CN116004433B - 无丙二酸柠檬酸杆菌及其在引诱橘小实蝇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了无丙二酸柠檬酸杆菌及其在引诱橘小实蝇中的应用。本发明新发现的橘小实蝇共生菌‑无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)可用于制备对重大果蔬害虫橘小实蝇尤其是其雌虫具有特异诱集效果的引诱剂，该引诱剂制作成本低，诱杀效果好，对环境及非靶标生物无害，具有非常大的应用前景。

Description

无丙二酸柠檬酸杆菌及其在引诱橘小实蝇中的应用

技术领域

本发明属于害虫的绿色防治技术领域，具体涉及无丙二酸柠檬酸杆菌及其在引诱橘小实蝇中的应用。

背景技术

双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)寡鬃实蝇亚科(Dacinae)的橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)，俗称“针蜂”，起源于亚洲地区，是世界检疫性害虫。自1911年中国台湾首次报道以来，该虫已从我国东南沿海地区逐渐扩展到多个省市，且有进一步北移扩张的趋势。橘小实蝇的寄主范围广，能够为害多达46科的果蔬作物。该虫具有极强的繁殖力，单头雌虫一生可产卵400～1800粒。雌虫产卵于水果内部，卵孵化后，幼虫取食使果实腐烂或变黄脱落，造成果蔬产业严重的经济损失。

目前市面上使用最广泛的橘小实蝇引诱剂-甲基丁香酚只能诱杀雄虫，而用于诱杀雌虫的诱剂则很少，且效果很差。

发明内容

本发明的目的在于开发出一种对环境友好、使用简便、成本低廉且尤其是对橘小实蝇雌虫具有很好引诱效果的无丙二酸柠檬酸杆菌及利用该菌制备的引诱剂，可用于诱杀橘小实蝇。

本发明从橘小实蝇卵巢中分离出的无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇雌虫有引诱作用。在橘小实蝇的寄主果实果肉或市面上购买的果汁中添加该菌菌体后可显著提高对橘小实蝇雌虫的诱集效果。因此利用该菌菌体加橘小实蝇的寄主果实进行发酵可实现制作雌虫引诱剂的目的。本发明使用到的原料对环境无污染，成本低，具有非常大的开发潜力；可诱杀橘小实蝇雌虫是其一大特点，对保护果蔬生产具有非常大的作用。

因此，本发明的第一个目的是提供一株无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacteramalonaticus BD)，其保藏编号为GDMCC NO.62161。

本发明的无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)的形态特征为：在LB培养基上的菌落光滑、湿润，菌落中心不透明、边缘半透明，浅灰黄色，有点发白，表面有光泽，边缘整齐。

该菌的分子鉴定依据：

16S rRNA序列分析：取该菌扩繁菌液进行PCR扩增，引物为细菌16S rRNA通用引物1492R及27F，PCR产物经测序后使用MEGA6.0对测序序列进行拼接，拼接后的序列如SEQ IDNO.1所示，拼接结果在NCBI上进行比对分析，比对结果表明该菌株为无丙二酸柠檬酸杆菌。

该菌的生化鉴定依据：

利用肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-15e(17种)及肠杆菌科细菌编码册第二代GYZ-15eDO16，根据其附带的单盒生化鉴定管使用说明进行生化鉴定；该菌株鉴定值为07325，根据肠杆菌科细菌编码册第二代GYZ-15eDO16检索，得到结果为无丙二酸柠檬酸杆菌，其鉴定值为96.607％。

本发明的第二个目的是提供所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacteramalonaticus BD)在引诱橘小实蝇中的应用。

优选，所述的橘小实蝇为橘小实蝇雌虫。

本发明的第三个目的是提供一种橘小实蝇引诱剂，包含所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD与适宜于该菌的发酵底物。

优选，所述的橘小实蝇引诱剂，包含所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacteramalonaticus BD)与橘小实蝇寄主果实，或包含所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)与橘小实蝇寄主果实的加工制品。

