CN115997819A - 由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶及其制备方法和风味物质指纹图谱的构建 - Google Patents

由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶及其制备方法和风味物质指纹图谱的构建 Download PDF

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潘道东
范贤康
吴振
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Abstract

本发明提供了一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其包括S1：发酵酸奶的种子溶液、启动剂的制备后，将全脂奶粉与蔗糖在60‑70℃下溶解在无菌水中，均质处理，得到复原乳；S2：将枸杞膳食纤维加入至所述步骤S1的复原乳中，混合后灭菌处理，等待复原乳冷却；S3：将步骤S1中得到的种子溶液和启动剂依次接种至所述步骤S2处理后的复原乳中，发酵后冷却保存得到由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶；本发明还提供了该酸奶以及其风味物质指纹图谱的构建，通过本发明制备得到的酸奶提供了枸杞渣下脚料的应用方向，通过双元益生菌发酵解决了枸杞膳食纤维中枸杞多糖等抑菌物质残留导致酸奶中活菌数低的问题。

Description

由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶及其制备方法和风味物质指纹图谱的构建
技术领域
本发明涉及农业食品凝固型酸奶领域，具体而言，涉及一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶及其制备方法和风味物质指纹图谱的构建。
背景技术
酸奶是由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为启动剂制成的。具有促进消化、改善胃肠道、预防癌症、提高免疫力等功能。在后COVID-19时代，消费者越来越重视酸奶等具有提高免疫力和胃肠道功能的食品，此外，酸奶的独特风味是其在全球流行的重要原因，酸奶中宝库超过100种的挥发性味道，包括酸、醇、醛、酯、碳氢化合物、硫化合物、羰基化合物和杂环化合物。然而，不依靠食品添加剂，酸奶产品存在乳清易沉淀、口感差、风味单一等瓶颈，限制了其产业化发展。因此，开发具有稳定质地、独特风味和潜在益生特性的酸奶至关重要。
益生菌被定义为活性微生物，当食用一定数量时，能够对宿主产生健康益处，而乳酸菌是益生菌的典型类型。
膳食纤维是指不能被人类内源性酶消化吸收的可食用植物细胞、多糖及相关物质的总和，包括木质素、纤维素、果胶、β-葡聚糖、菊粉和低聚糖，膳食纤维能够改变酸奶的结构，增加了酸奶的坚固性、凝聚力和粘性。此外，随着枸杞的营养价值和药用价值被广泛认可，枸杞产业蓬勃发展，产生了大量的枸杞渣，枸杞渣中含有丰富的膳食纤维，因此探索从枸杞渣中提取膳食纤维的应用，是实现废弃资源有效利用和保护环境的关键步骤。然而，由于枸杞多糖和枸杞色素等抗菌物质的残留，抑制酸奶中乳酸菌生长，从而影响酸奶的品质，导致枸杞膳食纤维(WDF)作为稳定剂在酸奶中应用仍存在一定距离。
发明内容
本发明提供了一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，解决了因枸杞产业蓬勃发展，产生的大量枸杞渣污染环境问题以及枸杞膳食纤维缺乏应用领域的问题。
为解决上述问题，本发明提供一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，包括以下步骤：
S1：选取植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌涂布于MRS平板上，静置培养后活化，将培养后的嗜热链球菌在M17肉汤中于42℃培养16h，将培养后的保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌分别在MRS肉汤中于37℃培养24h，将培养后的所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌以及保加利亚乳杆菌的培养液分别离心并洗涤后用无菌盐水回收，回收得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌的细菌汁液即为发酵酸奶的种子溶液，回收得到的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的细菌汁液即为发酵酸奶的启动剂；
将全脂奶粉与蔗糖在60-70℃下溶解在无菌水中，并均质处理，得到复原乳；
S2：将枸杞膳食纤维加入至所述步骤S1的复原乳中，混合后进行灭菌处理，灭菌后等待复原乳冷却；
S3：将步骤S1中得到的种子溶液和启动剂依次接种至所述步骤S2处理后的复原乳中，发酵后冷却保存得到由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15953，命名为L.plantarum 53；所述干酪乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15956，命名为L.casei 56。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述离心并洗涤的条件为：用无菌盐水将细菌浓度调整到1×109CFU/mL，然后在4℃以5000×g的离心率离心5分钟，洗涤三次；所述均质处理的条件为：将溶液在17MPa下均质5分钟。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述所述全脂奶粉、所述蔗糖与所述无菌水的体积比为：(10-12):(6-7):(81-84)。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为(0.5-5)：(95-99.5)。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为2:98。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述灭菌处理的条件为：将枸杞膳食纤维与复原乳的混合液在95℃下灭菌10分钟，所述冷却的条件为：将复原乳置于42℃的水浴环境中冷却。
