CN115998897A - 一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料及其制备方法和应用，属于生物材料治疗与再生医学技术领域。本发明以透明质酸为主体分子，以胰岛素样生长因子C结构域多肽为客体分子，分别制备金刚烷修饰的胰岛素样生长因子C结构域多肽和β‑环糊精修饰的透明质酸，然后将二者通过非共价结合的主客体化学反应制成一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料。该透明质酸生物材料具有透明质酸的物理和化学性质，同时又可以结合胰岛素样生长因子C结构域多肽，可以携带任意浓度的该多肽，进而发挥两者的生物活性；该透明质酸生物材料具有可直接结肠内注射和调节肠道功能的作用，从而能够有效促进结肠炎的损伤修复。

Description

一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物材料治疗与再生医学技术领域，尤其涉及一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料及其制备方法和应用。

背景技术

结直肠虽然位于胃肠道的最后一部分，但它是人体最重要的消化器官，包括水和电解质的再吸收、粪便的形成和排泄、维生素和氨基酸的生物合成、短链脂肪酸(SCFAs)的代谢。最近的研究发现，肠道通过微生物-肠道-脑轴调节中枢神经系统的功能。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)包括克罗恩病(Crohn’s disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)，其发病特点是由环境、微生物、遗传和免疫等多种因素引起的持续性腹泻、腹痛、溃疡出血、大便血等，从结直肠到全胃肠道均有影响。目前IBD的治疗方法根据疾病的严重程度分为几个等级，从美萨拉嗪、糖皮质激素、硫唑嘌呤(AZA)到抗肿瘤坏死因子(TNF)的单克隆抗体(McAbs)和结肠切除术等。尽管这些治疗方案在某种程度上显示出良好的疗效，但它们大多旨在改善IBD的次级影响，并在长期治疗中发挥免疫抑制作用，从而不可避免地增加免疫功能障碍、感染、肾毒性和肝毒性的风险，而不是根本上解决肠道屏障功能和肠道菌群相互作用这些内在问题。

以间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)为基础的治疗包括急性肾损伤和心肌梗死等多种疾病，由于其免疫调节和旁分泌活性，显示出良好的治疗效果，但难以避免原位移植后的继发损伤和原位注射后的保留/存活率低。因此，目前迫切需要建立替代治疗策略，以提高治疗IBD药物的疗效和安全性。而MSCs来源的分泌组，包括细胞因子、细胞外基质(ECM)和生长因子，被认为是替代无细胞治疗方法的主要生物活性成分，以减轻疾病和组织再生。在大量细胞因子中，很多研究表明内源性和外源性胰岛素样生长因子1(IGF-1)是一种促有丝分裂和巨噬细胞调节蛋白，参与了间充质干细胞的免疫调节特性，增强了隐窝细胞的完整性。此外，人工合成的功能性短肽(10-100个氨基酸，分子量<10kDa)药物结合合适的给药体系，可以提高药物的选择性、效价、控释和体内生物相容性，合成成本较低，而疗效与全长生长因子相似。因此，含有GYGSSSRRAPQT多肽的IGF-1C及其衍生的生物材料已被应用于心肌梗死(MI)、急性肾损伤(AKI)等多种疾病。

透明质酸(HA)是一种天然存在的由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸连接重复单元组成的糖胺聚糖，广泛分布于关节、眼睛、结缔组织和细胞外基质中，具有良好的机体缓冲和液体滞留的作用。因此，由于其具有良好的生物降解性、生物相容性和可变性，被广泛应用于制药、化妆品和生物医学领域。与全长天然HA相比，平均分子量在45.2～145kDa的低分子量HA(LMW-HA)具有显著的活性氧(ROS)清除能力和抗氧化能力。因此，以HA为基础的新型生物支架材料和靶向给药系统已经初步在组织工程学领域中显示出其优势。利用纳米材料携带多肽药物策略的发展，使人们对替代目前治疗IBD的临床药物产生了新的兴趣。超分子化学包括β-环糊精(CD，主体)和金刚烷(Ad，客体)的相互作用，已广泛应用于组织工程和注射治疗。

