CN115991938B - 一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用，通过采用异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇对聚二氯磷腈进行取代，其中，异亮氨酸乙酯在室温范围内不会聚集，但是随温度升高，异亮氨酸乙酯会发生聚集反应，表现为不溶于水的凝胶状态，而这种随温度变化而产生的物理相变是可逆的，当温度下降后，凝胶再次变回溶液状态，实现流体/凝胶可逆性相变；侧基功能团可以起到调控降解时间的作用，并且也可以通过电荷吸引与带正电性、负电性或中性的药物结合，以满足生物体内递送药物或作为填充物的要求；采用本发明的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶所采用的单体材料均为生物安全性高的材料，降解产物可被生物体吸收或排泄，安全无毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物相容性材料领域，尤其涉及一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
目前，生物医学材料已得到快速充分的研究与开发，比如在关节支架、心脏起搏器、人工脏器、组织再生以及药物递送等领域都有重大突破。但是，随着医学技术的不断进步，对生物医学材料要求也更加严格，尤其是对可生物降解、材料与生物组织间的相互作用、药物释放特性以及材料的物理化学与力学性能等。在已有的生物医学材料聚α-羟基酸、聚酸酐、聚邻苯脂、聚氨基酸等当中，聚磷腈(PPZ)聚合物由于其可嫁接材料的多样性，已成为一种发展迅速的新型生物医学材料。然而，现阶段没有真正意义实现PPZ规模化生产的企业和产品。
H.R.Allcock通过将不同的支链物质与聚二氯磷腈的逐步亲核反应嫁接，可以形成不同性质的PPZ聚合物。使用亲水的甲氧基聚乙二醇(MPEG)作为亲核取代基团，与聚二氯磷腈通过逐步亲核取代反应，然后与四L－赖氨酸进行枝化反应，从而制得具有阳离子基团的PPZ用于生长因子的释放。MengDeng等人利用乙基甘氨酸和甲氧基乙氧基乙氧基合成的PPZ与聚(乳酸-共羟基)PLAGA混合，开发了一种具有仿生生物活性的共混物并应用于骨组织工程。Greish等人制备了一种由无钙的羟基磷灰石与丙氨酸乙酯聚磷腈组成的可生物降解复合材料，并证明其在骨再生方面的潜在应用。Qing-Song Zhang等人制备了一种带有苯胺齐聚物和甘氨酸乙酯侧基的具有导电性和生物降解性的PPZ，并研究了其在的神经再生方面潜在的应用。然而，目前还缺乏具有温度敏感而发生流体/凝胶可逆性相变且生物相容性的PPZ水凝胶产品。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用，旨在解决现有技术缺乏具有温度敏感而发生流体/凝胶可逆性相变且生物相容性的PPZ水凝胶产品的问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，包括步骤：
提供六氯环磷腈、催化剂、异亮氨酸乙酯盐酸盐、侧基功能团反应物、聚乙二醇单甲醚和四氢呋喃；
将六氯环磷腈与催化剂混合，加热，反应得到聚二氯磷腈；
在惰性气体保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，再加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，发生亲核取代反应得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈；
将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，然后与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，发生亲核取代反应得到侧基功能团取代的聚二氯磷腈；
对所述聚乙二醇单甲醚进行氨基化处理，得到氨基聚乙二醇，并将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，发生取代反应得到所述聚磷腈聚合物溶液；
对所述聚磷腈聚合物溶液进行纯化处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述将六氯环磷腈与催化剂混合，加热，反应得到聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
将六氯环磷腈与催化剂混合，加热至290～310℃，进行开环反应得到聚二氯磷腈；
其中，所述催化剂为三氯化铝，所述三氯化铝占所述六氯环磷腈的质量百分比为4～5％；所述开环反应的反应时间为6～7h，反应条件为隔绝氧气和水分的封闭环境。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，再加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，发生亲核取代反应得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
