CN116003629A

CN116003629A - 靶向muc1的嵌合抗原受体及其修饰的nk细胞

Info

Publication number: CN116003629A
Application number: CN202211410851.4A
Authority: CN
Inventors: 曾皓宇; 沈振波; 蒋碧愉
Original assignee: Shantou Prokairong Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shantou Prokairong Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-11-11
Also published as: CN116003629B

Abstract

本发明提供一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括特异性识别MUC1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体的特异性识别MUC1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，其中所述SEQ ID No:1中的X1为甘氨酸或丙氨酸，X2为赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种，X3为赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种，X4为甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种，X5为天冬氨酸或谷氨酸。本发明的嵌合抗原受体能够修饰NK细胞，显著提高NK细胞对食管癌和卵巢癌细胞的杀伤能力，且靶向性强。

Description

靶向MUC1的嵌合抗原受体及其修饰的NK细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种靶向MUC1的嵌合抗原受体、表达靶向嵌合抗原受体的NK细胞及其在制备抗食管癌和卵巢癌药物中的应用。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和免疫细胞的活化基序相结合，通过基因转导可以赋予免疫细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的生命力。该项技术最先在T细胞中实施并在CD19阳性的B淋巴细胞性白血病患者取得了巨大的成功。但由于CAR-T细胞是通过采集患者的T细胞，并进行修饰后给药的，为单人单次制备，治疗成本较高。嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)疗法发展迅速，在治疗恶性肿瘤，特别是血液系统恶性肿瘤方面取得了巨大的成就。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T细胞疗法也存在着一些问题，如杀伤能力低、对实体瘤尚未取得显著疗效。

自然杀伤(natural killer，NK)细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞，占外周循环淋巴细胞的10％～15％，在循环系统中的NK细胞通常处于休眠状态，一旦被激活，它们会渗透到组织中，分泌穿孔素及肿瘤坏死因子，攻击肿瘤细胞。而这一动态平衡主要受NK细胞表面受体蛋白的调控：杀伤细胞活化受体和杀伤细胞抑制受体。NK细胞有多个成熟的永生化的细胞系，其中NK92MI可在体外长期培养扩增，基因表型稳定，研究结果具有可重复性。

CAR-NK细胞疗法是通过基因工程修饰，在NK细胞表面表达能够和肿瘤特定抗原结合的CAR，能够特异性识别带有特定抗原的肿瘤细胞，引发免疫反应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。目前，临床前和临床研究表明，CAR-NK细胞疗法可能具有显著的抗肿瘤作用，相较于CAR-T细胞疗法，CAR-NK细胞疗法可补足相关劣势，可以靶向多种致病性抗原。此外NK细胞来源广，并不需要依赖患者自身特异性免疫细胞。

MUCl是由mucl基因表达的一种高糖基化、高分子量蛋白，又称附膜蛋白，是跨膜分子。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面都起到重要的作用。由于MUCl在肿瘤组织中的异常表达，使其成为一种重要肿瘤生物学标志物。MUCl广泛分布并异常丰富地表达于癌细胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情况下隐蔽的表位，成为免疫细胞攻击靶点。正常情况下，MUC1可表达于多种组织、器官中的上皮细胞，如消化道、呼吸道、乳腺、胰腺、生殖道，主要分布于腺细胞顶膜或以分泌形式存在于腺腔内，不被免疫系统识别。而在恶性肿瘤组织中如乳腺癌、胃癌、结肠癌等多种癌组织中，MUC1存在异常表达且存在畸形糖基化和糖基化不完全，并且MUCl表达增强，可达正常时的10倍以上，且结构发生改变，使MUC1核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整个癌细胞表面，可为免疫系统识别，成为肿瘤特异的抗原。

目前CAR-NK细胞在杀伤肿瘤方面，存在着杀伤率低、对癌细胞靶向性低等缺陷。MUCl在多种肿瘤细胞中过表达，如食管癌、卵巢癌。因此，设计出靶向MUC1的CAR及其修饰的NK细胞，使其靶向MUC1杀伤食管癌和卵巢癌细胞是本领域技术人员在研究中急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向MUC1的CAR和表达靶向MUC1的CAR-NK细胞，及其在制备抗食管癌和卵巢癌药物中的应用。