优选，所述的橘小实蝇寄主果实为水果果实，包括但不限于番石榴、柑桔、香蕉、芒果、番木瓜、番荔枝、杨桃、火龙果、枇杷、枣、桃、苹果、梨、李、葡萄、柿、石榴果实等。

优选，所述的橘小实蝇寄主果实为蔬菜果实，包括但不限于丝瓜、豇豆、苦瓜、黄瓜、茄子、南瓜、青椒、番茄果实等。

优选，所述的橘小实蝇寄主果实的加工制品包括但不限于果汁、果泥、果酱、果脯、果干等。

本发明的第四个目的是提供一种诱杀橘小实蝇的方法，包括以下步骤：

将无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)加入到适宜于无丙二酸柠檬酸杆菌BD的发酵底物中，混匀制成引诱剂；然后将引诱剂装入诱集装置，将诱集装置放置于待诱杀橘小实蝇的目标场地；所述的诱集装置下部用于盛放引诱剂，上部设有用于散发气味的孔，诱集装置外壁上附着有粘虫胶。

优选，所述的适宜于无丙二酸柠檬酸杆菌BD的发酵底物为橘小实蝇寄主果实或橘小实蝇寄主果实的加工制品，并保证含有适宜于发酵的水分。

优选，作为本发明的其中一种诱集装置，如图4所示，为一个诱集瓶，液态的引诱剂装于诱集瓶内下部，诱集瓶上部设有若干用于散发气味的孔，诱集瓶外壁上均匀附着有粘虫胶；所述的诱集瓶和粘虫胶为黄色。

本发明开发的基于橘小实蝇共生菌-无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacteramalonaticus BD)的引诱剂，具有引诱橘小实蝇雌虫的效果；该引诱剂制作成本低，诱杀效果好，对环境及非靶标生物无害，具有非常大的应用前景。

保藏说明：

本发明的Citrobacter amalonaticus BD(无丙二酸柠檬酸杆菌BD)于2021年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号：GDMCC NO.62161，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

附图说明

图1是果泥中加无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇的诱集作用；(a)和(b)为番石榴果泥加无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇雌、雄虫的诱集作用；(c)和(d)为砂糖橘果泥加无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇雌、雄虫的诱集作用；**表示成对样本T检验P值小于0.01，NS表示无显著差异。

图2是果粒橙中加无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇雌(a)、雄(b)虫的诱集作用；**表示成对样本T检验P值小于0.01，NS表示无显著差异。

图3是无丙二酸柠檬酸杆菌BD发酵不同时长的果汁对橘小实蝇的诱集作用；(a)和(b)为无丙二酸柠檬酸杆菌BD发酵不同时长橙汁对橘小实蝇雌、雄虫的诱集作用；采用单因素方差分析(多重比较采用Duncan)检验，柱形图上具相同字母表示差异不显著(P＞0.05)。

图4是野外诱集实验所用诱集瓶示意图；其中，诱集瓶中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌液和果汁，菌发酵气味可从诱集瓶上部孔洞中散发出来；诱集瓶颜色制作成黄色可提高对橘小实蝇的诱集效果；使用时将粘虫胶均匀涂抹附着在诱集瓶瓶身，可将引诱过来的橘小实蝇全部黏住。

图5是无丙二酸柠檬酸杆菌BD发酵的果汁对橘小实蝇雌(a)、雄(b)虫的野外诱集作用。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：橘小实蝇卵巢细菌的分离纯化

(1)取样

取性成熟的橘小实蝇雌虫，在干净的培养皿上解剖雌虫卵巢收集至规格为1.5mL装有500μL无菌水的离心管中，每管收集卵巢数量为3个，利用研磨棒对卵巢样品进行充分研磨。

