KR20160014203A - 온도 및 피에이치 민감성 다중블록 공중합체와 알부민의 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 서방성 약물 전달체 - Google Patents

온도 및 피에이치 민감성 다중블록 공중합체와 알부민의 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 서방성 약물 전달체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 온도 및 피에이치 민감성 다중블록 공중합체와 알부민의 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 장기 서방성 약물 전달체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄)(PEG-PAU) 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노에스테르우레탄)(PEG-PAEU) 다중블록 공중합체가 알부민에 결합되어 형성되는 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물의 초기과다방출을 낮추고 약물과의 친화력을 높일 수 있는 장기 서방성 약물 전달체에 관한 것이다.

Description

온도 및 피에이치 민감성 다중블록 공중합체와 알부민의 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 서방성 약물 전달체{Albumin conjugated temperature and pH-sensitive multi-block copolymer, a method of preparation thereof and drug delivery system using the same}
본 발명은 온도 및 피에이치 민감성 다중블록 공중합체와 알부민의 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 서방성 약물 전달체에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄)(PEG-PAU) 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노에스테르우레탄)(PEG-PAEU) 다중블록 공중합체가 알부민에 결합되어 형성되는 결합체, 이의 제조방법 및 이를 이용한 약물의 초기과다방출(initial burst release)을 낮추고 약물과의 친화력을 높일 수 있는 장기(long-acting) 서방성 약물 전달체에 관한 것이다.
생체 적합성 고분자는 진단과 치료를 포함한 각종 의료행위 및 신체의 일부를 대신하기 위해 사용되는데, 최근에는 생분해성 고분자 또는 소수성과 친수성기를 동시에 지니는 양친성 고분자로 분자의 구조를 변화시키거나, 블록 공중합체로 하이드로젤을 형성시켜 졸-젤 전이현상을 조절하는 약물전달체에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
미국특허 제5,476,909호에는, A-B-A 형태의 3중 블록 공중합체를 기술하고 있는데, 소수성 블록(A)은 폴리락타이드(PLA), 폴리글라이콜라이드(PGA) 및 그들의 공중합체로 한정하고 있으며, 친수성 블록(B)도 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 그의 유도체로 한정하고 있다.
또한, 미국특허 제6,004,573호에는 소수성 블록이 폴리락타이드(PLA)와 폴리글리콜라이드(PGA)의 공중합체로, 친수성 블록이 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 생분해성 저분자량의 3중 블록 공중합체로서, 소수성 부분의 함량을 증가시켜 5℃ 내지 25℃에서는 맑은 액체인 졸(sol) 상태로 존재하다가 인체 내에 투입 시에는 자동적으로 체온(37℃)에 의해 젤(gel)의 형태, 즉 물을 담지하고 있는 반고형의 하이드로젤(hydrogel)의 형태로 전이되어 인체 내에서는 지속적으로 젤의 형태로 불용성을 나타내며, 가역적으로 열적 젤화가 유도되어 젤 내부의 약물을 서서히 방출시키는 약물전달체로서 이용되는 양친성의 블록 공중합체가 기재되어 있다.
그러나, 상기의 기술들에 있어서, 약물을 담지한 하이드로젤이 인체에 충분히 주사되어도 하이드로젤의 생체접착성이 충분히 강하지 않아 조직으로부터 떨어지거나, 인체 주사 초기에 하이드로젤의 생분해로 인한 약물의 초기과다방출현상이 일어나는 등 장기간에 걸쳐 약물방출이 조절되지 않는 문제점이 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제665,672호에는 pH 민감성 성분으로 폴리(β-아미노에스터)를 사용한 블록 공중합체 하이드로젤의 제조방법이 기재되어 있다. 이에 따라, 온도뿐만 아니라 pH에도 민감한 블록 공중합체를 합성하여, 체내와 비슷한 pH 7.0 내지 7.4 부근에서 젤화가 이루어지고 상기 범위 이하에서는 졸화되어, 체내 주입 시 종래 온도 민감성 하이드로젤에서 볼 수 있었던 주사 바늘의 막힘 현상의 발생 없이 체내에서 안전하게 젤을 형성할 수 있으며, 이를 통해 제조된 블록공중합체가 특정 온도 및 특정 pH에서 표적방출이 가능한 1주 내지 2주 제형의 약물방출용 전달체로서 응용될 수 있다는 것이 기재되어 있다.