根据本发明的一个方面，提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括依次连接的特异性识别MUC1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体的特异性识别MUC1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，其中所述SEQID No:1中的X1为甘氨酸或丙氨酸，X2为赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种，X3为赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种，X4为甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种，X5为天冬氨酸或谷氨酸。上述单链抗体靶向性更好，杀伤性能更强，尤其是针对食管癌细胞、卵巢癌细胞以及与MUC1表达相关的其他肿瘤细胞。其中，X1为SEQ ID No:1中第17、228、234、236位点；X2为SEQ ID No:1中第43、49、57、65、107、112、120、146、165、190、203位点；X3为SEQ ID No:1中第19、213、220位点；X4为SEQ ID No:1中第25、37、161位点；X5为SEQID No:1中第60、74、85、96、125、133、173、186、200位点。

X1、X2、X3、X4、X5在序列表中均用X指代。

优选地，所述嵌合抗原受体的特异性识别MUC1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNo:2或SEQ ID No:3或SEQ ID No:4所示。

作为上述技术方案的进一步改进，上述嵌合抗原受体的铰链区为CD8α铰链区；上述嵌合抗原受体的跨膜结构域为NKG2D跨膜结构域；上述嵌合抗原受体的胞内结构域包含CD3ζ胞内结构域和2B4胞内结构域。采用上述铰链区、跨膜结构域、胞内结构域与上述单链抗体构成的嵌合抗原受体在三维结构配合得比较好，更容易转染NK细胞，且转染效率高，从而使单链抗体在空间上更易于结合抗原，使得单链抗体特异性识别MUC1的靶向性更强，杀伤肿瘤细胞的性能更好，尤其是针对MUC1表达的肿瘤细胞。

另一个方面，提供了一种核酸，所述核酸编码上述靶向MUC1嵌合抗原受体。

另一个方面，提供了一种表达载体，所述表达载体插入上述核酸，并且所述表达载体转染NK细胞，使得被转染后的NK细胞表达上述靶向MUC1的嵌合抗原受体。

优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。

另一个方面，提供了一种表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞，所述NK细胞由上述慢病毒表达载体包装成的慢病毒感染后得到，表达上述靶向MUC1的嵌合抗原受体。

优选地，所述NK细胞为NK92MI细胞系。NK92MI细胞易于扩增，不需纯化步骤，并且细胞毒性很强，其细胞表面因为缺失抑制性受体使其能够摆脱类似抑制性信号的干扰。

在一个优选实施例中，制备所述表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞的具体步骤包括，采用精细化配置的多种培养基，第一培养基、第二培养基、第三培养基，有效提高了NK细胞的存活率和NK细胞的阳性率，且使得NK细胞多次传代后依然能够稳定过表达MUC1，对肿瘤细胞具有较高的杀伤效果。

另一个方面，本发明提供了表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞在制备抗食管癌和卵巢癌药物中的应用。

另一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括上述表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞。

本发明的有益效果在于：本发明的嵌合抗原受体能够靶向MUC1，其修饰的NK细胞显著提高对肿瘤细胞的杀伤能力，且具有高度的特异性和靶向性，为后续制备抗食管癌和卵巢癌药物提供了广泛的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图2为本发明实施例2对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图3为本发明实施例3对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时的细胞生长状态图。

图4为本发明实施例1～3和对比例1～3构建的特异性识别抗原CAR-NK-MUC1细胞和阴性对照组(未经转染的NK92MI细胞)对于EC109食管癌细胞、HO8910卵巢癌细胞、KY140食管鳞癌细胞、KY150食管鳞癌细胞的杀伤对比图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