因此，设计一种以HA为注射载体，并通过主客体作用结合具有生物活性的多肽分子，可以在患病部位定点释放该多肽，并进一步发挥治疗作用，延长治疗时间，可以为结肠炎的临床前研究提供新的参考和思路。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料及其制备方法和应用。本发明以透明质酸为主体分子，以胰岛素样生长因子C结构域多肽为客体分子，分别制备金刚烷修饰的胰岛素样生长因子C结构域多肽和β-环糊精修饰的透明质酸，然后将二者通过非共价结合的主客体化学反应制成一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料。该透明质酸生物材料具有透明质酸的物理和化学性质，同时又可以结合胰岛素样生长因子C结构域多肽，可以携带任意浓度的该多肽，进而发挥两者的生物活性；该透明质酸生物材料具有可直接结肠内注射和调节肠道功能的作用，从而能够有效促进结肠炎的损伤修复。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料，由透明质酸动态结合胰岛素样生长因子C结构域多肽制成。

优选的，所述透明质酸为平均分子量在45.2～145kDa范围内的低分子量透明质酸，所述胰岛素样生长因子C结构域多肽的具体序列如SEQIDNo.1所示。

本发明还提供了一种所述透明质酸生物材料的制备方法，所述胰岛素样生长因子C结构域多肽通过主客体化学反应结合到透明质酸分子上。

优选的，所述主体分子为透明质酸，所述客体分子为胰岛素样生长因子C结构域多肽，主体分子和客体分子通过非共价的包合作用相互连接。

优选的，所述制备方法具体包括以下步骤：步骤一：制备金刚烷修饰的胰岛素样生长因子C结构域多肽Ad-IGF-1C；步骤二：制备β-环糊精修饰的透明质酸CD-HA；步骤三：通过非共价结合的主客体化学反应生成所述透明质酸生物材料HA-IGF-1C。

优选的，所述步骤三的具体过程为：(1)首先在CD-HA粉末中加入PBS缓冲液，并充分溶解；(2)然后称取Ad-IGF-1C于EP管中，加入PBS吹散溶解；(3)待CD-HA溶液成为均一且分散，并带有一定粘稠程度的胶状溶液后，加入上述溶解好的Ad-IGF-1C，充分搅拌，使得HA上的环糊精充分与IGF-1C上的金刚烷包合；(4)所得溶液即为HA-IGF-1C母液。

优选的，所述步骤(1)中CD-HA粉末的使用量为25～35mg，PBS的加入量为0.8～1.2ml，充分溶解的时间为1.5～2.5h；所述步骤(2)中Ad-IGF-1C的使用量为5～15mg，PBS的加入量为0.8～1.2ml；所述步骤(3)中Ad-IGF-1C的加入体积为2～20μl。

优选的，所述步骤(1)中CD-HA粉末的使用量为30mg，PBS的加入量为1ml，充分溶解的时间为2h。

优选的，所述步骤(2)中Ad-IGF-1C的使用量为10mg，PBS的加入量为1ml。

本发明还提供了一种所述透明质酸生物材料在制备治疗结肠炎药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中的透明质酸生物材料具有透明质酸的物理和化学性质，同时又可以结合胰岛素样生长因子C结构域多肽，可以携带任意浓度的该多肽，进而发挥两者的生物活性；该透明质酸生物材料具有肠道定点可注射性和滞留性，可直接于结肠内注射，具有调节肠道功能的作用，从而能够有效促进结肠炎的损伤修复。

附图说明

图1为实施例1中Ad-IGF-1C的结构图；

图2为实施例2中CD-HA的核磁共振氢谱图；

图3为实施例3中HA、CD-HA和HA-IGF-1C的扫描电镜图像；

图4为实施例4中不同浓度CD-HA和Ad-IGF-1C对于肠上皮细胞体外活性的影响图；

图5为实施例5中MODE-K细胞的GFP荧光标记图、梯度加入不同数量细胞后的荧光量标准曲线图和加入不同浓度过氧化氢后的ROS损伤情况图；

图6为实施例6中各组小鼠的体重和粪便情况图和造模7天后各组小鼠结肠组织切片染色图；

图7为实施例7中各组小鼠结肠组织F4/80蛋白免疫荧光染色结果图；

图8为实施例8中损伤后1、3、5、7天各组小鼠腹部发光成像定量分析图；

图9为实施例9中各组小鼠血清中FD4的检测结果图和各组小鼠结肠组织肠道上皮紧密连接相关蛋白表达情况图。

具体实施方式

下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制。本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明中涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。