作为优选的方案，所述步骤S3中，所述种子溶液的浓度为6.5×106CFU/mL；所述发酵的条件为：将接种种子溶液后的复原乳在42℃的培养箱中发酵6小时；所述冷却保存的条件为：将发酵后的复原乳在4℃的环境下保存12小时。
本发明要解决的其中一个技术问题是：提供一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，以解决了WDF在酸奶中应用时乳酸菌活菌数低的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，由上述任一项制备方法制备获得。
与现有技术相比，本发明开发了一款风味独特、高益生菌含量且具有潜在益生特性的酸奶，提供了枸杞渣下脚料的应用方向，通过双元益生菌发酵解决了WDF中枸杞多糖等抑菌物质残留导致酸奶中活菌数低的问题，建立了双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的风味指纹图谱，此外确定了双元益生菌可以通过酪氨酸代谢途径促进L.caseiCGMCC NO.15956产生酪醇从而提高酸奶中乳酸菌含量，通过添加双元益生菌和枸杞膳食纤维解决了酸奶乳清析出、风味单一的问题。
本发明要解决的其中一个技术问题是：提供上述酸奶风味指纹图谱的构建方法，通过添加双元益生菌和枸杞膳食纤维解决了酸奶乳清析出、风味单一的问题，对酸奶风味进行表征。
为了解决上述问题，本发明提供了一种双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶风味物质指纹图谱的构建，包括以下步骤：
A：非挥发性风味物质指纹图谱的构建：将100毫克所述风味酸奶加入至2毫升无菌离心管中，在试管中加入200μL甲醇和甲基叔丁基醚，并混合，将混合后的样品在4℃下以12000rpm的速度离心10分钟，然后通过0.22微米的膜，将过滤后的样品准备用HPLC-MS仪器进行检测，得到非挥发性风味物质指纹图谱；
B：可挥发性风味物质指纹图谱的构建：将5克所述风味酸奶置于萃取瓶中，在55℃、350rpm下萃取1小时；设定气相色谱仪的载气为He，流速为1.0mL/min，入口温度为250℃，起始温度为35℃并保持5分钟，然后以5℃/分钟的速度升至140℃并保持2分钟，最后升至250℃，速度为10℃/分钟，保持3分钟，得到可挥发性风味物质指纹图谱。
附图说明
图1是本发明实施例中WDF和双元益生菌对酸奶品质的影响图；
图2是本发明实施例中非挥发性代谢物的PCA得分图和热图；
图3是本发明实施例中涉及代谢物的富集途径；
图4是本发明实施例中可挥发性风味物质图谱；
图5是本发明实施例中酸奶中挥发性风味物质的VIP值图。
附图说明：
图1中，(1):不同WDF添加量对酸奶的滞后性的影响；(2):WDF和双元益生菌对嗜热链球菌活力的影响；(3):WDF和双元益生菌对保加利亚乳杆菌活力的影响；(4):双元益生菌对植物杆菌53活力的影响；(5):双元益生菌对L.casei56的影响；(6):对酸奶的pH值和TA的影响；(7):表观粘度；(8):频率扫描；(9):感官评价，字母a、b、c表示显著差异，其中p<0.05表示差异显著，p>0.05表示差异不显著；图1(7)、(8)中，字母D、E、F、G和H代表不同的酸奶组，它们分别代表只添加启动剂的酸奶、只添加WDF而不添加益生菌的酸奶、添加WDF和益生菌L.plantarum53的酸奶、添加WDF和L.casei 56的酸奶，以及添加WDF、L.plantarum 53和L.casei 56的酸奶。
图2中，(1):PCA得分图；(2):非挥发性代谢物的热图；字母D、E、F、G和H代表不同的酸奶组，它们分别代表只添加启动剂的酸奶、只添加WDF而不添加益生菌的酸奶、添加WDF和益生菌L.plantarum53的酸奶、添加WDF和L.casei 56的酸奶，以及添加WDF、L.plantarum53和L.casei 56的酸奶；
图3中，(1):与对照组D相比，E组中涉及代谢物的富集途径；与E组相比，单益生菌L.plantarum 53(2)和L.casei56(3)分别涉及代谢物的富集途径。分别与单益生菌L.plantarum 53(4)和L.casei 56(5)相比，参与代谢物的富集途径受到双元益生菌的影响；
图4中，(1):PCA；(2):挥发性风味物质的热图。字母D、E、F、G和H代表不同的酸奶组，它们分别代表只添加启动剂的酸奶、只添加WDF而不添加益生菌的酸奶、添加WDF和益生菌L.plantarum 53的酸奶、添加WDF和L.casei 56的酸奶，以及添加WDF、L.plantarum 53和L.casei 56的酸奶。
图5中，(1):D组和E组的比较，得出了由于添加WDF而导致的酸奶挥发性风味物质变化的重要变量；(2):E组和F组的比较，产生了由于添加单益生菌L.plantarum 53而导致的酸奶挥发性风味物质变化的重要变量；(3)、(4):F组和H组的比较，产生了由于添加双元益生菌L.casei 56产生的挥发性风味物质变化的重要变量。(5):G组和H组的比较，产生了由于添加双元益生菌而使L.plantarum 53产生的挥发性风味物质变化的重要变量。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中的以下缩略语具体定义为：