1.嵌合抗原受体CAR的序列选择

CAR的基本结构由单链抗体、铰链区、跨膜结构域、胞内结构域四部分组成，本发明筛选出的CAR其特异性识别MUC1的单链抗体如SEQ NO：2所示。

2.制备CAR-NK细胞

S1.取适量生长状态较好的NK细胞悬液，300g离心2～5min，去上清，收集NK细胞，用第一培养基重悬细胞，向12孔板一个孔中加入(5～500)×10⁴万个细胞(不超过1mL)，按MOI＝5～100向12孔板中加入带CAR的慢病毒，再加入聚凝胺(聚凝胺终浓度为90μg/mL的水溶液)，并加入第一培养基至总体积为3mL，将孔板置于37℃培养箱预热10min；

S2.同时将恒温离心机调成600～1000g，30～36℃，10min离心预热至30～36℃。将预热后的12孔板转移至离心机中，600～1000g离心30min～3h，30～36℃；

S3.离心结束后，将12孔板取出，按1mL/孔加入聚凝胺(聚凝胺终浓度为90μg/mL的水溶液)的第二培养基，移液枪于孔正中间轻轻吹打混匀3～5次，将孔板转移回培养箱中培养，培养期间根据培养基颜色和细胞数量判断是否半换液或传代，培养基为第三培养基；

S4.当细胞传代至起始数10倍以上时，取20万个细胞做流式检测阳性率。当细胞生长至(5～10)×10⁶万个细胞左右时，准备细胞做流式分选，GFP阳性的细胞为转染成功的细胞，GFP阳性比例通过流式进行检测，通过计算CAR-NK细胞(GFP阳性细胞)与总细胞的比值，得到CAR-NK细胞感染的阳性率。将转染后的细胞进行流式分选，分选出GFP阳性的细胞群，即为阳性率较高的CAR-NK细胞。再将阳性率高的CAR-NK细胞继续培养扩增。在对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-MUC1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-MUC1细胞的生长状态如图1所示。

其中，第一细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇0.5mM，叶酸0.5mM，巯基乙醇0.05mM，胎牛血清2vol％，马血清2vol％，双抗2vol％。

第二细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇1mM，叶酸0.5mM，巯基乙醇0.1mM，胎牛血清20vol％，马血清30vol％，双抗1vol％。

第三细胞培养基的具体组成如下：在MEM基础培养基中加入肌醇2mM，叶酸0.1mM，巯基乙醇0.005mM，胎牛血清20vol％，马血清5vol％，双抗0.5vol％。

实施例2

实施例2的操作方式与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1的CAR序列中特异性识别MUC1的单链抗体替换成如SEQ NO：3所示的氨基酸序列。其中，在对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-MUC1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-MUC1细胞的生长状态如图2所示。

实施例3

实施例3的操作方式与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1的CAR序列中特异性识别MUC1的单链抗体替换成如SEQ NO：4所示的氨基酸序列。其中，在对CAR-NK-MUC1细胞进行培养时，显微镜下对CAR-NK-MUC1细胞进行观察并拍照，CAR-NK-MUC1细胞的生长状态如图3所示。

对比例1

对比例1的操作方式与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中CAR的单链抗体氨基酸序列第17位点的X1替换为赖氨酸、第107位点的X2替换为甘氨酸、第220位点的X3替换为谷氨酸、第37位点的X4替换为赖氨酸、第85位点的X5替换为丝氨酸。

对比例2

对比例2的操作方式与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中CAR的单链抗体氨基酸序列第17位点的X1替换为赖氨酸、第228位点的X1替换为谷氨酸、第107位点的X2替换为谷氨酸、第112位点的X2替换为丙氨酸、第19位点的X3替换为精氨酸、第220位点的X3替换为丙氨酸、第161位点的X4替换为天冬氨酸、第37位点的X4替换为丙氨酸、第85位点的X5替换为丝氨酸、第133位点的X5替换为赖氨酸。

对比例3

对比例3的操作方式与实施例1基本相同，主要区别在于将实施例1中CAR的单链抗体氨基酸序列第17位点的X1替换为赖氨酸、第234、236位点的X1替换为组氨酸、第49位点的X2替换为天冬氨酸、第120、146位点的X2替换为缬氨酸、第220位点的X3替换为亮氨酸、第19、213位点的X3替换为谷氨酸、第25位点的X4替换为谷氨酸、第37位点的X4替换为丙氨酸、第60位点的X5替换为丙氨酸、第173、200位点的X5替换为甘氨酸。