(2)培养基的制备

依次称取LB肉汤培养基3.15g、琼脂2g，并量取150mL超纯水于规格为250mL的广口锥形瓶中，利用封口膜及报纸进行两次封口后置于高温灭菌锅中进行灭菌，同时按实验需求准备玻璃培养皿若干、三角涂布棒若干、超纯水若干瓶、1.5mL离心管若干、不同型号的枪头若干盒进行灭菌。灭菌期间，打开超净工作台中的紫外光对操作台进行灭菌。待LB培养基完成灭菌后，在超净工作台中用点燃的酒精灯对灭完菌的培养皿外侧边缘进行简单的烘烤，之后将培养基适量倾倒于培养皿中，使液面没过皿的三分之一，制备完成后，半掩培养皿开启紫外灯置于通风的操作台中约半小时等待培养基凝固。

(3)研磨液涂布

待培养基凝固冷却后，取卵巢研磨液的原液及稀释后的研磨液200μL于培养基中，用玻璃涂棒涂抹均匀，涂布完成后用封口膜对培养皿进行封口，倒置放入30℃的恒温培养箱中进行培养。

(4)单菌落纯化

对培养基中长出的菌落依据不同形态进行分类，用接种针挑取单菌落，在超净工作台中进行平板划线，后对已划线的培养皿进行封口，倒置在恒温培养箱中在30℃条件下进行培养，培养24h后，用已灭菌枪头挑取单菌落接入装有3mL LB液体培养基的离心管中(离心管规格为5mL)，在摇床上37℃环境下扩繁24h，得到扩繁菌液后，吸取扩繁菌液与灭菌的50％甘油溶液各400μL，按1：1混合放置-80℃冰箱保存。

该菌的形态特征为：在LB培养基上的菌落光滑、湿润，菌落中心不透明、边缘半透明，浅灰黄色，有点发白，表面有光泽，边缘整齐。

实施例2：卵巢菌的分子鉴定

(1)菌液PCR及胶回收

取扩繁菌液进行PCR扩增，引物为细菌16S rRNA通用引物1492R及27F，反应体系如表1：

表1菌液PCR反应体系

PCR扩增程序：95℃预变性3min；进入PCR循环，94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，循环数为40；72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR产物在1％琼脂凝胶上进行电泳分离，利用GelExtraction Kit试剂盒(omega)胶回收目的DNA片段。

(2)PCR产物的克隆连接转化

根据TIANGEN pGM-T克隆试剂盒的说明，将纯化的目的DNA连接至pGM-T载体上。连接体系如表2所示，全量为5μL，载体和片段的摩尔比控制在1：3-1：8。再根据说明进行转化，并在LB培养基上培养。

表2 PCR产物和载体连接反应体系

(3)阳性克隆测序

挑选(2)中培养的阳性菌落，置于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，培养后的菌液进行测序鉴定。

(4)测序结果分析

使用MEGA6.0对测序序列进行拼接，拼接后的序列如SEQ ID NO.1所示，拼接结果在NCBI上进行比对分析。比对结果表明该分离菌株为无丙二酸柠檬酸杆菌，菌株编号为BD，因此将该菌株命名为无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)。

实施例3：无丙二酸柠檬酸杆菌BD的生化鉴定

购买广东环凯生物科技公司的肠杆菌科细菌生化编码鉴定管GYZ-15e(17种)及肠杆菌科细菌编码册第二代GYZ-15eDO16，根据其附带的单盒生化鉴定管使用说明进行生化鉴定。结果如下表3：

表3肠杆菌科细菌生化鉴定

由结果可知分离菌株鉴定值为07325，根据肠杆菌科细菌编码册第二代GYZ-15eDO16检索，得到结果为无丙二酸柠檬酸杆菌，其鉴定值为96.607％。

实施例4：果泥加无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇的诱集作用

(1)提前进行细菌培养，使用广东环凯微生物科技公司生产的LB肉汤根据方法配制液体培养基后灭菌，按200mL加入约2.5μL实施例1的从桔小实蝇雌性成虫体内分离出后存于-80℃冰箱的无丙二酸柠檬酸杆菌BD的甘油菌，置于37℃、160～200rpm摇床中过夜培养；

