH的肿瘤细胞系构建小鼠模型，观察并比较不同小鼠模型中抗-CD19 CAR-T细胞的抗肿瘤能力。

Raji-luci细胞模型：取健康NPG小鼠12只雌性，尾静脉接种Raji-luci细胞，每只小鼠注射细胞量为1.5×10⁶，5-9天后开始成像观察肿瘤生长情况，待荧光强度(ROI值)达到10⁶-10⁷光子/秒之间为模型构建成功。待模型构建成功后，将小鼠均分为两组组，每组6只，第一组尾静脉注射T细胞作为对照组，第二组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19 CAR-T细胞。

shFH-Raji-luci细胞模型：取健康NPG小鼠12只雌性，尾静脉接种shFH-Raji-luci细胞，每只小鼠注射细胞量为1.5×10⁶，5-9天后开始成像观察肿瘤生长情况，待荧光强度(ROI值)达到10⁶-10⁷光子/秒之间为模型构建成功。待模型构建成功后，将小鼠均分为两组组，每组6只，第一组尾静脉注射T细胞作为对照组，第二组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19CAR-T细胞。每4-6天收集小鼠荧光成像的数据。

荧光值直接反映了肿瘤细胞系Raji-luci在体内扩增的情况，各组小鼠模型Raji-luci荧光成像数据如图17所示，在Raji-luci细胞模型和shFH-Raji-luci细胞模型中，抗-CD19 CAR-T与对照T细胞组相比，均显著抑制了肿瘤细胞系在体内的增殖，更重要的是，与Raji-luci细胞模型相比，shFH-Raji-luci细胞模型中抗-CD19 CAR-T具有更弱的抗肿瘤能力，只是短暂抑制了shFH-Raji-luci的扩增，最终却无法避免肿瘤的复发。说明肿瘤细胞系敲低FH会显著降低CAR-T细胞体内抗肿瘤功能。

4.FH抑制剂对CAR-T细胞体内抗肿瘤功能的影响：

为了验证CAR-T细胞内FH对其体内的抗肿瘤功能的影响，我们使用FH抑制剂FHi来抑制FH功能，观察CAR-T的抗肿瘤能力。与此同时，增加一组zap70抑制剂MDF作为FHi的阳性对照。

Raji-luci细胞模型：取健康NPG小鼠16只雌性，尾静脉接种Raji-luci细胞，每只小鼠注射细胞量为1.5×10⁶，5-9天后开始成像观察肿瘤生长情况，待荧光强度(ROI值)达到10⁶-10⁷光子/秒之间为模型构建成功。待模型构建成功后，将小鼠均分为四组，每组4只，一组尾静脉注射T细胞作为对照组，第二组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19 CAR-T细胞作为第三组和第四组的对照组，第三组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19 CAR-T细胞之外，在CAR-T注射后前四天内，每天腹腔再注射12mg/kg FHi、第四组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19 CAR-T细胞之外，在CAR-T注射后前四天内，每天灌胃25mg/kg DMF药物。5-6天收集小鼠荧光成像的数据。

荧光值直接反映了肿瘤细胞系Raji-luci在体内扩增的情况，各组小鼠模型Raji-luci荧光成像数据如图18所示，抗-CD19 CAR-T、抗-CD19 CAR-T+FHi、抗-CD19CAR-T+DMF与对照T细胞组相比，均显著抑制了肿瘤细胞系在体内的增殖，更重要的是，抗-CD19 CAR-T+FHi、抗-CD19 CAR-T+DMF两组虽然都可以抑制肿瘤的扩增，但是其抗肿瘤能力均显著低于单独抗-CD19 CAR-T组。说明FH抑制剂FHi能够显著降低CAR-T的体内杀瘤能力。

实施例6：抗-CD19 CAR T、抗-CD19-FH CAR T细胞体外功能检测

以上结果显示FH抑制剂能够显著降低CAR-T细胞抗肿瘤功能，所以我们提出在CAR-T内部过表达FH蛋白，进一步提高CAR-T细胞的功能。

1.体外杀瘤检测：

采用钙黄绿素检测法(陶嫦立.Calcein-AM荧光扫描测定细胞毒方法的建立.doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2014.10014.中国免疫学杂志)分别对T、抗-CD19 CAR-T、抗-CD19 CAR-FH-T细胞进行体外杀瘤功能检测，靶细胞为CD19阳性的B急性淋巴肿瘤细胞系Raji(购自于国家生物医学实验细胞资源库)取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)加入钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)至终浓度25μM，培养箱中孵育30min。常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.5×10⁵/mL个细胞，按25:1的效靶比分别加入T、抗-CD19 CAR-T、抗-CD19 CAR-FH-T，37℃孵育2～3小时。孵育完成后取上清，测量其中钙黄绿素的荧光强度，并根据自发释放对照和最大释放对照，计算靶细胞裂解百分数。

T、抗-CD19 CAR-T、抗-CD19 CAR-FH-T细胞对CD19高表达的肿瘤细胞系Raji体外杀伤裂解结果如图19所示，由以上体外杀瘤结果可知，T、抗-CD19 CAR-T、抗-CD19 CAR-FH-T中，抗-CD19 CAR-FH-T的杀伤显著高于普通的抗-CD19 CAR-T，所以更优选抗-CD19 CAR-FH-T用于治疗肿瘤。

2.体外细胞因子检测：

取适量的靶细胞，在1×10⁶/mL的细胞悬液(PBS，5％胎牛血清)常温，洗两遍后将细胞重悬至0.5×10⁵/mL，96孔板中每孔加入0.05×10⁵/mL个靶细胞，按25:1的效靶比加入T细胞、抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19 CAR-FH-T细胞，200g离心30秒，37℃孵育18小时。孵育完成后取上清，分别检测上清中IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的浓度。