在惰性气体保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，得到聚二氯磷腈溶液；
向所述聚二氯磷腈溶液中加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈；其中，所述缚酸剂为三乙胺，所述惰性气体为氮气或氦气。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，然后与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，发生亲核取代反应得到侧基功能团取代的聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，得到第一溶液；
将所述第一溶液与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈；
其中，所述侧基功能团反应物选自酸酐、聚醚酰亚胺和多肽中的一种。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述对所述聚乙二醇单甲醚进行氨基化处理，得到氨基聚乙二醇的步骤，包括步骤：
提供三乙胺；
将所述聚乙二醇单甲醚溶解于三氯甲烷中，并降温至0℃，再加入甲苯磺酰氯和三乙胺，反应24h，过滤，蒸发，得到第一反应物；
将所述第一反应物溶解于乙腈中，并加入叠氮化钠，升温至80℃搅拌24h，过滤，蒸发，得到第二反应物；
将所述第二反应物溶解于四氢呋喃中，加入苯骈三氮唑，加入水，反应12h，蒸发，沉淀，过滤，得到所述氨基聚乙二醇。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，发生取代反应得到所述聚磷腈聚合物溶液的步骤，包括步骤：
在惰性气体保护下，将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述聚磷腈聚合物溶液。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述对所述聚磷腈聚合物溶液进行纯化处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶的步骤，包括步骤：
对所述聚磷腈聚合物溶液进行过滤，再采用四氢呋喃进行浸提处理；
将浸提处理后的聚磷腈聚合物溶液加入正己烷中，过滤，蒸发，得到粗提聚磷腈聚合物；
对所述粗提聚磷腈聚合物采用甲醇和水溶液进行透析处理，过滤，得到精提聚磷腈聚合物水醇溶液；
对所述精提聚磷腈聚合物水醇溶液进行干燥处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶。
所述的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，其中，所述聚磷腈聚合物水凝胶由二氯磷腈骨架和侧基组成，其中，所述侧基包括异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇，所述二氯磷腈骨架与所述侧基的摩尔比为1:2，在所述侧基中，所述异亮氨酸乙酯、所述侧基功能团和所述氨基聚乙二醇的摩尔比为(1.35～1.43):0.3：(0.27～0.35)。
一种聚磷腈聚合物水凝胶，其中，采用如本发明上述方案所述的方法制得。
一种如本发明上述方案所述的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶用作药物递送的载体、组织再生物和术后填充物的应用。
有益效果：本发明公开了一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用，以六氯环磷腈为原料，采用高温开环聚合法合成聚二氯磷腈，通过采用异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇对聚二氯磷腈中活跃的氨基电子进行亲核取代制备出可稳定存在的聚磷腈以实现聚磷腈聚合物在生物医疗以及优化装载药物的应用，其中，异亮氨酸乙酯在室温范围(4～25℃)内不会聚集，但是随温度升高，异亮氨酸乙酯会发生聚集反应，表现为不溶于水的凝胶状态，而这种随温度变化而产生的物理相变是可逆的，当温度下降后，凝胶再次变回溶液状态，实现流体/凝胶可逆性相变从而使得所述聚磷腈聚合物水凝胶在室温下为流动液体方便注射，在体温下固化为水凝胶，释放药物，并且本发明制得的聚磷腈聚合物水凝胶相变过程非常迅速，从水溶液到凝胶状态仅需要5～10秒，从凝胶到水溶液的状态相对耗时，需要15～25秒；侧基功能团可以起到调控降解时间的作用，并且也可以通过电荷吸引与带正电性、负电性或中性的药物结合，以满足生物体内递送不同药物或作为填充物的要求；采用本发明的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶所采用的单体材料均为生物安全性高的材料，理论降解产物为氨气、水和磷酸盐，可被生物体吸收或排泄，安全无毒性。
