CN116004632A - 一种组成型启动子p256及其活性鉴定方法与应用 - Google Patents

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段泽东
陈波
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文姣
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，将其扩增后通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；然后将重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD600，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。本发明的组成型启动子P256有潜力应用到其他不同种的原核细菌中，包括特殊的极端环境微生物，能够用于提高外源蛋白表达量。

Description

一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。
背景技术
启动子是RNA聚合酶和转录因子结合的部位，通常位于基因的上游区域，在调控合成代谢中起着重要作用，主要分为RNA聚合酶Ⅰ，RNA聚合酶Ⅱ，RNA聚合酶Ⅲ三类，在细胞中常规基因的启动子，几乎都是Ⅱ型启动子，此类启动子的特点是转录长度不限。Ⅱ型启动子包括了组成型启动子和诱导型启动子。诱导型启动子需要加入特定的物质才能激发或者抑制其活性；而表达系统中，运用最多的则是组成型启动子，这类启动子在绝大部分细胞里面都能维持一定的表达活性，但是不同的组成型启动子在不同的细胞中却有高低表达之分。
南北极有着世界上最特殊的地理和气候条件。生存在这种极端环境里的微生物相应具备了独特的生物适应机制，它们往往具备嗜寒、耐盐、耐压等特性，具有重要的科学价值。极地微生物资源的开发利用已显示出广阔的应用前景，从极地微生物中已获得了大量优良的功能基因，而对组成型启动子的报道却很少，其数量远远不能匹配基因数量的增长。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种组成型启动子P256及其活性鉴定方法与应用。组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuligineaBSW20308，将其扩增后通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；然后将重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD600，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种组成型启动子P256，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，包括以下步骤：
(1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；
(2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD600，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述引物对为P-1和P-2；其中P-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，PCR的扩增过程中，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5min。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，酶切后的pRU1701质粒为经SpeⅠ酶切后的pRU1701质粒。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，所述LB培养基中含有庆大霉素。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，使用Fluoroskan Ascent FL全自动荧光化学发光分析仪测量样品的荧光值；使用光吸收酶标仪测量样品的OD600。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值检测时，激发波长为485nm，发射波长为538nm。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值除以对应的OD600为单位荧光强度，当重组质粒的单位荧光强度高于空白载体pRU1701质粒的单位荧光强度时，则证明组成型启动子P256活性高，反之，证明组成型启动子P256活性低。
本发明的第三个目的是提供一种组成型启动子P256的应用，所述组成型启动子P256用于应用到其他不同种原核细菌以提高外源蛋白表达量。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明鉴定出了北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中一种组成型启动子P256，通过构建重组载体，该启动子在大肠杆菌中仍然保持活性，且不需要诱导物，是一种具有普遍活性的组成型启动子，有潜力应用到其他不同种的原核细菌中，包括特殊的极端环境微生物；进一步的，组成型启动子P256能够用于提高外源蛋白表达量。
附图说明
图1为实施例1构建得到的重组质粒的示意图；
图2为实施例1构建得到的重组质粒和空白质粒在不同时间的GFP单位荧光强度；其中，***代表P<0.001。
具体实施方式
本发明提供一种组成型启动子P256，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，包括以下步骤：
(1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；
(2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coli DE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD600，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述引物对为P-1和P-2；其中P-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，PCR的扩增过程中，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5min。
在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，酶切后的pRU1701质粒为经SpeⅠ酶切后的pRU1701质粒。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，所述LB培养基中含有庆大霉素。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，使用Fluoroskan Ascent FL全自动荧光化学发光分析仪测量样品的荧光值；使用光吸收酶标仪测量样品的OD600。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值检测时，激发波长为485nm，发射波长为538nm。
在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，荧光值除以对应的OD600为单位荧光强度，当重组质粒的单位荧光强度高于空白载体pRU1701质粒的单位荧光强度时，则证明组成型启动子P256活性高，反之，证明组成型启动子P256活性低。
本发明提供一种组成型启动子P256的应用，所述组成型启动子P256用于应用到其他不同种原核细菌以提高外源蛋白表达量。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
下述实施例中，若无特殊说明，所用试剂均为市售试剂；所用检测手段及方法均为本领域常规检测手段及方法。