L.plantarum 53，Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum CGMCCNO.15953植物乳杆菌
L.casei 56，Lacticaseibacilluscasei CGMCC NO.15956干酪乳杆菌
WDF，枸杞膳食纤维
HPLC-MS，液质联用；
GC-MS，气质联用；
LAB，乳酸菌；
本发明设置的对照组：D、E、F、G、H，D、E、F、G和H代表不同的酸奶组，它们分别代表只添加启动剂的酸奶、只添加WDF而不添加益生菌的酸奶、添加WDF和益生菌L.plantarum53的酸奶、添加WDF和L.casei 56的酸奶，以及添加WDF、L.plantarum 53和L.casei 56的酸奶，其他的实验方式与处理手段与实施例相同。
本发明提供一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，包括以下步骤：
S1：选取植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌涂布于MRS平板上，静置培养后活化，将培养后的嗜热链球菌在M17肉汤中于42℃培养16h，将培养后的保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌分别在MRS肉汤中于37℃培养24h，将培养后的所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌以及保加利亚乳杆菌的培养液分别离心并洗涤后用无菌盐水回收，回收得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌的细菌汁液即为发酵酸奶的种子溶液，回收得到的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的细菌汁液即为发酵酸奶的启动剂；
将全脂奶粉与蔗糖在60-70℃下溶解在无菌水中，并均质处理，得到复原乳；
S2：将枸杞膳食纤维加入至所述步骤S1的复原乳中，混合后进行灭菌处理，灭菌后等待复原乳冷却；
S3：将步骤S1中得到的种子溶液和启动剂依次接种至所述步骤S2处理后的复原乳中，发酵后冷却保存得到由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15953，命名为L.plantarum 53；所述干酪乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC NO.15956，命名为L.casei 56。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述离心并洗涤的条件为：用无菌盐水将细菌浓度调整到1×109CFU/mL，然后在4℃以5000×g离心5分钟，洗涤三次；所述均质处理的条件为：将溶液在17MPa下均质5分钟。
作为优选的方案，所述步骤S1中，所述全脂奶粉、蔗糖与水的体积比为：(10-12):(6-7):(81-84)。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为(0.5-5)：(95-99.5)。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为2:98。
作为优选的方案，所述步骤S2中，所述灭菌处理的条件为：将枸杞膳食纤维与复原乳的混合液在95℃下灭菌10分钟，所述冷却的条件为：将复原乳置于42℃的水浴环境中冷却。
作为优选的方案，所述步骤S3中，所述种子溶液的浓度为6.5×106CFU/mL；所述发酵的条件为：将接种种子溶液后的复原乳在42℃的培养箱中发酵6小时；所述冷却保存的条件为：将发酵后的复原乳在4℃的环境下保存12小时。
本发明要解决的其中一个技术问题是：提供一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，以解决了枸杞膳食纤维在酸奶中应用时乳酸菌活菌数低的问题。
本发明提供了一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，由上述任一项制备方法制备获得。
本发明要解决的其中一个技术问题是：提供上述酸奶风味指纹图谱的构建方法，通过添加双元益生菌和枸杞膳食纤维解决了酸奶乳清析出、风味单一的问题，对酸奶风味进行表征。
本发明提供了一种双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶风味物质指纹图谱的构建，包括以下步骤：
A：非挥发性风味物质指纹图谱的构建：将100毫克所述风味酸奶加入至2毫升无菌离心管中，在试管中加入200μL甲醇和甲基叔丁基醚，并混合，将混合后的样品在4℃下以12000rpm的速度离心10分钟，然后通过0.22微米的膜，将过滤后的样品准备用HPLC-MS仪器进行检测，得到非挥发性风味物质指纹图谱；
B：可挥发性风味物质指纹图谱的构建：将5克所述风味酸奶置于萃取瓶中，在55℃、350rpm下萃取1小时；设定气相色谱仪的载气为He，流速为1.0mL/min，入口温度为250℃，起始温度为35℃并保持5分钟，然后以5℃/分钟的速度升至140℃并保持2分钟，最后升至250℃，速度为10℃/分钟，保持3分钟，得到可挥发性风味物质指纹图谱。
以下结合数据和实际的应用以及对比对上述的方案进行解释与说明：
实施例1：
一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，所述由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶采用以下方法制备得到：