附图说明
图1为本发明提供的聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法较佳实施例的流程图。
图2为本发明实施例1和实施例2中DP-PPZ和PEI-PPZ的1H NMR图谱。
图3为本发明实施例1和实施例2中DP-PPZ和PEI-PPZ粘度值曲线图。
图4为本发明实施例1制得的DP-PPZ与PLGA的生物相容性小鼠测试实验结果图。
图5为本发明实施例1制得的DP-PPZ装载疏水性药物后随温度变化状态图。
具体实施方式
本发明提供一种聚磷腈聚合物水凝胶及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
目前，生物医学材料已得到快速充分的研究与开发，比如在关节支架、心脏起搏器、人工脏器、组织再生以及药物递送等领域都有重大突破。但是，随着医学技术的不断进步，对生物医学材料要求也更加严格，尤其是对可生物降解、材料与生物组织间的相互作用、药物释放特性以及材料的物理化学与力学性能等。在已有的生物医学材料聚α-羟基酸、聚酸酐、聚邻苯脂、聚氨基酸等当中，聚磷腈(PPZ)聚合物由于其可嫁接材料的多样性，已成为一种发展迅速的新型生物医学材料。然而，目前还缺乏具有温度敏感而发生流体/凝胶可逆性相变且生物相容性的PPZ水凝胶产品。
基于此，本发明提供了一种聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，参见图1，其包括步骤：
S10、提供六氯环磷腈、催化剂、异亮氨酸乙酯盐酸盐、侧基功能团反应物、聚乙二醇单甲醚和四氢呋喃；
S20、将六氯环磷腈与催化剂混合，加热，反应得到聚二氯磷腈；
S30、在惰性气体保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，再加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，发生亲核取代反应得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈；
S40、将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，然后与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，发生亲核取代反应得到侧基功能团取代的聚二氯磷腈；
S50、对所述聚乙二醇单甲醚进行氨基化处理，得到氨基聚乙二醇，并将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，发生取代反应得到所述聚磷腈聚合物溶液；
S60、对所述聚磷腈聚合物溶液进行纯化处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶。
具体地，本发明以六氯环磷腈为原料，采用高温开环聚合法合成聚二氯磷腈，通过采用异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇对聚二氯磷腈中活跃的氨基电子进行亲核取代制备出可稳定存在的聚磷腈以实现聚磷腈聚合物在生物医疗以及优化装载药物的应用，其中，异亮氨酸乙酯在室温范围(4～25℃)内不会聚集，但是随温度升高，异亮氨酸乙酯会发生聚集反应，表现为不溶于水的凝胶状态，而这种随温度变化而产生的物理相变是可逆的，当温度下降后，凝胶再次变回溶液状态，实现流体/凝胶可逆性相变，从而使得所述聚磷腈聚合物水凝胶在室温下为流动液体方便注射，在体温下固化为水凝胶，释放药物，并且本发明制得的聚磷腈聚合物水凝胶相变过程非常迅速，从水溶液到凝胶状态仅需要5～10秒，从凝胶到水溶液的状态相对耗时，需要15～25秒；侧基功能团可以起到调控降解时间的作用，使降解时间为几天至几个月不等，并且也可以通过电荷吸引与带正电性、负电性或中性的药物结合，以满足生物体内递送不同药物或作为填充物的要求；采用本发明的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶所采用的单体材料均为生物安全性高的材料，理论降解产物为氨气、水和磷酸盐，可被生物体吸收或排泄，安全无毒性。
在本实施例中，所述聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法过程需要保证全程在无水无氧的环境中进行，因此，当本发明中的原料均采用商业化原料时，需要对原料进行纯化处理。
具体地，为保障氮磷键的聚合和嫁接反应，需要将商业化的六氯环磷腈纯化至99.5％以上，具体的纯化处理步骤为：
在隔离手套箱中用玻璃容器装载六氯环磷腈，在氦气的保护下无空气接触，用真空油脂密封，并吸取氦气，保持真空状态，在玻璃器皿下层对所述六氯环磷腈进行加热，在所述玻璃器皿上层用干冰或冰块保持低温，保证六氯环磷腈气化后，能够凝结在低温的玻璃器皿上层中，待大量的六氯环磷腈结晶出现后，在隔绝空气的手套箱中，再次取出已经结晶纯化的六氯环磷腈；整个操作过程隔绝空气和水分。