实施例1 制备Ad-IGF-1C

1.首先将苏氨酸(T)的C端按照0.5～0.7mmol/g的接载率接在树脂上，使用溶解于DMF溶剂的25％哌啶(C5H11N)脱除氨基的Fmoc基；

2.在多肽缩合剂HBTU(O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和催化剂DIEA(N,N-二异丙基乙胺)催化下，依次重复添加5倍摩尔过量的活化谷氨酰胺(Q)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、丝氨酸(S)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)和1-金刚烷乙酸进行脱水缩合反应；

3.依次使用30ml DMF和DCM反复冲洗树脂10次，再使用TFA处理树脂，将多肽从树脂上洗脱；

4.旋蒸后得到浓缩液，用冰乙醚处理后离心，收集沉淀；

5.使用DMSO溶解沉淀，使用HPLC纯化Ad-IGF-1C；

6.将溶液转移到试管中，在超低温冰箱中冷冻过夜冻干，得到成品Ad-IGF-1C。其结构图如图1所示。

本发明中所使用的IGF-1C多肽片段来源于IGF-1生长因子C结构域，具体序列为SEQIDNo.1：GYGSSSRRAPQT。由图1可知，本发明中所使用的金刚烷修饰的IGF-1C通过脱水缩合将IGF-1C的羧基与多肽链的N端相连。

实施例2 制备CD-HA

1.首先通过离子交换，将透明质酸转化为TBA盐的形式。

具体来说：(1)将2g HA完全溶解于100ml去离子水中，加入Dowex 50W×86g，在室温下继续搅拌30min；(2)使用去离子水溶解四丁基氢氧化铵(TBA-OH)使其终浓度为40％、20％和8％；(3)随后，通过添加40％TBA-OH将多肽溶液滴定至pH 5，然后通过添加20％TBA-OH至pH 7，最后通过添加8％TBA-OH至pH 7.02-7.05；(4)将溶液转移到试管中，在超低温冰箱中冷冻过夜冻干，并保存，产物即为TBA-HA。

2.其次对β-CD进行改性以形成中间产物CD-Tos。

具体步骤为：(1)将10gβ-CD悬于70ml去离子水中，冷却至0℃。将2.1g对甲苯磺酰氯溶于5ml乙腈中，逐滴加入溶液中。反应在室温下搅拌2h；(2)将1.1g氢氧化钠溶解在4ml去离子水中，并在10分钟内将其滴加到CD溶液中。继续在室温下搅拌30分钟。溶液会变成微黄色并变得更清澈；(3)然后在溶液中加入8g氯化铵，调整pH值为9，将溶液置于冰上冷却，收集沉淀，真空加压过夜，得到干燥的CD-Tos；(4)分别使用冰的去离子水和冰的丙酮洗涤CD-Tos，重复两次，4000g离心，弃上清，最后通过真空蒸发器去除残留的有机物，得到纯净的CD-Tos。

3.随后通过CD-Tos进一步合成中间产物CD-HDA。

首先向烧瓶中加入1g CD-Tos，4g 1,6-己二胺(HDA)和5ml DMF，反应在80℃的氮气条件下进行18h；反应后经冷丙酮沉淀，4000g离心，弃上清，重复此步骤两次；随后使用冷乙醚洗涤，4000g离心，弃上清，使用真空蒸发器干燥，得到白色干燥的CD-HDA。

4.最后将CD-HDA和HA-TBA进行反应最终生成CD-HA。

具体步骤如下：(1)向烧瓶中加入1g HA-TBA和1.2g CD-HDA，用氮气吹扫，再加入40ml无水DMSO；(2)将0.4g BOP溶解于10ml无水DMSO中，待完全溶解后将其转移至HA-TBA/CD-HDA溶液中，室温搅拌3h；(3)使用2ml冷去离子水中止反应，并将体系转移至透析管，室温透析5天，每日换水2次；(4)将溶液冷冻、冻干，得到成品CD-HA。其核磁共振氢谱图如图2所示。

图2证明，CD-HA化学结构中具有HA单体不存在的alkyl chain结构。

实施例3 制备HA-IGF-1C

1.首先称取30mg上述制备得到的并经过紫外杀菌的CD-HA粉末于带有磁力搅拌棒的瓶中，加入1ml冷的PBS缓冲液于冰水浴中充分溶解2h；

2.称取10mg上述改性好的Ad-IGF-1C多肽于EP管中，加入1ml PBS吹散溶解；

3.待CD-HA溶液成为均一且分散，并带有一定粘稠程度的胶状溶液后，向其中加入上述2～20μl溶解好的Ad-IGF-1C多肽，继续在冰水浴中充分搅拌，使得HA上的环糊精充分与IGF-1C上的金刚烷包合作用；

