CN116008548A - 乳腺癌术后复发与转移的检测试剂盒、检测装置及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乳腺癌术后复发与转移的检测试剂盒、检测装置及应用。具体地公开了生物标志物SLC50A1蛋白和/或检测所述生物标志物的物质在制备用于检测乳腺癌术后复发或转移、诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移或评估乳腺癌术后复发或转移风险的产品中的应用。本发明的生物标志物及其试剂盒与检测方法具有敏感性强、特异性高的特点，敏感性和特异性分别达到72.7％和94.8％，AUC为0.887，与现有技术相比，显著降低了乳腺癌患者术后复发或转移的漏诊率、提高了检出率，具有较高的诊断价值，用于辅助临床判断乳腺癌患者术后是否出现复发和转移，有利于乳腺癌术后复发和转移的防治，具有重要的意义和临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及乳腺癌术后复发与转移的检测试剂盒、检测装置及应用。
背景技术
乳腺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。它的发病常与遗传有关，40-60岁间、绝经期前后的妇女发病率较高，乳腺癌已成为严重威胁女性生命的严重疾病之一。近年来，在国内乳腺癌的发病率和死亡率持续上升，目前主要集中在城市地区，但随着我国经济发展和城镇化建设，农村地区的乳腺癌患者也呈明显增长的趋势，这可能与经济条件改善后我国女性暴露在乳腺癌高危因素的情况增多等原因相关。乳腺癌治疗主要采用手术、化疗、放疗等综合疗法。影响乳腺癌患者生存的主要因素为手术后是否出现复发和转移。尽早发现乳腺癌患者术后的复发和转移，可以及时治疗并改善其生存质量，对于改善患者预后，提高临床治疗效果至关重要。
常见的血清肿瘤标志物对于乳腺癌患者术后复发转移的监测具有一定的临床价值，具有简便、价格低廉的优点。CA15-3对乳腺癌早期诊断的敏感性低，但对于转移性乳腺癌，血清CA15-3水平增高明显，目前已被广泛应用于复发和转移性乳腺癌的监测，但是仍存在特异性和敏感度低，检出率偏低的不足。目前临床尚没有可靠的乳腺癌术后复发与转移的生物标志物。
因此，研究和开发敏感性较高的生物标志物和检测方法来辅助临床判断乳腺癌患者术后是否出现复发和转移，有利于乳腺癌术后复发和转移的防治，以及为复发转移性乳腺癌患者个体化精准治疗提供帮助，具有重要的意义和临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异、灵敏和/或可靠的乳腺癌术后复发或转移的生物标志物。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为实现上述目的，本发明首先提供了生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：
A1)在制备用于检测乳腺癌术后复发或转移的产品中的应用；
A2)在制备诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移的产品中的应用；
A3)在制备评估乳腺癌术后复发或转移风险的产品中的应用；
所述生物标志物为SLC50A1蛋白。
进一步地，所述SLC50A1蛋白可为血清中的SLC50A1蛋白。
进一步地，所述SLC50A1蛋白在乳腺癌复发或转移患者中的水平(含量)显著高于正常患者(治疗后无乳腺癌复发或转移的患者)，所述SLC50A1蛋白可以作为生物标志物用于乳腺癌术后复发或转移的检测。
进一步地，所述SLC50A1蛋白可为下述任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
所述SLC50A1蛋白可为人源的。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
上述应用中，所述检测所述生物标志物的物质可包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。
上述应用中，所述检测所述生物标志物的物质可为用于检测SLC50A1蛋白含量(即SLC50A1蛋白的浓度)的试剂。
上述应用中，所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂可包括结合SLC50A1蛋白的物质。
上述应用中，所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂还可包括SLC50A1蛋白。
上述应用中，所述结合SLC50A1蛋白的物质可为抗体、多肽、蛋白质或核酸分子。
所述抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体，还可以是抗体可变区Fv、单链抗体ScFv、抗原结合片段Fab或Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH等抗体片段，以及抗体衍生物等。
上述应用中，所述抗体可为SLC50A1蛋白抗体。
进一步地，所述检测可为通过酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测血清中SLC50A1蛋白的表达水平。
本发明所述生物标志物可适用于ELISA常规的蛋白检测实验。