在一些实施方式中，所述将六氯环磷腈与催化剂混合，加热，反应得到聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
将六氯环磷腈与催化剂混合，加热至290～310℃，开环反应得到聚二氯磷腈【-PCl2＝N-】n；
其中，所述催化剂为三氯化铝，所述三氯化铝占所述六氯环磷腈的质量百分比为4～5％；所述开环反应的反应时间为6～7h，反应条件为隔绝氧气和水分的封闭环境。
具体地，上述反应为六氯环磷腈的开环反应，其反应条件为隔绝氧气和水分的密封环境，可在真空密封的玻璃安瓶中完成反应，并且为了保障产物的效果，所采用的三氯化铝的纯度需要保证在99.5％及以上，本实施例中采用的是纯度为99.5％的三氯化铝，整体的反应时间为6～7h；反应结束后，在手套箱中的氮气保护下打开玻璃安瓶，转移并称量粘稠状的聚二氯磷腈至预先准备好的圆底玻璃反应釜中，并用胶塞封口，待用。
所述开环反应的具体反应式如式(1)：
同样地，在本实施例中，若采用的四氢呋喃为商业化的四氢呋喃，则需要对商业化的四氢呋喃进行纯化处理，具体的纯化处理步骤为：
在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述商业化的四氢呋喃中加入固体钠以去除所述商业化的四氢呋喃中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述商业化的四氢呋喃的含水量达到0.1％。优选地，为了能够增加反应面积，在加入固体钠前可以将所述固体钠碾压成片状。为了进一步提高所述四氢呋喃的脱水效果，可以对所述含水量为0.1％的四氢呋喃使用分子筛进行二次脱水，具体地，可以将所述含水量为0.1％的四氢呋喃加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的四氢呋喃，即得到纯化的四氢呋喃。在本实施例中，各步骤采用的均为含水量0.08％的四氢呋喃。
在一些实施方式中，所述将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，再加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，发生亲核取代反应得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
在惰性气体保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述四氢呋喃中，得到聚二氯磷腈溶液；
向所述聚二氯磷腈溶液中加入异亮氨酸乙酯盐酸盐和缚酸剂，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈；其中，所述缚酸剂为三乙胺，所述惰性气体为氮气或氦气。
具体地，通过采用异亮氨酸乙酯对所述聚二氯磷腈进行取代，可以赋予聚二氯磷腈随温度相变的特性，这是因为异亮氨酸乙酯在室温范围(4～25℃)内不会聚集，但是随温度升高，异亮氨酸乙酯会发生聚集反应，表现为不溶于水的凝胶状态，而这种随温度变化而产生的物理相变是可逆的，当温度下降后，凝胶再次变回溶液状态，从而实现制得的聚磷腈聚合物具有流体/凝胶可逆性相变特性，并且由于所述异亮氨酸乙酯具有疏水特性，作为所述聚磷腈聚合物水凝胶的疏水侧基时可以使得最终制得的聚磷腈聚合物具有亲油特性；进一步地，采用异亮氨酸乙酯作为侧基可以使最终制得的水凝胶在水解的时候产生的是由磷酸盐、氨和相应的侧基组成的无毒缓冲降解产物；为了使异亮氨酸乙酯的取代反应均匀发生，本实施例中采用的是从低温到高温的阶梯反应，从而控制异亮氨酸乙酯添加的速度和均匀性，从而提高聚磷腈聚合物的温敏性，若初始反应温度过高，会导致聚磷腈聚合物的相变温度变高，因此本实施例中的初始反应温度设定为-78℃；在一些实施方式中，所述异亮氨酸乙酯盐酸盐所加入的摩尔量为所述聚二氯磷腈溶液中聚二氯磷腈摩尔量的1.35～1.43倍，从而实现异亮氨酸乙酯的完全取代，采用三乙胺作为缚酸剂可以实现对于异亮氨酸乙酯盐酸盐的中和。在一些实施方式中，在反应结束后，需要对所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈溶液进行3～5次过滤以除去多余的异亮氨酸乙酯盐酸盐。
具体地，所述得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈的亲核取代反应的具体反应式如式(2)：
由于本实施例的制备方法需要在无水无氧的环境中进行，当所述三乙胺为商业化的三乙胺时，还需要对所述商业化的三乙胺进行纯化处理，具体地纯化处理步骤为：
在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述商业化的三乙胺中加入氢氧化钾以去除所述商业化的三乙胺中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述商业化的三乙胺的含水量达到0.1％。为了进一步提高所述三乙胺的脱水效果，可以对所述含水量0.1％的三乙胺使用分子筛进行二次脱水，具体地，可以将所述含水量0.1％的三乙胺加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的三乙胺，即得到纯化的三乙胺。在本实施例中，各步骤采用的均为含水量0.08％的三乙胺。