S1：选取植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌，保加利亚乳杆菌涂布于MRS平板上，静置培养后，等到连续3代活化后，将培养后的嗜热链球菌在M17肉汤中于42℃培养16h，将培养后的保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌分别在MRS肉汤中于37℃培养24h得到乳杆菌培养液，用无菌盐水将上述4种细菌的细菌浓度调整到1×109CFU/mL，然后在4℃以5000×g离心5分钟，洗涤三次，用无菌盐水回收，回收得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌的细菌汁液即为发酵酸奶的种子溶液，回收得到的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的细菌汁液即为发酵酸奶的启动剂；
WDF(枸杞膳食纤维)添加量的确定：
分别加入3％、5％、7％、9％和11％(w/v)的全脂奶粉至65℃下溶于无菌水中，然后加入6.5％(w/v)的蔗糖，在17MPa下均质5分钟。然后分别加入0％、0.5％、1％、2％、3％、4％和5％(w/v)的枸杞膳食纤维，在10MPa下均质5分钟，将混合后的样品在95℃下灭菌10分钟，然后在42℃的水浴中冷却，将嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌作为启动剂加入酸奶中，接种量为6.5×106CFU/mL，均质后在42℃的培养箱中发酵6小时，然后在4℃的冰箱中后熟12小时。
将20克的酸奶样品在10℃下以222×g离心10分钟，然后称量酸奶上清液的质量。酸奶的保水能力根据以下公式计算。
酸奶的保水率(％)＝m2/m1×100，其中m1是酸奶样品的质量，m2是酸奶上清液的质量。
全脂奶粉和蔗糖在65℃下分别以11％(w/v)和6.5％(w/v)的比例溶解在无菌水中，在17MPa下均质5分钟；
S2：根据步骤S1中的测算，确定加入酸奶中的枸杞膳食纤维的量为2％(w/v)，将枸杞膳食纤维和复原乳混合并在95℃下灭菌10分钟，并在42℃的水浴中冷却；
S3：将种子溶液以6.5×106CFU/mL接种到复原乳中，并根据菌株的类型分为5组，嗜热菌和保加利亚杆菌是启动剂，也分别添加至复原乳中，将处理后的复原乳在42℃的培养箱中发酵6小时，然后在4℃的冰箱中后熟12小时，即得到本发明所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶；
本发明还包括对上述酸奶进行风味物质指纹图谱的构建的方法，包括以下步骤：
A：对于非挥发性风味物质，首先将100毫克酸奶样品加入2毫升无菌离心管中，然后向每个试管中加入200μL甲醇和甲基叔丁基醚，并剧烈混合60秒。混合后的样品在4℃下以12,000rpm离心10分钟，然后通过0.22微米的膜。过滤后的样品准备用HPLC-MS仪器进行检测；
B：对于可挥发性风味物质，采用顶空固相微萃取技术(HS-SPME)提取酸奶中的挥发性风味化合物。将5克酸奶样品置于萃取瓶中，在55℃、350rpm下萃取1小时。GC-MS仪器的品牌和型号为Agilent 8890GC System+5977B/MSD。气相色谱仪的载气为He，流速为1.0mL/min，入口温度为250℃。起始温度为35℃并保持5分钟，然后以5℃/分钟的速度升至140℃并保持2分钟。最后升至250℃，速度为10℃/分钟，保持3分钟；
本发明还包括对上述酸奶测定酸奶活菌数、酸度、质构、流变、感官的步骤，具体包括以下步骤：
取5种发酵酸奶1mL于9mL无菌生理盐水中，用移液器混合，按照同样的操作程序，进行了9次连续稀释，将每次稀释的酸奶溶液的100微升涂抹在选择培养基上，使用M17琼脂培养基在42℃的好氧培养箱中培养24小时，使用MRS琼脂(pH5.2)培养基测定酸奶中的保加利亚杆菌，在43℃的厌氧培养箱中培养72小时。L.plantarum 53使用山梨醇培养基(用等量的山梨醇代替MRS培养基中的葡萄糖，其他成分保持不变)，在37℃厌氧培养箱中培养2天。L.casei 56使用LC(pH 5.0)培养基在25℃的好氧培养箱中培养72小时。每个稀释的酸奶涂抹三次，培养完成后，使用全自动菌落计数器对培养物进行计数。
使用pH计(Sartorius PB-10，德国)来测定发酵酸奶的pH，称取10克酸奶样品并置于无菌采样袋中，加入20毫升无菌水和2毫升酚酞指示剂并混合均匀。之后，用NaOH标准溶液滴定酸奶中的可滴定酸度(TA)；
酸奶的硬度、稠度、凝聚力、胶粘性和咀嚼性是通过质地特性分析仪(StableMicro System，英国)测定的：首先选择一个12.7毫米的柱状探头，然后将预测量、测量和后测量的速率分别设定为1.0mm/s、1.0mm/s和2.0mm/s，此外，压缩程度和测量温度被设定为20毫米和15℃，发酵酸奶的流变特性由流变仪DHR-2(TA-WATERS有限公司，美国)测定。测试温度控制在25℃，频率固定在1Hz，应变扫描范围为0-50％，截面确定为0.5％，样品在剪切状态下扫描，剪切率从0增加到500s-1，然后从500s-1减少到0s-1，扫描时间为360s，频率扫描固定在0.5％，扫描范围为0.1-10Hz。感官评价是根据表1采用定量描述性分析(QDA)方法进行的。由30名经过专业培训的人员(10名男性和10名女性)根据颜色、味道、气味和组织状态等四个独立的质量特征对酸奶进行感官评估。
实施例2：实施例2与实施例1类似，其不同之处在于：所述步骤S1中，全脂奶粉与蔗糖的添加量为10％、6％，所述步骤S2中，枸杞膳食纤维的添加量为0.5％；
实施例3：实施例3与实施例1类似，其不同之处在于：所述步骤S1中，全脂奶粉与蔗糖的添加量为12％、7％，所述步骤S2中，枸杞膳食纤维的添加量为5％；