4.所得溶液即为HA-IGF-1C母液，等体积分装于EP管中，保存于-20℃待用。

进一步的，使用扫描电子显微镜观察HA、CD-HA和HA-IGF-1C的表面形貌，具体为将HA、CD-HA和上述制备好的HA-IGF-1C溶解于PBS并放置于-80℃冰箱中冷冻过夜，放入低温冷冻冻干机冻干并喷金处理，使用Phenom ProX台式扫描电子显微镜在加速电压10kV电场下观察HA、CD-HA和HA-IGF-1C的表面结构与形态区别，结果如图3所示。

通过观察物质的表面形态，可以发现HA-IGF-1C与HA和CD-HA同样具有多孔的片层结构，并且由于表面负载有IGF-1C，可以看出HA-IGF-1C的表面形态要比HA和CD-HA更加饱满。

实施例4 探究CD-HA与Ad-IGF-1C的生物相容性

在本发明中，我们首先评价了不同浓度的CD-HA对于肠道上皮细胞生长状况的影响，我们将CD-HA用PBS稀释成不同的浓度，并使用涂布棒均匀覆盖在皿底，待凝胶稳定后在孔板中接种小鼠肠上皮细胞系MODE-K，并进行细胞活力检测，待确定最适的CD-HA浓度后，我们通过在CD-HA上装载不同浓度的Ad-IGF-1C多肽，以确定最佳的培养条件，具体方法如下：

1.复苏与传代小鼠肠上皮细胞系(MODE-K)：(1)准备1640培养基，胎牛血清，双抗，谷氨酰胺。配制含有10％FBS、1％双抗、1％谷氨酰胺的1640完全培养基待用；(2)将冻存的MODE-K细胞从液氮中取出，于37℃水浴锅中复温，待细胞刚好解冻时，加入等体积的1640完全培养基，300g，5min离心弃上清，将细胞重悬，按照3×10⁵细胞/毫升接种于T25培养瓶，每天换液；(3)待细胞生长至80％以上时，进行传代操作。首先弃掉细胞培养基，用PBS洗涤细胞两次；(4)加入500微升0.25％胰蛋白酶，将培养瓶转移至培养箱中孵育3分钟，期间在显微镜下观察细胞的融合状态，待细胞完全消化为单个细胞时，使用2毫升1640完全培养基中和胰蛋白酶，收集细胞悬液于离心管中，300g，5min离心，弃掉上清，将细胞重悬，按照1：5传代于新的T25培养瓶。

2.取30mg实施例2中制备得到的并经过紫外杀菌的CD-HA粉末放置于带有磁力搅拌棒的瓶中，加入1ml冷的PBS缓冲液于冰水浴中充分溶解2h，所得溶液即为30mg/ml浓度的CD-HA母液；

3.将以上母液使用PBS稀释成0，10，20，40，80，100，200μg/ml工作液，并均匀涂布在96孔细胞培养板底，放置于37℃细胞培养箱半小时；

4.按照5×10³/孔接种密度，将上述MODE-K细胞传代到孔板中，培养24h。

5.将CCK-8原液和培养基按照1：10稀释，替换孔板中的培养基，继续于细胞培养箱中培养2h；

6.将孔板放置于酶标仪中，检测450nm处的吸光度。

7.按照上述方法将CD-HA基质稀释至100μg/ml的工作液，并通过加入不同浓度Ad-IGF-1C多肽，稳定后在孔板中接种小鼠肠上皮细胞系MODE-K，并进行细胞活力检测，具体操作如下：

(1)在冰浴搅拌过程中向其中加入上述不同体积的溶解好的Ad-IGF-1C多肽，继续在冰水浴中充分搅拌，使得IGF-1C的终浓度为0，1，2，4，8，10，50，100，200，400ng/ml，将充分包合好的HA-IGF-1C均匀涂布在96孔细胞培养板底，放置于37℃细胞培养箱半小时；