测试例1

1.按照以下方式检测上述制备得到的CAR-NK细胞对EC109细胞的杀伤性能：

本测试例的参试对象为实施例1、2、3和对比实施例1、2、3所制得的CAR-NK细胞(称为CAR-NK-MUC1细胞)，传代培养2个月后，按照以下方式检测其杀伤性能：

S1.洗板：吸掉板内液体，每个孔用高压灭菌水洗涤2次；再用NaOH溶液浸泡1-4h，用高压灭菌水洗涤2次；最后用DPBS润洗1次。

S2.铺板：将培养好的目标肿瘤细胞系消化、离心、重悬、台盼蓝染色计数，按1-10万活细胞/孔接种电流板，补加适量培养基，上机放入培养箱中监测。细胞生长曲线为平滑上升，且孔间差异不大，则视为细胞生长正常。

S3.加入上述制备得到的靶向MUC1的CAR-NK细胞：以肿瘤细胞系生长曲线平缓期开端点为加NK细胞时间点。将待测CAR-NK细胞取出离心、重悬、台盼蓝染色计数，按肿瘤细胞接种量：NK＝3：1的比例加入电流板中，上机(实时细胞分析仪)放入培养箱中持续监测杀伤情况。采用未经转染的NK92MI细胞作为阴性对照组。

测试例2

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成HO8910卵巢癌细胞。

测试例3

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成KY140食管鳞癌细胞。

测试例4

具体操作同测试例1，只是将杀伤对象换成KY150食管鳞癌细胞。

上述实施例1～3和对比实施例1～3制备得到的CAR-NK细胞进行杀伤肿瘤细胞的测试，测试结果如图4所示。实施例1～3转染后的CAR-NK细胞(称为CAR-NK-MUC1细胞)对于这四种肿瘤细胞相对于阴性对照组(没有转染的NK细胞)，具有明显增强的杀伤能力，而对比例1～3转染后的CAR-NK细胞相对于阴性对照组杀伤四种肿瘤细胞的杀伤效果不明显。而且实施例1～3的CAR-NK细胞作用于食管癌细胞和卵巢癌杀伤效果显著，靶向性强。

以上测试结果说明，将单链抗体氨基酸序列的X1、X2、X3、X4或X5位点替换成其他氨基酸，对肿瘤细胞的杀伤效果不好，靶向性不高，因此本发明提供的嵌合抗原受体能够靶向MUC1，其修饰的NK细胞显著提高对肿瘤细胞的杀伤能力，且具有高度的特异性和靶向性，为后续制备抗食管癌和卵巢癌药物提供了广泛的临床应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次连接的特异性识别MUC1的单链抗体、铰链区、跨膜结构域和胞内结构域；所述嵌合抗原受体的特异性识别MUC1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，其中所述SEQ ID No:1中的X1为甘氨酸或丙氨酸，X2为赖氨酸、组氨酸、精氨酸中的其中一种，X3为赖氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、缬氨酸中的其中一种，X4为甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸中的其中一种，X5为天冬氨酸或谷氨酸。

其中，所述X1为所述SEQ ID No:1中第17、228、234、236位点；

所述X2为所述SEQ ID No:1中第43、49、57、65、107、112、120、146、165、190、203位点；

所述X3为所述SEQ ID No:1中第19、213、220位点；

所述X4为所述SEQ ID No:1中第25、37、161位点；

所述X5为所述SEQ ID No:1中第60、74、85、96、125、133、173、186、200位点。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的特异性识别MUC1的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No:2或SEQ ID No:3或SEQ IDNo:4所示。

3.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入如权利要求3所述的核酸。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。

6.一种表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞，其特征在于，所述NK细胞由如权利要求4所述的表达载体转染后得到。

7.如权利要求6所述的表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞在制备抗食管癌和卵巢癌药物中的应用。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括如权利要求6所述的表达靶向MUC1嵌合抗原受体的NK细胞。