本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可包括本文中任一所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：
B1)用于检测乳腺癌术后复发或转移；
B2)诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移；
B3)评估乳腺癌术后复发或转移风险。
进一步地，所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂可为SLC50A1蛋白抗体。
进一步地，所述试剂盒的检测样本可为血清。
进一步地，所述试剂盒还可包括SLC50A1蛋白作为标准品。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
进一步地，所述试剂盒可为蛋白免疫检测试剂盒。
进一步地，所述试剂盒可为ELISA试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒或免疫组化检测试剂盒但不限于此。
本文中，所述产品可为试剂、试剂盒或芯片。
所述产品可以血清为待测样本。
发明还提供了用于乳腺癌术后复发或转移监测的装置，所述装置可包括本文中任一所述的检测所述生物标志物的物质和存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：根据SLC50A1蛋白含量进行乳腺癌术后复发或转移的检测、诊断和/或风险评估。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现SLC50A1蛋白在乳腺癌复发或转移患者中的水平(含量)显著高于正常患者(治疗后无乳腺癌复发或转移的患者)，并以此开发了用于乳腺癌术后复发或转移监测的生物标志物，SLC50A1蛋白作为生物标志物可应用于检测乳腺癌术后复发或转移、诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移、以及评估乳腺癌术后复发或转移风险。本发明开发的生物标志物(SLC50A1蛋白)和/或检测所述生物标志物的物质(如SLC50A1蛋白抗体)、及其试剂盒与检测方法具有敏感性强、特异性高的特点，敏感性和特异性分别达到72.7％和94.8％，AUC为0.887(95％置信区间：0.849-0.926)，与现有技术相比，显著降低了乳腺癌患者术后复发或转移的漏诊率、提高了检出率，具有较高的诊断价值，用于辅助临床判断乳腺癌患者术后是否出现复发和转移，有利于乳腺癌术后复发和转移的防治，以及为复发转移性乳腺癌患者个体化精准治疗提供帮助，具有重要的意义和临床应用价值。
附图说明
图1为复发/转移组与正常随访组的血清SLC50A1水平比较。
图2为SLC50A1的ROC曲线。
图3为SLC50A1与CEA、CA15-3的ROC曲线比较。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、与乳腺癌术后复发/转移相关的生物标志物的鉴定
本实施例纳入了400例乳腺癌术后患者，其中250例为接受乳腺癌手术等综合治疗后定期随访的患者，150例为接受乳腺癌手术等综合治疗后出现复发或转移的患者，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对400例术后患者的血清进行了SLC50A1蛋白和目前常用标志物CEA、CA15-3的水平检测。
检测结果为150例复发或转移患者的血清SLC50A1蛋白水平的中位数、第25百分位数、第75百分位数和平均值及标准差分别为279.9pg/mL、227.7pg/mL、351.0pg/mL和322.3±184.2pg/mL。250例正常随访患者的血清SLC50A1蛋白水平的中位数、第25百分位数、第75百分位数和平均值及标准差的分别为175.6pg/mL、152.7pg/mL、204.7pg/mL和179.4±36.8pg/mL。乳腺癌复发或转移患者的血清SLC50A1蛋白水平显著高于正常随访患者，差异有统计学意义(P<0.001，图1)。
检测结果的分析表明SLC50A1蛋白可以作为生物标志物用于乳腺癌术后复发或转移的检测。
SLC50A1蛋白的氨基酸序列为：5’-MEAGGFLDSLIYGACVVFTLGMFSAGL SDLRHMRMTRSVDNVQFLPFLTTEVNNLGWLSYGALKGDGILIVVNTVGAALQTLYILAYLHYCPRKRVVLLQTATLLGVLLLGYGYFWLLVPNPEARLQQLGLFCSVFTISMYLSPLADLAKVIQTKSTQCLSYPLTIATLLTSASWCLYGFRLRDPYIMVSNFPGIVTSFIRFWLFWKYPQEQDRNYWLLQT-3’(SEQ ID No.1)。
实施例2、与乳腺癌术后复发/转移相关的生物标志物的检测
1、样本的采集与处理
1-1、样本
待测样本为患者的空腹静脉血。
1-2、样本的处理
室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。收集上层血清作为待测样品，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2、ELISA法检测SLC50A1蛋白含量
使用ELISA试剂盒，AndyGene Biotechnology Co.,LTD，货号AD9503Hu，以下标准品、稀释液、洗涤液、显色剂均为试剂盒一部分。
(1)标准品的稀释与加样：
标准品为SLC50A1蛋白。