本发明设置了5组对照组，分别为对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5，依次命名为D、E、F、G、H组，D、E、F、G、H组的实验方法与实施例1相同，D、E、F、G、H组中均添加了启动剂，其不同之处在于，添加的其他原料与实施例1有所不同，具体如下：D组是不添加枸杞膳食纤维和益生菌的空白对照组，E组只添加枸杞膳食纤维，不添加益生菌，F组添加枸杞膳食纤维和益生菌L.plantarum53，G组添加枸杞膳食纤维和L.casei 56，H组添加枸杞膳食纤维，L.plantarum 53和L.casei 56。
以下对实施例1与对照组D、E、F、G、H组制备得到的酸奶样品进行检测：
滞后是一种不理想的现象，会严重影响酸奶的质量和消费者的接受度，表现为乳清在表面的沉淀。这是由于蛋白质网络结构在外力(高温或离心等)的作用下重新排列，从而使自由水从凝胶网络结构中释放出来。如图1所示，与对照组(0％)相比，加入较低浓度(0.5％-3％，w/v)的WDF可以显著(P<0.05)减少不同乳粉含量(3％-11％，w/v)的酸奶的滞后现象。添加高浓度(4％-5％，w/v)的WDF不利于减少酸奶的滞后现象。这可能是WDF中存在残留的枸杞多糖和枸杞色素，影响了酸奶中LAB的生长，导致酸度过低，酪蛋白无法形成优良的凝胶网络结构。此外，WDF含有β-葡聚糖。研究表明，低浓度的β-葡聚糖可以有效地保留水分，但高浓度的β-葡聚糖的糖枝会附着在酪蛋白上形成蛋白质团，从而破坏酪蛋白的网络结构。
以乳粉含量为3％(w/v)的酸奶为例，与对照组相比，添加了2％(w/v)WDF的酸奶的突变率从43.89％明显下降到21.22％。这可能是由于WDF主要含有果胶和多糖，如菊粉、β-葡聚糖和低聚糖，其中果胶由阴离子水胶体组成，可以与酪蛋白网络相互作用，增加其捕获乳清的能力和表观粘度。酸奶中的多糖可以作为增稠剂。因此，选择2％(w/v)作为WDF的添加量。
S1.WDF和双元益生菌对活体LAB的影响
酸奶中活体LAB的数量是一个重要的指标，LAB需要达到特定的摄入量才能发挥其益生菌功能，所以酸奶中活体LAB的数量不应低于1×106CFU/mL。如图1-B和C所示，与对照组D(只含启动剂)相比，E组(含启动剂和2％WDF)的嗜热菌和保加利亚杆菌的数量明显减少(P<0.05)，说明WDF抑制了LAB的生长速度。这是由于WDF中的许多多糖本身没有抗菌活性，但当降解到一定的分子量范围时，它们会产生明显的抗菌效果。与E组相比，添加益生菌L.plantarum 53(F组)和L.casei 56(G组)显著地(P<0.05)促进了嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的生长。
在图1-D和E中，与单益生菌组F和G相比，双元益生菌组H在发酵6小时和在4℃储存12小时的时间点中，L.plantarum 53和L.casei 56的数量都显著增加(P<0.05)。特别是在12小时，双元益生菌组中L.plantarum53和L.casei 56的活体计数分别显著增加8.81和8.29lg(CFU/mL)。这表明L.plantarum 53和L.casei 56在WDF酸奶中可以明显促进彼此的生长。这可能是由于单益生菌在发酵过程中的蛋白质分解能力较弱，而且乳糖发酵程度低，限制了益生菌的生长。但双元益生菌发酵增强了益生菌利用酪蛋白和乳糖的能力。为了研究这一现象的原因，代谢组学被用来阐明其机制。
S2.WDF和双元益生菌对pH和TA的影响
酸奶的酸度影响其凝胶强度和口感，反映了菌种产酸的能力，因此在工业酸奶生产中，它可能比活菌数更重要，因为通常以pH4.5作为发酵的终点。在图1-F中，与对照组(F组，pH4.28)相比，添加WDF(E组，pH4.50)明显增加了酸奶的pH。这与WDF中存在的抗氧化物质如多酚和多糖有关，它延迟了LAB的生长。与E组相比，添加L.plantarum 53(F组，pH4.32)和L.casei 56(G组，pH 4.39)明显降低了酸奶的pH值。这可能是由于L.plantarum 53是从酸菜中筛选出来的，具有较高的产酸能力。与F组和G组相比，添加双元益生菌(H组，pH4.24)可促进产酸，该结果与TA的趋势一致。
S3.对酸奶质地的影响
酸奶的质地对消费者的接受程度有直接影响。如表1所示，与对照组D相比，添加WDF明显改善了酸奶的硬度、粘附性、胶质性和咀嚼性，但对弹力、粘性和回弹性没有明显影响。WDF中的多糖可能是其粘度增加的主要原因。粗纤维可以为酸奶提供一个脚手架，从而加强其结构并增加表观粘度，而细纤维可以作为填料来稳定酪蛋白网络。
与E组相比，单益生菌组F(含L.plantarum 53)和G(含L.casei 56)的酸奶硬度、粘附性和胶质性明显增强，而且L.plantarum 53的效果要大于L.casei 56。在酸奶的发酵过程中，LAB可以产生泥浆以增加粘度，它主要由细胞外多糖组成，如半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖和木糖。因此，L.plantarum 53可能是一种比L.casei 56更能产生粘液的细菌，以增加酸奶的粘度。
与单益生菌组F和G相比，双元益生菌组H(含有L.plantarum 53和L.casei 56)酸奶的硬度、粘附性和胶粘性都明显上调(P<0.05)。结果表明，双元益生菌对酸奶的硬度、粘度和胶质度有增强作用。这可能是L.plantarum 53和L.casei 56共同培养时的生长促进作用，因此促进了甘露糖等胞外多糖的产生。
表1酸奶质构
Figure BDA0003719940340000131
Figure BDA0003719940340000141
S4.流变学特性