下述实施例中所用引物合成与基因测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司合完成；DE3感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；无缝组装试剂盒购自南京诺唯赞公司；内切酶SpeⅠ购自北京纽英伦生物技术公司；LB培养基和2216E培养基购自美国BD公司；TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0和PrimeSTAR MaxPremix试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司；庆大霉素购自美国Sigma公司；PCR产物纯化试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；
实施例1
本实施例提供一种组成型启动子P256的活性鉴定方法。
(1)提取基因组--将4ml的北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308培养至OD600≈1.0，菌株培养基为2216E(BD公司，美国)，培养温度25℃，离心收集菌体后，使用试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0(宝日医生物技术有限公司，北京，中国)提取基因组。
(2)PCR扩增--以步骤(1)提取的基因组为模板，P-1/P-2为引物对进行PCR扩增，体系如表1所示。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5min，扩增的片段为组成型启动子P256，长度为209bp，扩增产物使用PCR产物纯化试剂盒(爱思进，杭州，中国)进行纯化回收。
表1 PCR反应体系
PCR反应体系 50μl体系
PrimeSTAR Max Premix 25μl
基因组 2μl
P-1(SEQ ID NO.2) 2μl
P-2(SEQ ID NO.3) 2μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 补足至50μl
其中，PrimeSTAR Max Premix购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
P-1：5’-TAGATAGAGAGAGAGAGAGATTAGCTATTGCATAAATACT-3’；
P-2：5’-ATTTTTTCTTCCTCCACTAGTTTTTACAACATTCCATTGT-3’。
(3)质粒的酶切--首先配置酶切体系(50μl)：2μl内切酶SpeⅠ(纽英伦生物技术公司，北京，中国)，5μl Buffer，2μg pRU1701质粒，无菌水补齐至50μl。将配置完成的酶切体系置于37℃水浴锅中，静置1h后取出，使用PCR产物纯化试剂盒(爱思进，杭州，中国)进行纯化回收。
(4)无缝组装构建重组质粒--配置无缝组装反应体系(20μl)：12μl步骤(3)酶切后的pRU1701质粒，4μl CEⅡBuffer，2μl扩增产物，2μl无缝组装酶(诺唯赞，南京，中国)。将配置完成的反应体系置于37℃水浴锅中，静置30min后取出，冰上冷却3min。
(5)质粒的转化--取10μl步骤(4)得到的反应液和10μl pRU1701质粒分别加入到100μl大肠杆菌感受态细胞DE3(全式金，北京，中国)中，冰上静置30min后，42℃下热激90s，完成后再放置到冰上冷却3min，加入1ml LB培养基于37℃培养1h进行细胞壁恢复，之后收集菌体，弃去部分上清，预留100-200μl液体，重悬菌体，涂布于含庆大霉素的平板上，37℃静置培养过夜，第二天进行挑菌，并将活化后含重组质粒的菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，得到重组质粒pRU1701-P256(如图1所示)；其中，上述用到庆大霉素的固体培养基或液体培养基中，庆大霉素终浓度为10mg/L。
(6)测量不同时期的荧光强度—分别活化含pRU1701质粒和pRU1701-P256质粒的DE3，培养至OD600≈0.6，按照1％接种量接入至30ml含庆大霉素的LB培养基中，每组设置三个平行，分别在接种后的6h，9h，12h，16h取样，每次取样1ml，收集菌体后用无菌水洗涤3次，置于-80℃中暂时保存，待全部取样完成后，每个样品中加入200μl无菌水重悬细胞，使用Fluoroskan Ascent FL全自动荧光化学发光分析仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)测量样品的荧光值，设置激发波长为485nm，发射波长为538nm，使用光吸收酶标仪测量样品的OD600，每个样品检测三次，计算三次重复的平均值。将荧光值除以对应的OD600，得到单位荧光强度。实验结果如图2所示，从图2可以发现，在接种后的6h-16h之间，含有组成型启动子P256的细胞单位荧光强度更高，且相较于空白载体具有显著性差异，两者之间的差异在接种后的12h左右达到最大，这说明组成型启动子P256能够显著提高外源蛋白(例如绿色荧光蛋白)的表达量。同时证明，来自北极适冷菌的组成型启动子P256在大肠杆菌中依然保持着很高的活性。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的解释，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组成型启动子P256，其特征在于，所述组成型启动子P256来源于北极适冷菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用引物对通过PCR扩增北极细菌Pseudoalteromonas fuliginea BSW20308基因组中组成型启动子P256，得到扩增产物；
(2)将步骤(1)扩增得到的扩增产物通过无缝组装试剂盒克隆到酶切后的pRU1701质粒的绿色荧光蛋白编码区上游，得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒和空白载体pRU1701质粒分别转化至大肠杆菌E.coliDE3中，在LB培养基中培养，接种后分别取样检测其荧光值及OD600，利用单位荧光强度鉴定组成型启动子P256的活性。
3.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述引物对为P-1和P-2；其中P-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，P-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中，PCR的扩增过程中，反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性20sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；72℃延伸5min。
5.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中，酶切后的pRU1701质粒为经SpeⅠ酶切后的pRU1701质粒。
6.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述LB培养基中含有庆大霉素。
7.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，使用Fluoroskan Ascent FL全自动荧光化学发光分析仪测量样品的荧光值；使用光吸收酶标仪测量样品的OD600。
8.根据权利要求7所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，荧光值检测时，激发波长为485nm，发射波长为538nm。
9.根据权利要求2所述的一种组成型启动子P256的活性鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，荧光值除以对应的OD600为单位荧光强度，当重组质粒的单位荧光强度高于空白载体pRU1701质粒的单位荧光强度时，则证明组成型启动子P256活性高，反之，证明组成型启动子P256活性低。
10.一种如权利要求1所述的组成型启动子P256的应用，其特征在于，所述组成型启动子P256用于提高外源蛋白表达量。
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