(2)按照上述方法传代MODE-K细胞系，按照5×10³/孔接种密度，将细胞传代到孔板中，培养24h；

(3)将CCK-8原液和培养基按照1：10稀释，替换孔板中的培养基，继续于细胞培养箱中培养2h；

(4)将孔板放置于酶标仪中，检测450nm处的吸光度。

不同浓度CD-HA和Ad-IGF-1C对于肠上皮细胞体外活性的影响结果如图4所示。

由图4可知：在100μg/ml浓度的CD-HA上装载浓度为10ng/ml的Ad-IGF-1C，对于MODE-K的细胞生长情况最佳，在各组横向比较的实验中证明无论是CD-HA还是Ad-IGF-1C均没有细胞毒性。

实施例5 利用双模标记(GFP-Fluc)的小鼠肠上皮细胞系，评价灌肠药物HA-IGF-1C的抗氧化损伤性能

1.双模GFP-Fluc慢病毒的包装。

(1)在100mm dish中接种约10⁷生长状态良好的HEK293T细胞；

(2)按照脂质体通用操作手册，使用lipo3000将9μg pLV-GFP-Fluc质粒，4.5μgpSPAX2，1.2μg pVSVG质粒转染至细胞；

(3)10h后将带有转染体系的培养基吸弃，将培养基更换成含有5％FBS的条件培养基，继续培养48h，每24h更换一次培养基，并收集放置于于4℃冰箱；

(4)将所有收集好的病毒上清液收集至50ml离心管，500g 5min去除死细胞，并冻存于-80℃冰箱中储存，不超过6个月。

2.双模标记的小鼠肠上皮细胞系DF-MODE-K的建立

(1)按照实施例4中的方法复苏野生型MODE-K细胞系于T25培养瓶中，等到生长至80％后按照1：4传代，待细胞生长至状态良好(大约传代3次)后，按照2×10⁵接种至6孔板，待细胞生长至50％左右即可进行慢病毒感染步骤；

(2)将离心机预热至37℃，并将上述准备好的双模慢病毒放置于冰上慢慢解冻，使用移液枪吸取1ml加入到含有8μg/ml polybrene的1ml新鲜无双抗的1640培养基中混匀，并替换6孔板中的旧培养基；

(3)将孔板放置于预热好的离心机中，1600rpm离心1h；

(4)将离心好的孔板放置于培养箱中继续培养6h后，更换为1640完全培养基；

(5)传代后加入1μg/ml嘌呤霉素对细胞进行筛选，期间在荧光显微镜下观察GFP信号，确定阳性细胞比率；

(6)将稳定表达双模系统的细胞按照0，3.2×10⁴，6.5×10⁴，1.25×10⁵，2.5×10⁵，5×10⁵细胞接种于6孔板中，培养24小时；

(7)将荧光素酶底物D-Luciferin使用PBS稀释成1mg/ml的工作液，吸弃培养基，每孔加入1.5ml含有底物的PBS，将孔板放入BLI成像系统暗室内，使用生物发光采集系统对信号进行采集；

(8)使用Living Image软件对成像结果进行定量分析，分析其线性关系。

3.装载IGF-1C多肽的透明质酸基质对于肠上皮细胞的保护性评价。

(1)按照实施例4中的方法，将CD-HA基质稀释至100μg/ml的工作液，在冰浴搅拌过程中向其中加入上述2～20μl溶解好的Ad-IGF-1C多肽，继续在冰水浴中充分搅拌，使得IGF-1C的终浓度为10ng/ml，将充分包合好的HA-IGF-1C分别均匀涂布在96孔和24孔细胞培养板底，放置于37℃细胞培养箱半小时；

(2)按照上述方法传代MODE-K和DF-MODE-K细胞系，按照5×10³/孔和2×10⁴接种密度，将细胞分别接种到96孔板和24孔板中，培养24h；

(3)使用1640培养基对浓度为1M的过氧化氢母液进行稀释，使其终浓度分别为0，0.3，0.5，1，2，5mM；

(4)将旧培养基吸弃，加入带有不同浓度过氧化氢的培养基，放置于培养箱中孵育6h；

(5)对于接种于96孔板中的MODE-K细胞，将CCK-8原液10μl直接加入到培养基中，继续培养2h，随后将孔板放置于酶标仪中，检测450nm处的吸光度。

(6)对于接种于24孔板中的DF-MODE-K细胞，将荧光素酶底物D-Luciferin使用PBS稀释成1mg/ml的工作液，吸弃培养基，每孔加入500μl含有底物的PBS，将孔板放入BLI成像系统暗室内，使用生物发光采集系统对信号进行采集；