在图1-G中，五个酸奶样品的表观粘度随着剪切速率的增加而降低，表明了剪切稀化流体的行为。这可能是因为随着剪切速率的增加，蛋白质分子逐渐向同一方向移动，分子间的相互作用力减少，导致氢键等化学键的断裂和蛋白质的解离。与对照组D相比，含有WDF的酸奶的表观粘度曲线均高于D组，说明WDF能够提高酸奶的表观粘度。这可能是一开始WDF颗粒和蛋白质聚集体之间形成了超级聚集体，但随着剪切率的进一步增加导致超级聚集体分解成更小的聚集体，从而导致粘度的降低与单益生菌(F组和G组)相比，添加双元益生菌(H组)增加了酸奶的粘度。这可能是由于双元益生菌的产酸能力较高，而且WDF中的高甲氧基果胶在酸性pH值下可以形成凝胶，从而增加酸奶的表观粘度。
储能模量G'代表样品在冲击过程中变形产生的应力，是对样品弹性性能的测量。损失模量G”代表样品在变形周期中损失的那部分能量，用于测量样品的粘性特性。G'>G”表示酸奶样品表现出明显的胶体状粘弹性行为(图1-H)。小的G'表示酸奶的弹性较小，凝胶结构比较松散。这些结果都表明，酸奶的弹性行为高于粘性行为。加入WDF和双元益生菌后，大大改善了酸奶的弹性行为。除了双元益生菌的产酸能力增强外，WDF中的多糖能够与蛋白质相互作用，产生食品级的皮克林乳液。
S5.感官评估
酸奶的结构和成分对风味的影响一直是许多文章的焦点。产品的结构可以影响芳香化合物向产品顶部空间的运输。如图1-I所示，D组酸奶的颜色得分最高，呈奶油状且有光泽，而所有添加了WDF的酸奶都呈现浅红色。这主要是由于枸杞膳食纤维中残留的枸杞色素造成的。枸杞色素主要包括类胡萝卜素和叶黄素，许多研究证明，它们可以提高人体的免疫功能，预防和抑制肿瘤，预防动脉硬化。
与对照组D(16.06)相比，E组的酸奶状态得分明显更高(19.57)。这与纹理和流变学结果一致，表明WDF能够改善酸奶的纹理。与F组(21.47)和G组(20.31)相比，H组酸奶的状态得分明显更高，没有乳清沉淀，质地均匀。添加WDF也明显影响了酸奶的气味得分，添加WDF的酸奶具有典型的酸奶香气以及枸杞的水果香气。H组酸奶具有更浓郁的浆果果香和酸奶香气，这可能是由于发酵过程中双元益生菌生长较快，增加了对乳糖、乳脂肪和蛋白质的利用，产生了相对较高浓度的风味物质，如丙酮、乙醛、双乙酰和乙酸。
关于味道，与D组(19.36)相比，添加了WDF的E组(20.73)得分更高，其味道细腻、有弹性、略带甜味。这可能是因为添加WDF导致酸奶的酸度降低，而含有WDF的酸奶的香气和质地更令人愉悦，这影响了对味道的评价。单益生菌组F(21.17)、G(19.63)与E组相比没有明显差异，这可能是因为膳食纤维和WDF的味道之间的相互作用高度依赖于受试者，当其他指标如酸度和气味也被测量时，味道提升的效果就会减弱。双益生菌组D的口感得分最高(22.41)，酸奶细腻、甜度适中、酸味十足，容易接受。
S6.非挥发性香味物质
从以上结果可以看出，添加WDF和双元益生菌对酸奶的品质有明显的影响。因此，代谢组学结合HPLC-MS进行了研究，以阐明其机制，并研究对酸奶非挥发性风味物质的影响。在图2-A PCA得分图中，三个平行样品被聚在一起，表明实验重复性和数据可靠性非常好。五组酸奶之间的远距离表明，它们之间的非挥发性代谢物差异很大。五组酸奶沿着PCA1(16.1％)和PCA2(13.9％)严格分开。
图2-B是一个热图，用于区分五组酸奶的代谢物。P值≤0.05，VIP≥1，折合变化≥1.5或≤0.667的变量被选为潜在的生物标志物。与对照组D(只含启动剂)相比，E组(添加了WDF)有56种不同的代谢物，其中40种上调，16种下调。其中，D-果糖、β-D-葡萄糖、6-乙酰-D-葡萄糖和1-酮糖分别上调了50.01、8.06、5.26和1.72倍。低聚果糖，也被称为果寡糖，是一种菊粉型低聚糖，由D-果糖通过β-(2→1)键结合，末端连接一个D-葡萄糖分子形成其分子结构，可以表示为GFn(G，葡萄糖；F，果糖；n，聚合度)。1-酮糖是一种果糖低聚物，聚合度为3(GF3)。研究表明，1-酮糖不能被消化，但可以被结肠微生物群发酵，产生短链脂肪酸，并促进有益的肠道微生物如双歧杆菌的增殖。酪蛋白胶束之间果糖分子的存在可能会减少交联。此外，酸奶中的多糖可以作为增稠剂。这可能是酸奶的粘性增强的原因。相比之下，苯乙醛酸、4-吡哆醇酸和石碳酸分别下调了0.43、0.46和0.27倍，这可能是3.2节中添加WDF后酸奶的TA下降的原因。通过分析不同代谢物的代谢途径，发现有20条途径受到WDF添加的高度影响。D-果糖、β-D-葡萄糖和6-乙酰-D-葡萄糖在不同环境下的微生物代谢中含量丰富(图3-A)。苯乙酮酸、4-吡哆醇和石胆酸含量的下降主要是由于添加WDF对苯丙氨酸代谢和不同环境下微生物代谢的影响。
与E组相比，F组(含L.plantarum 53)共鉴定了27种不同的代谢物，其中13种被明显下调，14种被明显上调。麦角钙化醇、次黄嘌呤、香豆素、棕榈酸和瓦卡尼克酸分别上调了3.70、1.67、3.12、1.69和1.96倍。麦角胺醇可以促进钙的吸收。次黄嘌呤可帮助铁的吸收和智力发育。肝脏中凝血因子的合成可被香豆素抑制。酸奶的pH值下降可能是由于棕榈酸和瓦卡尼克酸的增加。在20条不同的代谢途径中，脂肪酸的降解被认为是L.plantarum 53生产棕榈酸的代谢途径(图3-B)。与E组相比，在G组(含有L.casei 56)中筛选出31个差异性代谢物。其中，21个被明显上调，10个被明显下调。L-2,4-二氨基丁酸、麦角甾醇、L-高丝氨酸、棕榈酸和肉豆蔻酸分别上调了7.14、3.33、2.43、1.51和1.81倍。L-高丝氨酸是苏氨酸、蛋氨酸和赖氨酸生物合成的一个重要中间体。与F组相比，相同的代谢物麦芽糖醇和棕榈酸的含量差异与之前3.2-3.3节中的结果一致，即在WDF酸奶中，L.casei 56的生长和产酸能力比L.plantarum 53低。在图3-C中，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢和脂肪酸降解途径的显著增加表明，L.casei 56拥有强大的蛋白质分解和脂肪酸代谢能力，这可能是L.casei 56的添加导致酸奶pH值下降和凝胶强度增加的原因。
