CN116003631A - 靶向cd7的人源化抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向CD7的人源化抗体及其应用，所述嵌合抗原受体(CAR)包括：抗原结合结构域(CD7scfv)和信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域(CD7scFv)，为抗人CD7抗体，其信号转导结构域由人CD8a分子铰链区与跨膜区CD8TM(CD8a‑CD8TM)、人CD28分子胞内区CD28(CD28)、人4‑1BB分子胞内区(4‑1BB)、人CD3ζ分子胞内区(CD3ζ)依次串联构成。本发明所述的抗体特异性更好、安全性更高、疗效更加显著。

Description

靶向CD7的人源化抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗CD7抗体，更具体的，本发明涉及一种靶向CD7的人源化抗体及其应用。

背景技术

CD7分子是一个含有40kDa的单链糖蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族。CD7分子是人体免疫细胞膜上一类重要的表面标志物,在CD7分子通过与其配体K12/SECTM1的结合在T细胞活化期间起到共刺激信号的作用。CD7分子作为血液系统恶性疾病的肿瘤细胞表面的异常标志物,在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤中呈高表达,约30％急性髓细胞白血病(AML)患者的肿瘤细胞中,可检测到CD7抗原表达。CD7阳性血液系统恶性肿瘤具有恶性程度高、侵袭力强、预后较差、疾病生存期更短的特征。血液肿瘤患者的T淋巴细胞高表达CD7抗原。这些CD7+的恶性肿瘤患者，在传统的化学治疗或放射治疗下，复发率和死亡率高，难以达到长期缓解。肿瘤细胞上CD7抗原的表达也与患者对标准化学疗法的耐药性相关。

CD7作为治疗白血病和淋巴瘤的靶标被广泛而深入地研究。

本发明旨在提供一种靶向CD7的人源化抗体及其在血液肿瘤治疗中的应用。

发明内容

本发明的发明目的之一在于提供一种针对现有技术的不足，提供特异性更好、安全性更高、疗效更加显著的抗体及其应用。

本发明的目的之二在于提供含有该抗体的细胞及其应用。

本发明的发明目的之三在于提供一种针对CD7阳性肿瘤的抗体。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案详述如下：

一种嵌合抗原受体(CAR)，其包括：抗原结合结构域(CD7scfv)和信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域(CD7scFv)，为抗人CD7抗体，其信号转导结构域由人CD8a分子铰链区与跨膜区CD8TM(CD8a-CD8TM)、人CD28分子胞内区CD28(CD28)、人4-1BB分子胞内区(4-1BB)、人CD3ζ分子胞内区(CD3ζ)依次串联构成。本发明的抗原结合结构域(CD7scfv)为筛选获得，信号传导结构域采用了本领域的常规信号传导结构域，本发明采用的信号传导结构域的序列和结构来自于中国发明专利CN111484563B，CAR的构建方法和步骤同CN111484563B实施例载明的方法和步骤。

一种抗人CD7单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

抗人CD7抗体，所述抗体的重链可变区HCDR1的序列如SEQ ID NO.2所示、HCDR2的序列如SEQ ID NO.3所示、HCDR3的序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗体的轻链可变区LCDR1的序列如SEQ ID NO.5所示、LCDR2的序列如SEQ ID NO.6所示、LCDR3的序列如SEQ ID NO.7所示。

一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体包含抗人CD7抗体HCDR1、

HCDR2、HCDR3的编码基因；抗人CD7抗体LCDR1、LCDR2、LCDR3的编码基因。

一种重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体包含抗原结合结构域

(CD7scFv)。

一种重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体包含本发明的抗原受体

CD7-CAR。

一种表达抗人CD7抗体HCDR1、HCDR2、HCDR3；抗人CD38抗体LCDR1、LCDR2、LCDR3的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种表达抗人CD7抗体的重链和轻链的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种表达CD7scFv的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种表达嵌合抗原受体CD7-CAR的细胞，该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

含有所述新型嵌合抗原受体、表达载体、所述细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。所述肿瘤为CD7呈阳性的肿瘤，优选骨髓瘤、淋巴瘤。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1表示采用电转的转染方式将质粒pMD19-T-CAR-CD7转入T细胞中，得到带有CD7-CAR基因的T淋巴细胞的阳性率；

图2表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性的Jurkat T急淋细胞共孵育24小时和48小时后显示的杀伤作用，效应细胞：靶细胞(E﹕T)＝5﹕1或1﹕1；

图3表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性的MOLT-4急淋细胞急淋细胞共孵育24小时和48小时后显示的杀伤作用，效应细胞：靶细胞(E﹕T)＝5﹕1或1﹕1；

图4表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性的HUT102细胞共孵育24小时和48小时后显示的杀伤作用，效应细胞：靶细胞(E﹕T)＝5﹕1或1﹕1；

图5表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性Jurkat和CD7阴性SUDHL2细胞(人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞)共孵育72小时，上清中分泌的IFN-γ；

图6表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性Jurkat和CD7阴性SUDHL2细胞(人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞)共孵育72小时，上清中分泌的GM-CSF；

图7表示携带CD7-CAR基因的T淋巴细胞与CD7阳性Jurkat和CD7阴性SUDHL2细胞(人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞)共孵育72小时，上清中分泌的IL-2。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，参考附图描述的实施例是示例性的，下面详细描述本发明的实施例。

下面参考图1－图7描述根据本发明的实施例。

本发明提供了一种靶向CD7的嵌合抗原受体、免疫效应细胞及其在临床治疗肿瘤中的应用，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆实验指南》(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购常规生化试剂商店或商品提供商。