T细胞、抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19 CAR-FH-T细胞与CD19高表达细胞系Raji体外孵育后IFN-γ，TNF-α和Granzyme B分泌结果分别如图20所示，与杀瘤结果一致，抗-CD19CAR-T和抗-CD19 CAR-FH-T细胞分泌的IFN-γ，TNF-α和Granzyme B与T细胞相比均显著提高，说明其对CD19阳性肿瘤细胞系的体外杀伤性功能。更重要的是，抗-CD19 CAR-FH-T细胞的IFN-γ，TNF-α和Granzyme B的释放量要明显高于抗-CD19 CAR-T细胞；说明FH在CAR-T细胞中的表达能够显著增强CAR-T的杀瘤能力。

3.抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19-FH CAR-T细胞体内抗肿瘤功能

为了验证FH对CAR-T细胞体内的抗肿瘤功能，观察比较抗-CD19CAR-T细胞与抗-CD19-FH CAR-T细胞的抗肿瘤能力。

Raji-luci细胞模型：取健康NPG小鼠15只雌性，尾静脉接种Raji-luci细胞，每只小鼠注射细胞量为1.5×10⁶，5-9天后开始成像观察肿瘤生长情况，待荧光强度(ROI值)达到10⁶-10⁷光子/秒之间为模型构建成功。待模型构建成功后，将小鼠均分为三组，每组5只，一组尾静脉注射T细胞作为对照组，第二组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19 CAR-T细胞，第三组尾静脉注射2.0×10⁶抗-CD19-FH CAR-T细胞。每4-6天收集小鼠荧光成像的数据。

荧光值直接反映了肿瘤细胞系Raji-luci在体内扩增的情况，各组小鼠模型Raji-luci荧光成像数据如图21所示，抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19-FH CAR-T细胞与对照T细胞组相比，均显著抑制了肿瘤细胞系在体内的增殖，更重要的是，抗-CD19 CAR-T细胞、抗-CD19-FH CAR-T两组虽然都可以抑制肿瘤的扩增，但是抗-CD19-FH CAR-T抗肿瘤能力均显著高于抗-CD19 CAR-T细胞，说明CAR-T细胞过表达FH能够显著提高CAR-T细胞的体内杀瘤能力。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。

Claims (11)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述嵌合抗原受体还表达延胡索酸水合酶FH(Fumarate hydratase)。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述延胡索酸水合酶FH在所述胞外结构域的N端或C端和/或在所述胞内结构域的N端或C端表达。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外结构域包含抗原识别结构域(scFv)和铰链区，所述胞内结构域包含共刺激结构域和/或信号转导结构域，优选地所述嵌合抗原受体还包含信号肽、小分子标签(优选Strep II)、自剪切肽或它们的组合，更优选地：

1)所述抗原识别结构域(scFv)特异性识别CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD133、CD138、BCMA、CEA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、EpCAM、GD2、GPC3、HER2、MSLN、MG7、MUC1、NY-ESO-1、LMP1、PSMA、Fra、NKG2D1、BCMA、IL13Rα2、LeY、CD70、B7-H3、ROR1或PSCA；

2)所述铰链区来源于IgG的铰链或CD8α/CD28胞外区；

3)所述跨膜结构域来源于CD4、CD8α、CD28或CD3ζ；

4)所述共刺激结构域来源于CD28受体家族(CD28，ICOS)或肿瘤坏死因子受体家族(4-1BB、OX40、CD27)；和/或

5)所述信号转导结构域为T细胞受体TCR/CD3ζ链或免疫球蛋白Fc受体FcεRIγ链。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体从N端至C端依次包含信号肽、单链抗体ScFv(优选靶向CD19)、StrepII、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4-1BB和CD3ζ链、P2A肽和FH。

5.编码根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体的重组载体和/或分离的多核苷酸，优选所述载体是转座子载体、逆转录病毒载体、DNA载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。

6.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其过表达延胡索酸水合酶FH。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其表达根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体或根据权利要求5所述的重组载体和/或分离的多核苷酸；或其中在不同的表达载体中分别表达嵌合抗原受体和延胡索酸水合酶FH。

8.根据权利要求6或7所述的嵌合抗原受体免疫细胞，其中所述免疫细胞是自体或同种异体的T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK细胞、表达TCR的细胞、树突状细胞或NK-T细胞，优选CAR T细胞。

9.一种药物组合物或试剂盒，其包含根据权利要求1-4中任一项所述的嵌合抗原受体、根据权利要求5所述的重组载体和/或分离的多核苷酸、或根据权利要求6-8中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞。

10.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求6-8中任一项所述的嵌合抗原受体免疫细胞或根据权利要求9所述的药物组合物，优选所述疾病或病症是癌症，更优选是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌或中枢神经系统癌。

11.降低细胞中延胡索酸生成的试剂(例如，延胡索酸水合酶FH)在制备抗肿瘤药物中的应用，优选所述肿瘤是CD4⁺、CD8⁺和/或CD19⁺的癌症，最优选是B细胞急性淋巴母细胞白血病(BALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞淋巴瘤或其他淋巴恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、脑癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、急性髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤、肺癌、胃癌、胶质瘤、EGFR-阳性实体瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、肝细胞癌、鳞状细胞肺癌、MSLN-阳性实体瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、肉瘤、晚期实体瘤、肾细胞癌或中枢神经系统癌；优选地，所述药物在CAR T细胞疗法中使用，或者与另一种抗肿瘤药物和/或CAR T细胞药物/疗法联用。

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