(2)将100mL过夜培养的无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌液，使用4个50mL的离心管分装，每管装约25mL，2300rpm、8min进行离心，可看到离心管底部有白色沉淀。离心完毕后去清液，用约8mL无菌水悬菌，得到菌悬液，备用；

(3)使用榨汁机将新鲜番石榴榨成果泥，每份称取100g备用；

(4)在5m×5m×3m(长×宽×高)的密封室内，任意选取离地约0.8～1.3m高度的位置，并排放置两个碗口直径为10cm、容量1L的塑料碗，用马克笔分别写上“对照组”、“实验组”字样；

(5)每个塑料碗中各加入100g果泥，对照组加入110mL无菌水；实验组先加入菌悬液，再加无菌水，将菌悬液与无菌水总体积补足至110mL；

(6)吸取50头桔小实蝇雌性成虫、50头雄性成虫，于室内放飞，室温维持在25℃及以上，灯光常亮，于24h后观察记录结果；

(7)实验重复进行4次，记录好每组数据；

(8)将步骤(3)中番石榴换用其他水果如砂糖橘，步骤同上(1)～(7)，进行对比实验。

结果表明在番石榴和砂糖橘果泥中加入分离得到的无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌株可显著提高果泥对橘小实蝇雌虫的诱集效果(图1)。

实施例5：市售果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇的诱集作用

为了探索利用无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇雌虫进行诱杀的更加经济的方法，选取了在市面上常见的果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD并测试对橘小实蝇的诱集效果。具体方法如下：

(1)购买“美汁源”牌果粒橙，每份准备100mL，备用；

(2)将100mL果粒橙与无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液(无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液的菌悬液制备方式：菌体于100mL LB培养基菌中过夜培养(12h)后，用4个50mL的离心管分装，每管装25mL，2300rpm、8min进行离心后去清液，用8mL无菌水悬菌)加入到锥形瓶中，置于37℃、160～200rpm摇床中培养3h；

(3)在5m×5m×3m(长×宽×高)的密封室内，任意选取离地约0.8～1.3m高度的位置，并排放置两个碗口直径为10cm、容量1L的塑料碗，用马克笔分别写上“对照组”、“实验组”字样；

(4)对照组加入果汁；实验组加入培养3h后的果粒橙与无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液混合液；室内放入50头橘小实蝇雌虫和50头雄虫，室温维持在25℃及以上，灯光常亮，24h后记录各组中诱集到的雌雄虫数量；实验设置4组重复。

实验结果表明，果粒橙中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD可显著提高果汁对橘小实蝇雌虫的诱集作用(图2)。

实施例6：市售果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD发酵不同时长后对橘小实蝇的诱集作用

为了探索无丙二酸柠檬酸杆菌BD对果汁进行发酵不同时长后对橘小实蝇诱集的效果，选取了市面上常见的橙汁，在果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD进行不同时长的发酵，测试发酵后果汁对橘小实蝇的诱集效果。具体方法如下：

(1)购买“美汁源”牌果粒橙，每份准备100mL，备用；

(2)将100mL果粒橙与无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液(无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液的菌悬液制备方式：菌体于100mL LB培养基菌中过夜培养(12h)后，用4个50mL的离心管分装，每管装25mL，2300rpm、8min进行离心后去清液，用8mL无菌水悬菌)加入到锥形瓶中，准备三份，置于37℃、160～200rpm摇床中分别培养3h、12h和24h；

(3)在5m×5m×3m(长×宽×高)的室内，任意选取离地约0.8～1.3m高度的位置，并排放置三个碗口直径为10cm、容量1L的塑料碗，分别加入发酵不同时长的果粒橙与无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液混合液；