(7)使用Living Image软件对成像结果进行定量分析。

通过慢病毒感染方法建立双模标记的小鼠肠上皮细胞系DF-MODE-K，可以通过GFP荧光观察到MODE-K细胞成功被标记上报告基因(图5A)。随后通过在6孔板中，梯度加入不同数量的细胞，并使用生物发光成像系统根据荧光量绘制标准曲线(图5B，5C)，并在培养体系中加入不同浓度过氧化氢以模拟结肠炎受损后的ROS损伤情况。结果显示，相比于单独添加HA和IGF-1C，装载IGF-1C多肽的透明质酸基质(HA-IGF-1C)具有更好的氧化应激保护效果。

实施例6 灌肠注射HA-IGF-1C验证小鼠结肠炎损伤治疗效果

对小鼠进行统一造模后，按照治疗类型进行分组，分为Sham组(假手术组，仅进行甘油涂抹和灌肠管介入，不接受损伤和治疗)、PBS组(结肠炎造模+PBS灌肠治疗)、HA组(结肠炎造模+HA灌肠治疗)、HA-IGF-1C组(造模+HA-IGF-1C灌肠治疗)。

1.小鼠结肠炎模型的建立以及HA-IGF-1C灌肠治疗

(1)首先对小动物手术所用器械包括眼科镊，眼科剪等进行清洗和高温高压灭菌，并对小动物手术台进行至少1h的紫外照射杀菌。另准备长度为7cm左右的小动物专用灌肠用无菌注射软管，1ml一次性无菌注射器等备用；

(2)对小鼠进行称重，通过腹腔注射2.5％avertin麻醉小鼠，使小鼠处于半昏迷，辅以异氟烷气麻，随后将小鼠头朝下放置于倾角约40°的斜面，使用胶带固定住小鼠尾部；

(3)将5％TNBS水溶液与无水乙醇等比例混合均匀配制成工作液，使用1ml无菌灌肠管吸取TNBS工作液，在小鼠肛门处涂抹少量甘油，轻轻将灌肠管从肛门缓慢进入小鼠直肠和结肠部位，距肛门约3.5cm即可，随后轻轻将药液注入肠道；

(4)将小鼠缓慢从斜面取下，头朝下保持30～60s，使得药液充分在肠道中驻留；

(5)待小鼠慢慢苏醒，放归鼠笼；

(6)将造模时间记为day 0，在day 1至day 3期间，每天使用与造模同样的方法，将上述提包合好的HA-IGF-1C生物活性材料共100μl，并将HA和PBS作为对照，以同样的方式缓慢灌入肠道并每天记录小鼠体重与粪便情况，进行疾病活动指数(DAI score)半定量评分；

(7)于day7对小鼠肠道部位进行取材，将肠道内容物在冷的PBS中冲洗干净后放置于4％PFA中固定20h。

2.苏木素&伊红(H&E)染色评价HA-IGF-1C生物活性材料对于小鼠结肠炎模型

(1)将上述固定好的结肠组织经过70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯梯度脱水；

(2)将组织浸没于65℃的石蜡中4h以上，随后进行包埋；

(3)将包好的组织放置于石蜡切片机，使用16μm进行修块，暴露出完整的肠道组织，随后放入冰水中预冷1h；

(4)使用6μm刀头对组织进行连续切片，在水浴锅中进行展片，随后在载玻片上进行位置固定，并放置于68℃进行烤片，待其冷却后室温保存6个月；

(5)将制备好的石蜡切片进行脱蜡操作，按照二甲苯，无水乙醇，95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，75％乙醇进行复水；

(6)将组织切片放置于蒸馏水中浸泡10min后放置于苏木素中染色3～5min；

(7)将组织切片放置在流动的水中冲洗1～2min；

(8)捞出切片，并放置于1％盐酸-乙醇分化液分化3s使得细胞核着色；

(9)将组织切片放置在流动的水中冲洗1～2min；

(10)捞出切片，并放置于伊红中染色3min

(11)对切片再次进行脱水处理，按照70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，无水乙醇，二甲苯梯度脱水，最后用中性树胶进行封片，并于显微镜下拍摄照片。

为了评价HA-IGF-1C是否在体内对结肠炎小鼠具有促进结肠组织修复的作用，我们对BALB/c小鼠使用TNBS诱导急性结肠炎损伤。在造模后的前三天每天进行灌肠治疗，并在一周内对小鼠的体重和粪便情况进行记录和半定量评分，在造模7天后对各个组的结肠组织进行组织切片并进行H&E染色，结果图如6所示。