在一些实施方式中，所述将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，然后与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，发生亲核取代反应得到侧基功能团取代的聚二氯磷腈的步骤，包括步骤：
将所述侧基功能团反应物加入到所述四氢呋喃中，得到第一溶液；
将所述第一溶液与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈；
其中，所述侧基功能团反应物选自酸酐、聚醚酰亚胺和多肽中的一种。
具体地，通过向聚二氯磷腈中引入侧基功能团可以调控其降解时间为几天至几个月不等，从而满足生物体内递送不同药物或作为术后填充物的要求，同时侧基功能团可以带电荷，如需要带负电荷的侧基功能团可通过加入酸酐进行取代实现，需要带正电荷的侧基功能团可以通过加入聚醚酰亚胺(PEI)进行取代实现，需要不带电的中性功能团可以通过加入多肽进行取代实现，从而可以通过电荷吸引与带正电性、负电性或中性的药物结合；优选地，所述酸酐为琥珀酸酐，所述多肽为水解双肽(DP)，所述药物可以包括但不限于不同分子量的化学药物、蛋白质、生长因子、病毒、细菌和细胞等；在一些实施方式中，所述侧基功能团反应物所加入的摩尔量为所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈的摩尔量的0.3倍，从而实现侧基功能团的完全取代。
具体地，所述得到侧基功能团取代的聚二氯磷腈的亲核取代反应的具体反应式如式(3)：
在一些实施方式中，所述对所述聚乙二醇单甲醚进行氨基化处理，得到氨基聚乙二醇的步骤，包括步骤：
提供三乙胺；
将所述聚乙二醇单甲醚溶解于三氯甲烷中，并降温至0℃，再加入甲苯磺酰氯和三乙胺，反应24h，过滤，蒸发，得到第一反应物；
将所述第一反应物溶解于乙腈中，并加入叠氮化钠，升温至80℃搅拌24h，过滤，蒸发，得到第二反应物；
将所述第二反应物溶解于四氢呋喃中，加入苯骈三氮唑，加入水，反应12h，蒸发，沉淀，过滤，得到所述氨基聚乙二醇。
具体地，所述聚乙二醇单甲醚的分子量为500～1500道尔顿，分子量小的聚乙二醇具有一定的毒性，因此，本实施例中选用的聚乙二醇单甲醚最低分子量为500，分子量越大的聚乙二醇的亲水性越强，相应地所需要添加的比例也会减少。在一些实施方式中，所述甲苯磺酰氯的添加量为所述聚乙二醇单甲醚的质量的2倍，所述叠氮化钠的添加量为所述第一反应物的质量的2倍，所述苯骈三氮唑的添加量为所述第二反应物的质量的1.5倍；最终得到的氨基聚乙二醇置于-20℃保存待用。
在一些实施方式中，所述将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，发生取代反应得到所述聚磷腈聚合物溶液的步骤，包括步骤：
在惰性气体保护下，将所述氨基聚乙二醇与所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述聚磷腈聚合物溶液。
具体地，所述氨基聚乙二醇作为所述聚磷腈聚合物水凝胶的亲水侧基，用于提高所制得的聚磷腈聚合物的亲水性，为保障取代反应能够完全进行，所述氨基聚乙二醇所加入的摩尔量为所述侧基功能团取代的聚二氯磷腈的摩尔量的2倍。
在一些实施方式中，所述对所述聚磷腈聚合物溶液进行纯化处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶的步骤，包括步骤：
对所述聚磷腈聚合物溶液进行过滤，再采用四氢呋喃进行浸提处理；
将浸提处理后的聚磷腈聚合物溶液加入正己烷中，过滤，蒸发，得到粗提聚磷腈聚合物；
对所述粗提聚磷腈聚合物采用甲醇和水溶液进行透析处理，过滤，得到精提聚磷腈聚合物水醇溶液；
对所述精提聚磷腈聚合物水醇溶液进行干燥处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶。
具体地，在得到聚磷腈聚合物溶液后，需要先通过3～5次的过滤处理从而除去反应中异亮氨酸乙酯盐酸盐产生的盐分，然后采用四氢呋喃浸提全部的聚磷腈聚合物，由于得到的聚磷腈聚合物同时含有异亮氨酸乙酯作为疏水侧基和氨基聚乙二醇作为亲水侧基，导致所述聚磷腈聚合物具有亲水亲油的两性特点，因此需要分别进行纯化去除其中的亲油性杂质和亲水性杂质，为了去除聚磷腈聚合物中的脂溶性杂质，可以将浸提处理后的聚磷腈聚合物溶液加入正己烷中搅拌并沉淀24h，由于聚磷腈聚合物不溶于正己烷中，因此可以在过滤以后对得到的沉淀物进行旋转蒸发处理，去除多余的正己烷，从而得到粗提聚磷腈聚合物；随后为了去除聚磷腈聚合物中的水溶性杂质，可以对所述粗提聚磷腈聚合物分别采用甲醇和水溶液进行透析处理，经MW＝3500Da的透析袋水相和甲醇相透析3天后，进行过滤，去除可能的大分子杂质，即可得到精提聚磷腈聚合物水醇溶液，然后利用真空和冷冻干燥处理即可得到提纯的聚磷腈聚合物水凝胶，所述聚磷腈聚合物水凝胶成浅黄色粘稠状，储存在密闭容器中，冷冻保存待用。