다만, 상기 하이드로젤의 경우, 주로 주쇄가 생분해가 가능한 에스테르 결합과 아마이드 결합으로 이루어져 있어 하이드로젤의 인체 내 주사시 초기에 젤 강도가 다소 많이 떨어지는 문제점이 있으며, 폴리에틸렌글리콜과 상기 생분해성 고분자들과의 반응을 시킨 후에 폴리우레탄의 출발물질과의 우레탄반응을 유도하여야 하는 복잡한 다단계의 반응 및 미반응물의 분리 정제 등을 거쳐야 하는 문제점이 있다.
본 발명자들은 장기 서방성 약물방출주기를 갖으며 온도 및 pH 민감성인 생체 적합성 고분자에 대하여 연구하던 중, 친수성이면서 온도에 민감한 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄우레아) 다중블록 공중합체를 합성하였으며, 또한 장기 약물방출주기를 갖으며 온도 및 pH에 민감한 특성이 있음을 확인하여 대한민국 특허출원 제10-2012-0071412호로 특허출원한 바 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 온도 및 pH에 민감한 다중블록 공중합체의 약물 방출 속도를 더욱 낮출 수 있는 방안을 연구하던 중, 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄)(PEG-PAU) 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노에스테르우레탄)(PEG-PAEU) 다중블록 공중합체를 알부민에 결합시킬 경우 약물의 초기과다방출을 현저하게 낮출 수 있고 약물 방출 속도도 더욱 늦춰 장기간 동안 약물을 방출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 약물의 초기과다방출을 낮출 수 있고 약물 방출 속도도 더욱 늦춰 장기간 동안 약물을 방출할 수 있는, 다중블록 공중합체가 알부민에 결합되어 형성되는 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중블록 공중합체가 알부민에 결합되어 형성되는 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 다중블록 공중합체가 알부민에 결합되어 형성되는 결합체를 이용하여 약물의 초기과다방출을 낮춘 장기 서방성 약물 전달체를 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 다중블록 공중합체가 알부민과 결합되어 형성되는 결합체를 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 식에서,
A는
Figure pat00002
또는
Figure pat00003
이고,
n1은 5 내지 50의 정수이고,
n2는 2 내지 8의 정수이고,
n3는 1 내지 10의 정수이고,
n4는 1 내지 10의 정수이고,
p1은 0 또는 1이고,
p2는 0 또는 1이고,
m은 2 내지 6의 정수이다.
또한, 상기 n2는 6인 것이 바람직하며, 상기 n3는 2인 것이 바람직하다.
상기 다중블록 공중합체의 분자량은 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol이 바람직하다. 상기 다중블록 공중합체의 분자량이 10,000 g/mol 미만인 경우, 인체 생리학적인 조건에서 온도 및 pH 변화에 따른 졸-젤 전이거동이 나타나지 않게 되며, 25,000 g/mol을 초과하는 경우에도 인체 생리학적인 조건에서 졸-젤 전이거동이 나타나기 어려운 문제점이 발생한다.