实施例1全人源单链抗体文库的定向富集及Elisa初步筛选

基于全人源天然抗体库平台，通过抗原定向富集筛选并经Elisa初步验证。

具体流程：

(1)CD7抗原生物素化

抗原：50ug，1mg/ml

试剂：Thermo EZ-Link^TM NHS-PEG4-Biotin,No-Weigh^TM Format(A39259)

耗材：Zeba^TM脱盐离心柱

实验流程：

a计算EZ-Link^TM NHS-PEG4-Biotin用量

b生物素标记

准备20nM EZ-Link^TM NHS-PEG4-Biotin母液，根据计算在抗原溶液中加入适量体积的20nM母液，室温孵育30分钟；

c脱盐

蛋白脱盐离心柱预处理后，加入蛋白样品，1000×g离心2分钟收集样品。弃掉用过的柱子。

d生物素化检测

Beads预处理后，加入0.5ug生物素化的CD7抗原，室温孵育30分钟，将上清转移至新的1.5ml指形管，标记样品1，beads用PBST洗3遍后，加入SDS-PAGE变性上样缓冲液煮样，取上清标记为样品2。SDS-PAGE跑胶检测生物素标记情况。

实施例2靶向CD7抗原，定向富集筛选靶向性抗体序列

取200μL(含有噬菌体1×1012/mL)表达全人源单链抗体的噬菌体抗体库与5μgCD19抗原混合，室温孵育2小时后加入50μL的链霉亲和素磁珠，与抗原结合的噬菌体被链霉亲和素磁珠捕获，未结合的噬菌体经0.5％Tween-20的PBS溶液(磷酸缓冲液)漂洗后被去除，用盐酸甘氨酸溶液(pH 2.2)将与磁珠稳定结合的噬菌体洗脱待用。

接种XL1-Blue细菌20mL，待OD600(600nm波长处的吸光值，光密度)达到0.6后，加入上述洗脱的噬菌体，与XL1-Blue细菌在37℃静置30min，菌液涂布在氨苄青霉素抗性平板上，第二天洗脱收集氨苄抗性平板上的菌体，在侵染1×1012pfu/mL(pfu，plaqueformingunit，噬菌斑形成单位)的M13辅助噬菌体后，扩增后进行下一轮筛选，共进行3轮筛选。

b挑取单克隆制备phage

将侵染噬菌体的XL1-Blue菌液充分稀释，然后将此菌液涂布于直径为15cm抗性为氨苄青霉素的LB固体培养基平板，每个平板上有100-500个克隆，挑取单克隆抗体，制备phage用于ELISA初步验证。

c初步phage Elisa筛选阳性克隆

取酶联免疫微孔板，包被抗原4℃过夜，PBST(含tween-20的磷酸盐缓冲液)洗脱之后封闭，然后加入上一步制备好的噬菌体上清，室温孵育2h，PBST再加入Anti-M13 HRP抗体孵育30min，后用PBST洗3次，加入50μL显影液ABTS，显色后挑取阳性单克隆进行测序。

实施例3阳性单克隆sanger测序分析

挑取初步phage Elisa验证阳性的单克隆进行sanger测序，挑取富集程度最高的序列作为候选抗体序列。

具体流程：

(1)挑取初步phage Elisa验证阳性的单克隆进行sanger测序；

(2)Align分析测序结果，挑取富集程度最高的序列作为候选抗体序列。

实施例4表达纯化候选抗体

(1)构建重组真核表达质粒；

筛选得到的单克隆质粒，经限制性内切酶SfiⅠ酶切后连接后通过重组的方法将片段接入pFUSE表达载体(表达载体通过限制性内切酶SfiⅠ作用于酶切位点)中，获得抗体的pFUSE表达载体质粒。

(2)293F细胞真核表达系统表达候选抗体，并利用标签纯化抗体；

将293Fectin转染试剂与上述获得的真核抗体表达载体按照体积质量比为30μL：30μg的比例混合，加入30μL的293Freestyle悬浮细胞，在125rpm转速下37℃摇床培养48-72小时，离心后收集上清，利用protein A纯化抗体蛋白，得到抗CD7单链抗体(抗CD7全人源scFv抗体)。

(3)BCA法检测抗体浓度，并SDS-PAGE验证抗体纯度；参照BCA法蛋白定量试剂盒的说明书检测抗体浓度，SDS-PAGE验证抗体纯度

实施例5抗体功能验证

(1)候选抗体识别CD7抗原能力的检测

Elisa初步检测表达纯化的候选抗体与CD7抗原的结合能力，获得的EC50符合预期；

(2)Octet检测候选抗体亲和力

基于octet全自动测试平台，候选抗体的亲和力符合预期。

实施例6构建CAR-T并转染细胞系

按照中国发明专利CN111484563B记载的CAR-T的构建方法、步骤进行肿瘤细胞杀伤实验。结果见附图及附图说明。

相关基因序列如下：

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，包括：抗原结合结构域(CD7scfv)和信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域(CD7scFv)，为抗人CD7抗体，其信号转导结构域由人CD8a分子铰链区与跨膜区CD8TM(CD8a-CD8TM)、人CD28分子胞内区CD28(CD28)、人4-1BB分子胞内区(4-1BB)、人CD3ζ分子胞内区(CD3ζ)依次串联构成。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，抗原结合结构域(CD7scfv)的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种抗人CD7抗体，其特征在于，所述抗体的重链CDR区依次如SEQ ID NO.2、SEQIDNO.3、SEQ ID NO.4所示，轻链CDR区依次如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码基因。

5.一种免疫细胞，其特征在于，包含权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

7.权利要求5或6所述的免疫细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为CD7呈阳性的肿瘤。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤优选急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)，急性髓细胞白血病(AML)，T细胞淋巴瘤。

10.一种抗人CD7单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

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