由图6可知，HA-IGF-1C组的DAI评分最低，最接近于Sham组，说明结肠炎情况得到明显好转，HA-IGF-1C组的结肠组织结构完整，可以看到完整的肠道上皮结构，炎症浸润程度最低，效果最好；相比于PBS组来说，HA组的结肠组织结构虽有所改善，但是仍存在很多炎症浸润的情况，且结肠上皮长度相比HA-IGF-1C来说明显缩短。

实施例7 验证HA-IGF-1C对结肠炎小鼠炎症浸润的降低作用

1.小鼠结肠组织的冰冻切片制备

(1)于day7对小鼠肠道部位进行取材，将肠道内容物在冷的PBS中冲洗干净后放置于4％PFA中固定20h；

(2)将固定好的结肠组织放入30％蔗糖中脱水24h，待结肠组织从液面下沉到管底；

(3)将脱水完全的结肠组织放入OCT包埋，放置于-80℃冰箱过夜；

(4)将冰冻切片机开机，将切片厚度调整为6μm后进行连续切片，将切好的样本黏附于载玻片后放于-80℃冰箱保存不超过半年。

2.结肠组织切片免疫荧光染色

(1)将上述切片从-80℃冰箱取出，恢复室温30min；

(2)使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(3)使用免疫组化笔在组织样本周围画圈，随后在圈内滴加足量的0.5％TritonX-100，室温破膜15min；

(4)使用PBS配制10％NGS封闭液，将破膜剂甩掉后在圈内滴加足量的封闭液，室温封闭2h；

(5)使用10％NGS按照1：200配制一抗，待封闭结束后直接滴加一抗，放置于4℃孵育过夜；

(6)次日使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(7)使用10％NGS按照1：200配制二抗，室温避光孵育2h；

(8)使用PBS按照1：1000配制DAPI，滴加在切片样本上室温染核30min；

(9)使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(10)滴加封片剂封片，放置于荧光显微镜下拍照。

为了进一步评估HA-IGF-1C对结肠炎组织的炎症抑制作用，在对小鼠进行结肠炎造模并进行灌肠给药治疗后，对结肠组织F4/80蛋白进行免疫荧光染色，结果如图7所示。

结果显示，相比于PBS组HA治疗组，HA-IGF-1C治疗组的F4/80阳性细胞最少，说明巨噬细胞浸润程度显著改善。

实施例8 评估HA-IGF-1C对于小鼠结肠炎氧化应激损伤的保护作用

1.鲁米诺工作液的配制和使用

(1)首先称取0.4g NaOH粉末，溶解于100ml灭菌蒸馏水中，配制成0.1M NaOH溶液；

(2)称取17.7mg鲁米诺粉末于15ml离心管，加入10ml上述NaOH溶液，震荡充分溶解，过0.22μm滤膜后室温避光保存，一周内使用完毕；

2.体内化学发光成像评价

(1)对小鼠进行称重，通过腹腔注射2.5％avertin麻醉小鼠，使小鼠处于完全昏迷状态；

(2)使用一次性无菌注射器将上述配置好的0.01M鲁米诺工作液按照100μl/10g的剂量腹腔注射，随后将小鼠仰卧位放置于BLI成像系统暗室内，并使用胶带固定住小鼠四肢和尾部；