与F组相比，H组(含双元益生菌)筛选出17种差异性代谢物，其中7种明显上调，10种明显下调。酪醇、胆碱、2',4'-二羟基苯乙酮、衣康酸和9(S)-HPOT分别上调了9.09、3.03、3.45、1.56和3.12倍。2',4'-二羟基苯乙酮是制备抗心绞痛药物的一个重要中间体。胆碱是所有生物膜的组成部分，还能促进大脑发育和改善记忆。酪醇作为一种抗氧化剂，具有保护细胞免受氧化损伤的能力。结果表明，双元益生菌可以促进L.casei 56生产胆碱和酪醇，从而增加对WDF的抵抗力，促进机体的生长。衣康酸和9(S)-HPOT含量的明显增加表明，双元益生菌发酵可以促进L.casei56的产酸，这可能是双元益生菌酸奶的pH值和凝胶强度增加的原因。通过比较F组和H组，确定了20条具有高途径影响的代谢途径(图3-D)。其中，酪氨酸代谢可能被认为是双元益生菌促进L.casei56生长的主要原因。这与以前的报告一致，即氨基酸，如精氨酸、亮氨酸、色氨酸和酪氨酸，对LAB的生长有积极作用。
与G组相比，H组筛选出18种差异性代谢物，其中4种上调，14种下调。其中，Tyrosol和Dehydroepiandrosterone分别上调了8.33和2.63倍。脱氢表雄酮具有预防肥胖、抗糖尿病和抗癌的作用，目前，主要的生产方法是化学合成和天然植物提取物，而从微生物中提取仍处于设想阶段。本发明证明了通过用LAB发酵生产脱氢表雄酮是可能的。此外，谷氨酸，赖氨酸和色氨酸分解代谢途径中的一个中间物，被下调了0.03倍，其高消耗量表明，双元益生菌的发酵可以促进L.plantarum 53的生长。双元益生菌发酵的酸奶中L.plantarum 53的数量确实明显上移。通过比较G组和H组，确定了具有高途径影响的代谢途径(图3-E)。脱氢表雄酮和戊二酸的差异化代谢是由不同环境中的微生物代谢途径引起的。然而，没有发现酪醇的差异化代谢途径。结果表明，WDF酸奶中的双元益生菌可以促进L.casei 56而不是L.plantarum 53产生Tyrosol，以增强对环境的抵抗力，从而提高双元益生菌的生长。
S7.挥发性香味物质
在感官评价中，添加二元益生菌和WDF对酸奶的风味有明显影响。此外，研究表明，益生菌对酸奶中的挥发性风味有积极影响。因此，为了研究这种影响的机制，我们采用HS-SPME-GC-MS来测定五组酸奶中的挥发性风味物质。如图4-A所示，在D、E、F、G和H组中，同组之间的距离较小，这表明样品的重现性较好。D组和E组之间的距离很近，说明在没有添加益生菌的情况下，添加WDF对酸奶挥发性风味物质没有明显影响。相反，F、G、H组与D、E组之间的距离很远，说明添加单一和二元益生菌对酸奶的挥发性风味有明显影响。
以不同菌种组合条件下代谢物的相对值作为代谢水平，进行了代谢物层次聚类分析，结果见图4-(2)。在酸奶中发现了46种挥发性风味物质，包括羰基化合物、醇、醛、酸、芳香族化合物和酮。酸奶中的大多数风味化合物是由牛奶脂肪的脂肪分解以及乳糖和柠檬酸盐的微生物转化产生的。在D组和E组之间发现了7种不同的挥发性风味物质(图5-(1))。其中，2-庚酮和正己烷，3-乙基-明显上调，而己酸、辛酸、环三硅氧烷，六甲基-、1-戊醇和正己烷，2,3,5-三甲基-明显下调。结果表明，添加WDF对酸奶的挥发性风味化合物的影响较小，这与感官评价中两种酸奶的气味评分一致。
比较E组和F组(含L.plantarum 53)，有9种不同的挥发性风味化合物，其中8种明显上调，一种明显下调(图5-(2))。E组和G组(含L.casei 56)有10个不同的挥发性风味化合物，其中8个明显上调，2个明显下调(图5-(3))。其中，辛酸具有山羊味、肥皂味和水果味，2-庚酮具有梨子般的果味，苯甲酸是一种芳香族有机化合物，也是最简单的芳香族酸，具有安息香般的气味，己酸有一种类似奶酪的味道，当稀释时，它发出椰子的香气和略带甜味(Fan等人，2021)，1-己醇有一种果香味，丁酸有明显的奶酪和汗味，饱和脂肪酸产生了大量的短链脂肪酸，极大地促进了酸奶的风味。结果表明，益生菌种类或种群的动态变化可能影响挥发性风味化合物的形成，并导致风味的明显差异。
与单益生菌组F和G相比，双元益生菌组H导致环戊硅氧烷、十甲基、吡啶、2,3,4,5-四氢-和Prenol的明显上调(图5-(4)和5-(5))。Prenol是一种多环芳香烃，稀释后有令人愉快的水果香味，经常用于合成药物和香料。环戊硅氧烷，十甲基-是一种无味的环状硅氧烷，安全而环保，已被广泛用于健康和美容产品，如洗发水。吡啶，2,3,4,5-四氢-有一种新鲜的面包香味，这可能是本发明的双重益生菌发酵的WDF酸奶在感官评价中获得高气味分数的原因。
2％(w/v)的WDF明显改善了酸奶的滞后性，流变学结果显示，WDF改善了酸奶的表观粘度和弹性行为。HPLC-MS结果表明，这主要是由于WDF中的D-果糖、β-D-葡萄糖、6-乙酰-D-葡萄糖和1-酮糖的影响，由于枸杞子的存在，加入WDF使酸奶的外观呈浅红色，但HS-SPME-GC-MS结果表明，它对酸奶的挥发性风味物质没有明显影响，与单一益生菌相比，二元益生菌更适合发酵WDF酸奶，使其具有更高的活菌数，更低的pH值，并改善了硬度、附着力和粘性。代谢组学结果表明，二元益生菌可以通过酪氨酸代谢途径促进L.casei 56产生酪醇，从而增强L.casei 56和L.plantarum 53对环境的抵抗力，促进生长。HS-SPME-GC-MS结果表明，吡啶、2,3,4,5-四氢-和丙醇可能是二元益生菌WDF酸奶感官评价中的高气味得分的原因。综上所述，二元益生菌和WDF发酵的凝固型酸奶拥有更好的稳定性、更多的益生菌含量、明确且怡人的风味和潜在的益生功能，具有很大的应用价值。