(4)在室内放入50头橘小实蝇雌虫和50头雄虫，室温维持在25℃及以上，灯光常亮，24h后记录各组中诱集到的雌雄虫数量；实验设置6组重复。

实验结果表明，果粒橙中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌株后发酵时长(3～24h)对诱集效果无显著影响(图3)。

实施例7：市售果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD对橘小实蝇的野外诱集作用

为了探索利用无丙二酸柠檬酸杆菌BD对野外橘小实蝇雌虫进行诱杀的方法，选取了在市面上常见的果汁中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD并测试对橘小实蝇的野外诱集效果。具体方法如下：

(1)购买“美汁源”牌果粒橙，每份准备200mL，备用；

(2)将200mL果粒橙与100mL无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液(无丙二酸柠檬酸杆菌BD菌悬液的菌悬液制备方式：菌体于100mL LB培养基菌中过夜培养(12h)后，2300rpm、16min进行离心后去清液，用100mL无菌水悬菌)混匀加入自制诱集瓶(图4)中作为实验组，设置200mL果粒橙与100mL清水混匀的为对照组；

(3)在广州市杨桃公园的杨桃园中任意选取离地约0.8～1.3m高度的位置，并排悬挂两个诱集瓶，实验设置3组重复。用马克笔分别对应写上“对照组”、“实验组”字样；诱集瓶悬挂后每隔1到2天记录诱集瓶上诱集到的橘小实蝇雌雄虫数量。

实验结果表明，果粒橙中加入无丙二酸柠檬酸杆菌BD可明显提高果汁对野外橘小实蝇雌、雄虫的诱集作用，且到第11天仍然可有效诱杀橘小实蝇(图5)。

Claims (10)

1.无丙二酸柠檬酸杆菌BD(Citrobacter amalonaticus BD)，其特征在于，其保藏编号为GDMCC NO.62161。

2.权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD在引诱橘小实蝇中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的橘小实蝇为橘小实蝇雌虫。

4.一种橘小实蝇引诱剂，其特征在于，包含权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD与适宜于该菌的发酵底物。

5.根据权利要求4所述的橘小实蝇引诱剂，其特征在于，包含权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD与橘小实蝇寄主果实，或包含权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD与橘小实蝇寄主果实的加工制品。

6.根据权利要求5所述的橘小实蝇引诱剂，其特征在于，所述的橘小实蝇寄主果实为番石榴、柑桔、香蕉、芒果、番木瓜、番荔枝、杨桃、火龙果、枇杷、枣、桃、苹果、梨、李、葡萄、柿、石榴、丝瓜、豇豆、苦瓜、黄瓜、茄子、南瓜、青椒或番茄果实。

7.根据权利要求5所述的橘小实蝇引诱剂，其特征在于，所述的橘小实蝇寄主果实的加工制品为果汁、果泥、果酱、果脯或果干。

8.一种诱杀橘小实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的无丙二酸柠檬酸杆菌BD加入到适宜于无丙二酸柠檬酸杆菌BD的发酵底物中，混匀制成引诱剂；然后将引诱剂装入诱集装置，将诱集装置放置于待诱杀橘小实蝇的目标场地；所述的诱集装置下部用于盛放引诱剂，上部设有用于散发气味的孔，诱集装置外壁上附着有粘虫胶。

9.根据权利要求8所述的诱杀橘小实蝇的方法，其特征在于，所述的适宜于无丙二酸柠檬酸杆菌BD的发酵底物为橘小实蝇寄主果实或橘小实蝇寄主果实的加工制品，并保证含有适宜于发酵的水分。

10.根据权利要求8所述的诱杀橘小实蝇的方法，其特征在于，所述的诱集装置为诱集瓶，液态的引诱剂装于诱集瓶内下部，诱集瓶上部设有若干用于散发气味的孔，诱集瓶外壁上均匀附着有粘虫胶；所述的诱集瓶和粘虫胶为黄色。