또한, 상기 다중블록 공중합체는 친수성 블록과 소수성 블록의 분자량비가 1:2 내지 1:4인 것이 바람직하다. 상기 n1 블록은 항상 친수성 블록으로 작용하며, n2 블록은 항상 소수성 블록으로 작용하는 반면에, n3 블록은 이온화상태에서는 친수성 블록으로 작용하고, 비이온화 상태에서는 소수성 블록으로 작용한다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체는 p1 및 p2의 값에 따라, 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄)(PEG-PAU) 다중블록 공중합체이거나, 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노에스테르우레탄)(PEG-PAEU) 다중블록 공중합체일 수 있다. 즉, p1 및 p2의 값이 0인 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체는 PEG-PAU 다중블록 공중합체이고, p1 및/또는 p2의 값이 1인 경우, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체는 PEG-PAEU 다중블록 공중합체이다.
본 발명에서, 상기 다중블록 공중합체의 p 블록은 에스테르 부분으로서 친수성 블록으로 작용하며, 체내 환경에서 분해될 수 있어 약물의 방출 주기를 더욱 짧게 조절하는 역할을 할 수 있다. 본 발명에서, PEG-PAU 다중블록 공중합체는 약물 방출 주기가 1 달 이상일 수 있으나, PEG-PAEU 다중블록 공중합체는 체내에서 상기 p 블록의 에스테르 부분이 분해되어 약물 방출 주기가 2 내지 3주 정도일 수 있다.
본 발명에서, 상기 다중블록 공중합체와 알부민 간의 결합은 링커로서 아크릴로일 기를 사용하여 이루어질 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 다중블록 공중합체와 알부민 간의 결합은 상기 다중블록 공중합체의 폴리에틸렌글리콜 블록의 말단이 아크릴로일(acryloyl) 기의 카보닐 부분과 결합하고 상기 아크릴로일 기의 비닐 부분이 환원된 알부민 표면의 티올기와 결합하여 단일 결합을 형성함으로써 하기 화학식 5로 표시되는 링커 부분을 형성함으로써 이루어질 수 있다.
[화학식 5]
Figure pat00004

본 발명에서, 상기 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 몰비는 바람직하기로 1:1 내지 10일 수 있다. 만일 상기 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 몰비에 있어서 상기 다중블록 공중합체 1몰에 대하여 상기 알부민 내 시스테인이 1몰 미만이면 과량의 다중블록 공중합체가 잔류하게 되고 상기 다중블록 공중합체 1몰에 대하여 상기 알부민 내 시스테인이 10몰을 초과하면 하이드로젤의 형성이 어려울 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 결합체의 제조방법을 제공한다.
하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 1);
상기 다중블록 공중합체 및 아크릴로일 할로겐화물을 반응시켜 아크릴레이트화 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2); 및
알부민을 티올(thiol) 환원제와 반응시킨 다음 상기 아크릴레이트화 다중블록 공중합체와 반응시키는 단계(단계 3).
[화학식 1]
Figure pat00005
[화학식 2]
Figure pat00006
[화학식 3]
Figure pat00007
[화학식 4]
Figure pat00008
상기 식에서,
A는
Figure pat00009
또는
Figure pat00010
이고,
n1은 5 내지 50의 정수이고,
n2는 2 내지 8의 정수이고,
n3는 1 내지 10의 정수이고,
n4는 1 내지 10의 정수이고,
p1은 0 또는 1이고,
p2는 0 또는 1이고,
m은 2 내지 6의 정수이다.