在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第、十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九、第十孔中各取50ul弃掉(稀释后各孔加样量都为50ul，标准品浓度分别为300pg/ml，200pg/ml，100pg/ml，50pg/ml，25pg/ml)。
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(6)加酶：每孔加入酶标试剂(SLC50A1蛋白抗体)50ul，空白孔除外。
(7)温育：操作同步骤(3)。
(8)洗涤：操作同步骤(5)。
(9)显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
(10)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
(12)根据标准品吸光值及对应浓度计算标准曲线，根据标准曲线计算公式计算各孔待测样品浓度，乘以稀释倍数后得出样本目标蛋白的实际浓度(含量)。
3、结果判定
根据上述实施例1的临床样本实验，SLC50A1正常范围为0-233.3pg/mL，若待测样品SLC50A1蛋白含量大于233.3pg/mL，则提示患者可能出现乳腺癌术后复发或转移，需进行体查或其他辅助检查判断。
实施例3、SLC50A1蛋白用于检测乳腺癌术后复发和/或转移的诊断性能
按照实施例2中所述的方法，选取400例接受手术等综合治疗后的乳腺癌患者，纳入标准：1)既往诊断乳腺癌；2)规范接受包括手术治疗或新辅助治疗后手术等综合治疗的患者；3)以前没有出现远处转移。其中正常随访组纳入了250例未出现复发/转移患者，复发/转移组纳入了150例治疗后新出现复发/转移的患者，这两组患者作为验证样本，验证本发明的生物标志物(SLC50A1蛋白)用于检测乳腺癌术后复发和/或转移的诊断性能。
结果表明，在区分正常随访患者和复发/转移患者时，诊断复发/转移患者的最佳截断值为233.3pg/mL，敏感性和特异性分别为72.7％和94.8％，AUC为0.887(95％置信区间：0.849-0.926，图2)。此外，目前常用标志物CEA和CA15-3在区分正常随访患者和复发/转移患者时的最佳截断值分别为6.4ng/mL和14.9U/mL。敏感性分别为47.3％和63.3％，特异性分别为84.0％和64.0％(图3)。通过ROC曲线比较的DeLong检验，发现SLC50A1的诊断价值均优于CEA和CA15-3(P<0.001，图3)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.生物标志物和/或检测所述生物标志物的物质的下述任一种应用：
A1)在制备用于检测乳腺癌术后复发或转移的产品中的应用；
A2)在制备诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移的产品中的应用；
A3)在制备评估乳腺癌术后复发或转移风险的产品中的应用；
所述生物标志物为SLC50A1蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测所述生物标志物的物质包括通过酶联免疫吸附试验、免疫荧光法、放射免疫测定法、免疫共沉淀法、免疫印迹法、高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、免疫化学发光法、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术、表面等离子共振技术、免疫-PCR技术或生物素-亲和素技术检测所述生物标志物的物质。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测所述生物标志物的物质为用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂包括结合SLC50A1蛋白的物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂还包括SLC50A1蛋白。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述结合SLC50A1蛋白的物质为抗体、多肽、蛋白质或核酸分子。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗体为SLC50A1蛋白抗体。
8.试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3-7中任一所述用于检测SLC50A1蛋白含量的试剂，所述试剂盒具有下述至少一种用途：
B1)用于检测乳腺癌术后复发或转移；
B2)诊断或辅助诊断乳腺癌术后复发或转移；
B3)评估乳腺癌术后复发或转移风险。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血清。
10.用于乳腺癌术后复发或转移监测的装置，其特征在于，所述装置包括权利要求1-7中任一所述的检测所述生物标志物的物质和存储有计算机程序的计算机可读存储介质，所述计算机程序使计算机执行如下步骤：根据SLC50A1蛋白含量进行乳腺癌术后复发或转移的检测、诊断和/或风险评估。
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