具体地，所述得到聚磷腈聚合物水凝胶的具体反应式如式(4)：
在一些实施方式中，所述聚磷腈聚合物水凝胶由二氯磷腈骨架和侧基组成，其中，所述侧基包括异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇，所述二氯磷腈骨架与所述侧基的摩尔比为1:2，在所述侧基中，所述异亮氨酸乙酯、所述侧基功能团和所述氨基聚乙二醇的摩尔比为(1.35～1.43):0.3：(0.27～0.35)。
具体地，由于疏水基和亲水基侧基比例的平衡与聚磷腈聚合物水凝胶相变温度密切相关，也就是说，聚磷腈聚合物水凝胶温度敏感性质是由疏水基团和亲水基团的平衡决定的，在低温下疏水基团的能量不足，水凝胶体系以水分子和亲水基团的氢键为主，呈流动液体状，当温度升高，水凝胶体系中的疏水基发生聚集，呈凝胶状。因此控制所述聚磷腈聚合物水凝胶中的骨架与各侧基的比例，可以实现对于聚磷腈聚合物水凝胶的相变温度的调控，当疏水基比例升高，相变温度越低；相反疏水基比例降低，相变温度升高。
本发明将异亮氨酸乙酯的取代反应、侧基功能团的取代反应和氨基聚乙二醇的取代反应分别进行，可以避免发生竞争反应，从而影响最终结合到所述聚二氯磷腈骨架上的各侧基的量，从而进一步影响所述聚磷腈聚合物水凝胶的性能。
本发明还提供一种聚磷腈聚合物水凝胶，其采用如本发明上述方案所述的方法制得。
本发明还提供一种如本发明上述方案所述的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶用作药物递送的载体、组织再生物和术后填充物的应用。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅在于说明本发明而决不限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，在无水无氧环境中进行，其包括步骤：
A10、提供六氯环磷腈、纯度为99.5％的三氯化铝、异亮氨酸乙酯盐酸盐、水解双肽、聚乙二醇单甲醚、四氢呋喃和三乙胺；其中，在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述四氢呋喃中加入固体钠以去除所述四氢呋喃中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述四氢呋喃的含水量达到0.1％，将所述含水量0.1％的四氢呋喃加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的四氢呋喃，即得到纯化的四氢呋喃；在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述三乙胺中加入氢氧化钾以去除所述三乙胺中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述三乙胺的含水量达到0.1％，将所述含水量0.1％的三乙胺加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的三乙胺，即得到纯化的三乙胺；
A20、在隔离手套箱中用玻璃容器装载六氯环磷腈，在氦气的保护下无空气接触，用真空油脂密封，并吸取氦气，保持真空状态，在玻璃器皿下层对所述六氯环磷腈进行加热，在所述玻璃器皿上层用干冰或冰块保持低温，保证六氯环磷腈气化后，能够凝结在低温的玻璃器皿上层中，待大量的六氯环磷腈结晶出现后，在隔绝空气的手套箱中，再次取出已经结晶纯化的六氯环磷腈；在真空密封的玻璃安瓶中将所述纯化的六氯环磷腈与所述六氯环磷腈的质量的4～5％的三氯化铝混合，加热至300℃，开环反应得到聚二氯磷腈；反应结束后，在手套箱中的氮气保护下打开玻璃安瓶，转移并称量粘稠状的聚二氯磷腈至预先准备好的圆底玻璃反应釜中，并用胶塞封口，待用；
A30、在氮气保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述纯化的四氢呋喃中，得到聚二氯磷腈溶液；向所述聚二氯磷腈溶液中加入聚二氯磷腈1.4倍摩尔量的异亮氨酸乙酯盐酸盐和纯化的三乙胺，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈，反应结束后对所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈过滤3次去除多余的盐分；
A40、将所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈0.3倍摩尔量的水解双肽加入到纯化的四氢呋喃中，得到第一溶液；将所述第一溶液与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到水解双肽取代的聚二氯磷腈；