与现有技术相比，与现有技术相比，本发明开发了一款风味独特、高益生菌含量且具有潜在益生特性的酸奶，提供了枸杞渣下脚料的应用方向，通过双元益生菌发酵解决了WDF中枸杞多糖等抑菌物质残留导致酸奶中活菌数低的问题，建立了双元益生菌和WDF发酵的凝固型酸奶的风味指纹图谱，此外确定了双元益生菌可以通过酪氨酸代谢途径促进L.casei CGMCC NO.15956产生酪醇从而提高酸奶中乳酸菌含量。通过添加双元益生菌和WDF解决了酸奶乳清析出、风味单一的问题。本发明通过筛选出的L.caseiCGMCC NO.15956和L.plantarumCGMCC NO.15953(保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为1.5956和1.5953)分别具有良好的富硒能力和高超氧化物歧化酶产量。研究表明，富硒酸奶可以缓解D-半乳糖引起的小鼠认知功能障碍，而超氧化物歧化酶具有防抗衰老等功能。因此，使用双元益生菌(L.casei56和L.plantarum53)来发酵WDF酸奶，以增加乳酸菌的存活率并改善其风味。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：选取植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌以及保加利亚乳杆菌涂布于MRS平板上，静置培养后活化，将培养后的嗜热链球菌在M17肉汤中于42℃培养16h，将培养后的保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌分别在MRS肉汤中于37℃培养24h，将培养后的所述植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌以及保加利亚乳杆菌的培养液分别离心并洗涤后用无菌盐水回收，回收得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌的细菌汁液即为发酵酸奶的种子溶液，回收得到的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的细菌汁液即为发酵酸奶的启动剂；
将全脂奶粉与蔗糖在60-70℃下溶解在无菌水中，并均质处理，得到复原乳；
S2：将枸杞膳食纤维加入至所述步骤S1的复原乳中，混合后进行灭菌处理，灭菌后等待复原乳冷却；
S3：将步骤S1中得到的种子溶液和启动剂依次接种至所述步骤S2处理后的复原乳中，发酵后冷却保存得到由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶。
2.根据权利要求1所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述植物乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.15953，命名为L.plantarum53；所述干酪乳杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.15956，命名为L.casei 56。
3.根据权利要求1所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述离心并洗涤的条件为：用无菌盐水将细菌浓度调整到1×109CFU/mL，然后在4℃以5000×g的离心率离心5分钟，洗涤三次；所述均质处理的条件为：将溶液在17MPa下均质5分钟。
4.根据权利要求1所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中，所述全脂奶粉、所述蔗糖与所述无菌水的体积比为：(10-12):(6-7):(81-84)。
5.根据权利要求1所述由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为(0.5-5)：(95-99.5)。
6.根据权利要求5所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述枸杞膳食纤维与所述复原乳的体积比为2:98。
7.根据权利要求1所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，所述灭菌处理的条件为：将枸杞膳食纤维与复原乳的混合液在95℃下灭菌10分钟，所述冷却的条件为：将复原乳置于42℃的水浴环境中冷却。
8.根据权利要求1所述的由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述种子溶液的浓度为6.5×106CFU/mL；所述发酵的条件为：将接种种子溶液后的复原乳在42℃的培养箱中发酵6小时；所述冷却保存的条件为：将发酵后的复原乳在4℃的环境下保存12小时。
9.一种由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述制备方法制备获得。
10.一种根据权利要求9所述由双元益生菌和枸杞膳食纤维发酵的凝固型酸奶的风味物质指纹图谱的构建，其特征在于，包括以下步骤：
A：非挥发性风味物质指纹图谱的构建：将100毫克所述风味酸奶加入至2毫升无菌离心管中，在试管中加入200μL甲醇和甲基叔丁基醚，并混合，将混合后的样品在4℃下以12000rpm的速度离心10分钟，然后通过0.22微米的膜，将过滤后的样品准备用HPLC-MS仪器进行检测，得到非挥发性风味物质指纹图谱；
B：可挥发性风味物质指纹图谱的构建：将5克所述风味酸奶置于萃取瓶中，在55℃、350rpm下萃取1小时；设定气相色谱仪的载气为He，流速为1.0mL/min，入口温度为250℃，起始温度为35℃并保持5分钟，然后以5℃/分钟的速度升至140℃并保持2分钟，最后升至250℃，速度为10℃/分钟，保持3分钟，得到可挥发性风味物质指纹图谱。
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