(3)等待1min后，小鼠状态稳定即可进行成像和腹部信号采集；

(4)下机后将小鼠放置于加热垫，等待小鼠苏醒后放置鼠笼；

(5)分别在day1，day3，day5，day7对肠炎小鼠进行成像分析。

对损伤后1、3、5、7天的小鼠腹部进行学发光成像以评估不同组的氧化应激损伤程度，并进行定量分析，结果如图8所示。

结果显示，相比于PBS和HA对照组，HA-IGF-1C灌肠治疗显著降低了小鼠结肠炎过程中产生的ROS，氧化应激情况在第三天HA-IGF-1C治疗时得到明显恢复。

实施例9 验证HA-IGF-1C具有维持结肠炎小鼠肠道上皮细胞完整性的作用

1.口服FITC-dextran(FD4)检测血清中的荧光信号以评估HA-IGF-1C对结肠炎小鼠肠道上皮细胞完整性的维持作用，具体步骤如下：

(1)结肠炎小鼠造模方法同实施例6，在造模损伤后的第四天对各组治疗小鼠进行禁食6h；

(2)按照0.5mg/kg的剂量对不同组的小鼠进行FD4灌胃处理；

(3)4h后采集各组小鼠血清样本，在Synergy H4多模微板阅读器上测量荧光值；

(4)FD4的浓度是根据空白小鼠血清绘制的标准曲线计算得出。

2.通过对肠道上皮细胞marker进行免疫荧光染色，评估负载IGF-1C多肽的生物活性透明质酸对小鼠肠道上皮细胞完整性的保护，具体步骤如下：

(1)肠道冰冻切片同实施例7，将切片从-80℃冰箱取出，恢复室温30min；

(2)使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(3)使用免疫组化笔在组织样本周围画圈，随后在圈内滴加足量的0.5％TritonX-100，室温破膜15min；

(4)使用PBS配制10％NGS封闭液，将破膜剂甩掉后在圈内滴加足量的封闭液，室温封闭2h；

(5)使用10％NGS按照1：200配制ZO-1和Occludin抗体一抗混合液，待封闭结束后直接滴加混合一抗，放置于4℃孵育过夜；

(6)次日使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(7)使用10％NGS按照1：200配制混合二抗，室温避光孵育2h；

(8)使用PBS按照1：1000配制DAPI，滴加在切片样本上室温染核30min；

(9)使用干净的PBS溶解洗涤切片3次，每次10min；

(10)滴加封片剂封片，放置于荧光显微镜下拍照。

通过建立小鼠结肠炎损伤模型，使用HA-IGF-1C通过灌肠给药的方式进行干预，同时使用PBS和HA作为对照组，对小鼠血清中的FD4加以检测，可以发现负载IGF-1C多肽的生物活性透明质酸可以有效减少肠道的渗漏情况(图9A)，进一步对结肠组织的冰冻切片进行免疫荧光分析发现，HA-IGF-1C灌肠治疗后，肠道上皮紧密连接相关蛋白ZO-1和Occludin表达得到明显恢复，说明HA-IGF-1C具有促进渗漏的结肠修复的作用(图9B)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种新型、浓度可控的透明质酸生物材料，其特征在于，所述透明质酸生物材料由透明质酸动态结合胰岛素样生长因子C结构域多肽制成。

2.根据权利要求1所述的透明质酸生物材料，其特征在于，所述透明质酸为平均分子量在45.2～145kDa范围内的低分子量透明质酸，所述胰岛素样生长因子C结构域多肽的具体序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1～2任一所述的透明质酸生物材料的制备方法，其特征在于，所述胰岛素样生长因子C结构域多肽通过主客体化学反应结合到透明质酸分子上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述主体分子为透明质酸，所述客体分子为胰岛素样生长因子C结构域多肽，主体分子和客体分子通过非共价的包合作用相互连接。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤一：制备金刚烷修饰的胰岛素样生长因子C结构域多肽Ad-IGF-1C；

步骤二：制备β-环糊精修饰的透明质酸CD-HA；

步骤三：通过非共价结合的主客体化学反应生成所述透明质酸生物材料HA-IGF-1C。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三的具体过程为：

(1)首先在CD-HA粉末中加入PBS缓冲液，并充分溶解；

(2)然后称取Ad-IGF-1C于EP管中，加入PBS吹散溶解；

(3)待CD-HA溶液成为均一且分散，并带有一定粘稠程度的胶状溶液后，加入上述溶解好的Ad-IGF-1C，充分搅拌，使得HA上的环糊精充分与IGF-1C上的金刚烷包合；

(4)所得溶液即为HA-IGF-1C母液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)中CD-HA粉末的使用量为25～35mg，PBS的加入量为0.8～1.2ml，充分溶解的时间为1.5～2.5h；

所述步骤(2)中Ad-IGF-1C的使用量为5～15mg，PBS的加入量为0.8～1.2ml；

所述步骤(3)中Ad-IGF-1C的加入体积为2～20μl。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)中CD-HA粉末的使用量为30mg，PBS的加入量为1ml，充分溶解的时间为2h。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤(2)中Ad-IGF-1C的使用量为10mg，PBS的加入量为1ml。

10.权利要求1～10任一所述的透明质酸生物材料在制备治疗结肠炎药物中的应用。

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