A50、将聚乙二醇单甲醚溶解于三氯甲烷中，并降温至0℃，再加入2倍于聚乙二醇单甲醚质量的甲苯磺酰氯，然后加入纯化的三乙胺进行中和，反应24h，过滤反应溶液得到沉淀，对沉淀蒸发去除三氯甲烷，得到第一反应物；将所述第一反应物溶解于乙腈中，并加入2倍于第一反应物质量的叠氮化钠，升温至80℃搅拌24h，过滤反应溶液得到沉淀，对沉淀蒸发去除乙腈，得到第二反应物；将所述第二反应物溶解于纯化的四氢呋喃中，加入1.5倍于第二反应物质量的苯骈三氮唑，加入水，反应12h至没有氮气产出，蒸发去除四氢呋喃，加冷水沉淀反应过程产生的盐分，过滤后蒸发水，得到所述氨基聚乙二醇；在氮气保护下，将所述水解双肽取代的聚二氯磷腈2倍摩尔量的所述氨基聚乙二醇与所述水解双肽取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述聚磷腈聚合物溶液；
A60、对所述聚磷腈聚合物溶液进行3次过滤，再采用纯化的四氢呋喃进行浸提处理；将浸提处理后的聚磷腈聚合物溶液加入正己烷中搅拌并沉淀24h，过滤得到沉淀，对得到的沉淀物进行旋转蒸发处理，得到粗提聚磷腈聚合物；对所述粗提聚磷腈聚合物采用MW＝3500Da的透析袋在甲醇相和水相进行透析处理3天，过滤，得到精提聚磷腈聚合物水醇溶液；对所述精提聚磷腈聚合物水醇溶液进行真空和冷冻干燥处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶，记为DP-PPZ。
实施例2
制备方法同实施例1，将实施例1中的水解双肽替换为聚醚酰亚胺(PEI)，得到的聚磷腈聚合物水凝胶记为PEI-PPZ。
PPZ聚合物官能团的NMR测试
实施例1中的DP-PPZ和实施例2中的PEI-PPZ聚合物的1H NMR如图2中(a)和(b)所示，其中：
中性的DP-PPZ聚合物的1H NMR(CDCl3),δ(ppm):0.8-1.0(s,6H),1.1-1.3(b,3H),1.3-1.6(b,2H),1.6-1.9(b,1H),3.2(s,2H),3.3(s,3H),3.4-3.8(b,44H),3.9(s,2H),4.0-4.1(b,1H),4.1-4.3(b,2H)。
带正电荷的PEI-PPZ聚合物的1H NMR(CDCl3),δ(ppm):0.8-1.0(s,6H),1.1-1.3(b,3H),1.3-1.6(b,2H),1.6-1.9(b,1H)，2.5-2.8(b,2H)，2.6-2.9(b,74H)，2.8-3.3(b,2H)，3.4--3.8(b,73H),3.9(s,1H)，4.0-4.3(b,3H)。
PPZ水凝胶的表征
1)PPZ水凝胶溶液的制备
将所述DP-PPZ和所述PEI-PPZ分别加入去离子水中，在4℃搅拌12h至完全溶解，得到质量百分比为10％的透明DP-PPZ水凝胶溶液和PEI-PPZ水凝胶溶液。
2)PPZ水凝胶溶液的相变温度测试
测量所述DP-PPZ水凝胶溶液和所述PEI-PPZ水凝胶溶液随温度变化的粘度值，结果如图3所示，由图中可以看出，所述DP-PPZ水凝胶溶液和所述PEI-PPZ水凝胶溶液在室温(25℃)下的粘度均为100Pa.s，保持为流体状态，当温度升高，粘度也随之上升，当达到体温(37℃)时，DP-PPZ水凝胶溶液和PEI-PPZ水凝胶溶液的粘度足够形成凝胶，当温度继续升高后，粘度开始下降；因此，PPZ水凝胶溶液可随温度升高而发生相变。
3)PPZ水凝胶体内安全性测试
为了证明PPZ水凝胶的生物相容性，选择FDA认证的PLGA作为对照，进行生物相容性小鼠测试实验，分别于C57小鼠皮下注射PLGA和PPZ水凝胶，注射量为200μL。通过分别皮下注射DP-PPZ水凝胶和PLGA(7w/w％)，持续60天通过HE&染色观察皮肤的损伤程度。结果如图4所示，图4中(a)为在2周、4周、6周、8周后观察水凝胶的降解以及对皮下组织的影响，图4中(b)为进行相应的HE染色的效果图，由图4可以看出：与PLGA相比，PPZ水凝胶注射组无炎症反应，且在60天内可降解完全，证明PPZ水凝胶与PLGA的安全性近似。
利用PPZ水凝胶装载药物的制备方法
1)利用PPZ装载亲水性药物的制备方法
将亲水性药物分子在4℃与所述DP-PPZ水溶液混合，搅拌5分钟，直至完全混匀，即得到载药混合物，低温保存待用。
2)利用PPZ装载疏水性药物的制备方法
将DP-PPZ溶解于三氯甲烷中，再加入疏水性药物(如紫杉醇、大黄酚或磁性纳米颗粒)，搅拌至充分混匀，然后在4℃真空条件下，蒸干所述三氯甲烷，形成疏水性药物与PPZ的混合薄膜，再加入去离子水或PBS在4℃搅拌溶解，即得到载药混合物，低温保存待用，图5为装载疏水性药物后的PPZ水凝胶随温度变化状态图。
综上所述，本发明以六氯环磷腈为原料，采用高温开环聚合法合成聚二氯磷腈，通过采用异亮氨酸乙酯、侧基功能团和氨基聚乙二醇对聚二氯磷腈中活跃的氨基电子进行亲核取代制备出可稳定存在的聚磷腈以实现聚磷腈聚合物在生物医疗以及优化装载药物的应用，其中，异亮氨酸乙酯在室温范围(4～25℃)内不会聚集，但是随温度升高，异亮氨酸乙酯会发生聚集反应，表现为不溶于水的凝胶状态，而这种随温度变化而产生的物理相变是可逆的，当温度下降后，凝胶再次变回溶液状态，实现流体/凝胶可逆性相变，从而使得所述聚磷腈聚合物水凝胶在室温下为流动液体方便注射，在体温下固化为水凝胶，释放药物，并且本发明制得的聚磷腈聚合物水凝胶相变过程非常迅速，从水溶液到凝胶状态仅需要5～10秒，从凝胶到水溶液的状态相对耗时，需要15～25秒；侧基功能团可以起到调控降解时间的作用，使降解时间为几天至几个月不等，并且也可以通过电荷吸引与带正电性、负电性或中性的药物结合，以满足生物体内递送不同药物或作为填充物的要求；采用本发明的方法制得的聚磷腈聚合物水凝胶所采用的单体材料均为生物安全性高的材料，理论降解产物为氨气、水和磷酸盐，可被生物体吸收或排泄，安全无毒性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种聚磷腈聚合物水凝胶在制备药物递送的载体、组织再生物和术后填充物中的应用；
所述药物为磁性纳米颗粒；
所述聚磷腈聚合物水凝胶的制备方法，包括步骤：
提供六氯环磷腈、纯度为99.5％的三氯化铝、异亮氨酸乙酯盐酸盐、水解双肽、聚乙二醇单甲醚、四氢呋喃和三乙胺；
在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述四氢呋喃中加入固体钠以去除所述四氢呋喃中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述四氢呋喃的含水量达到0.1％，将所述含水量0.1％的四氢呋喃加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的四氢呋喃，即得到纯化的四氢呋喃；在氮气保护的蒸馏回流装置上，向所述三乙胺中加入氢氧化钾以去除所述三乙胺中的水分，然后蒸馏搅拌6h～8h，使所述三乙胺的含水量达到0.1％，将所述含水量0.1％的三乙胺加入在300℃加热活化3h的分子筛中，然后密封放置24h，得到含水量仅有0.08％的三乙胺，即得到纯化的三乙胺；
在隔离手套箱中用玻璃容器装载六氯环磷腈，在氦气的保护下无空气接触，用真空油脂密封，并吸取氦气，保持真空状态，在玻璃器皿下层对所述六氯环磷腈进行加热，在所述玻璃器皿上层用干冰或冰块保持低温，保证六氯环磷腈气化后，能够凝结在低温的玻璃器皿上层中，待大量的六氯环磷腈结晶出现后，在隔绝空气的手套箱中，再次取出已经结晶纯化的六氯环磷腈；在真空密封的玻璃安瓶中将所述纯化的六氯环磷腈与所述六氯环磷腈的质量的4～5％的三氯化铝混合，加热至300℃，开环反应得到聚二氯磷腈；反应结束后，在手套箱中的氮气保护下打开玻璃安瓶，转移并称量粘稠状的聚二氯磷腈至预先准备好的圆底玻璃反应釜中，并用胶塞封口，待用；
在氮气保护下，将所述聚二氯磷腈加入到所述纯化的四氢呋喃中，得到聚二氯磷腈溶液；向所述聚二氯磷腈溶液中加入聚二氯磷腈1.4倍摩尔量的异亮氨酸乙酯盐酸盐和纯化的三乙胺，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈，反应结束后对所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈过滤3次去除多余的盐分；
将所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈0.3倍摩尔量的水解双肽加入到纯化的四氢呋喃中，得到第一溶液；将所述第一溶液与所述异亮氨酸乙酯取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到水解双肽取代的聚二氯磷腈；
将聚乙二醇单甲醚溶解于三氯甲烷中，并降温至0℃，再加入2倍于聚乙二醇单甲醚质量的甲苯磺酰氯，然后加入纯化的三乙胺进行中和，反应24h，过滤反应溶液得到沉淀，对沉淀蒸发去除三氯甲烷，得到第一反应物；将所述第一反应物溶解于乙腈中，并加入2倍于第一反应物质量的叠氮化钠，升温至80℃搅拌24h，过滤反应溶液得到沉淀，对沉淀蒸发去除乙腈，得到第二反应物；将所述第二反应物溶解于纯化的四氢呋喃中，加入1.5倍于第二反应物质量的苯骈三氮唑，加入水，反应12h至没有氮气产出，蒸发去除四氢呋喃，加冷水沉淀反应过程产生的盐分，过滤后蒸发水，得到氨基聚乙二醇；在氮气保护下，将所述水解双肽取代的聚二氯磷腈2倍摩尔量的所述氨基聚乙二醇与所述水解双肽取代的聚二氯磷腈混合，在-78℃下反应24h，然后升温至0℃反应12h，继续升温至25℃反应6h，最后加热至50℃反应12h，得到所述聚磷腈聚合物溶液；
对所述聚磷腈聚合物溶液进行3次过滤，再采用纯化的四氢呋喃进行浸提处理；将浸提处理后的聚磷腈聚合物溶液加入正己烷中搅拌并沉淀24h，过滤得到沉淀，对得到的沉淀物进行旋转蒸发处理，得到粗提聚磷腈聚合物；对所述粗提聚磷腈聚合物采用MW＝3500Da的透析袋在甲醇相和水相进行透析处理3天，过滤，得到精提聚磷腈聚合物水醇溶液；对所述精提聚磷腈聚合物水醇溶液进行真空和冷冻干燥处理，得到所述聚磷腈聚合物水凝胶；
所述聚磷腈聚合物水凝胶由二氯磷腈骨架和侧基组成，其中，所述侧基包括源自异亮氨酸乙酯的侧基、源自水解双肽的侧基和源自氨基聚乙二醇的侧基，所述二氯磷腈骨架与所述侧基的摩尔比为1:2，在所述侧基中，所述源自异亮氨酸乙酯的侧基、源自水解双肽的侧基和源自氨基聚乙二醇的侧基的摩尔比为(1.35～1.43):0.3：(0.27～0.35)。
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