상기 단계 1은, 화학식 2로 표시되는 화합물, 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄)(PEG-PAU) 또는 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노에스테르우레탄)(PEG-PAEU) 다중블록 공중합체를 제조하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은, 친수성 및 온도 특성을 가짐에 따라 체내 환경, 특히 체내 온도에서 민감성을 나타낼 수 있다. 이에, 온도 변화에 따라 하이드로젤을 형성하거나 졸 상태를 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물의 수평균 분자량은 500 g/mol 내지 5,000 g/mol 인 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은, pH 7.0 이하에서 이온화되는 3차 아민기를 포함함으로써 체내 pH에 민감성을 나타낼 수 있다. 이에, pH 변화에 따라 하이드로젤을 형성하거나 졸 상태를 유지할 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은, 1-(2-하이드록시에틸)피페라진{1-(2-hydroxyethyl) piperazine(HEP)}, 1-(2-하이드록시프로필)피페라진{1-(2-hydroxypropyl) piperazine(HPP)}, 1-(2-하이드록시부틸)피페라진{1-(2-hydroxybuthyl) piperazine(HBP)}, 1-(2-하이드록시헥실)피페라진{1-(2-hydroxyhexyl) peperazine(HHP)} 및 4,4'-트리메틸렌디피페리딘{4,4'-trimethylenedipiperidine(TMDP)}으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은, 1,2-에틸렌 다이이소시아네이트, 1,4-테트라메틸렌 다이이소시아네이트 및 1,6-헥사메틸렌 다이이소시아네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 반응은 디부틸틴 디라우레이트(dibutyltin dilaurate), 옥토산 주석, 염화주석, 산화철, 알루미늄 트리이소프로폭사이드, CaH2, Zn 및 염화리튬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 촉매 하에 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 몰비는 1:5:10 내지 1:10:15인 것이 바람직하다. 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 몰비가 5 미만일 경우, 말단에 히드록시기를 갖는 폴리우레아 올리고머가 만들어질 확률이 낮아지며, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물의 몰비가 10을 초과하는 경우에는 블록 공중합체의 블록 길이 조절이 어려운 문제가 발생한다. 또한, 화학식 4로 표시되는 화합물의 몰비가 10 미만일 경우, 말단에 하이드록시기를 갖는 폴리(아미노 우레탄) 올리고머가 만들어질 확율이 낮아지며, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 몰비가 15를 초과하는 경우 블록 공중합체의 블록 길이 조절이 어려운 문제가 발생할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 1)의 반응은 40℃ 내지 80℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 1시간 내지 3시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
상기 단계 2는, 상기 화학식 1로 표시되는 다중블록 공중합체 및 아크릴로일 할로겐화물을 반응시켜 아크릴레이트화 다중블록 공중합체를 제조하는 단계이다.
본 발명에서, 상기 아크릴로일 할로겐화물의 구체적인 예로는 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 및 메타크릴로일 클로라이드(methacryloyl chloride)가 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 다중블록 공중합체 및 아크릴로일 할로겐화물의 반응 몰비는 상기 다중블록 공중합체의 말단 OH 기 대비 아크릴로일 할로겐화물의 몰비가 1:1 내지 1:3인 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로 1:1.5일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 반응은 트리에틸아민의 존재 하에 수행될 수 있다. 상기 트리에틸아민은 상기 다중블록 공중합체의 말단 OH 기 대비 1:1 내지 1:3의 몰비로 사용되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하기로 1:1의 몰비로 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 2)의 반응은 질소 또는 아르곤 대기 하에서 수행하는 것이 바람직하다.
상기 단계 3은, 알부민을 티올(thiol) 환원제와 반응시켜 알부민의 시스틴(-S-S-) 결합을 티올(-SH) 기로 환원시킨 다음 상기 아크릴레이트화 다중블록 공중합체와 반응시킴으로써 상기 아크릴레이트화 다중블록 공중합체의 아크릴로일 말단의 비닐 부분이 알부민 표면의 티올기와 결합하여 단일 결합을 형성하도록 유도하여 알부민을 아크릴레이트화 다중블록 공중합체와 결합시키는 단계이다.
본 발명에서, 상기 단계 3)에서 아크릴레이트화 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 반응 몰비는 1:1 내지 10인 것이 바람직하다. 만일 상기 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 몰비에 있어서 상기 다중블록 공중합체 1몰에 대하여 상기 알부민 내 시스테인이 1몰 미만이면 과량의 다중블록 공중합체가 잔류하게 되고 상기 다중블록 공중합체 1몰에 대하여 상기 알부민 내 시스테인이 10몰을 초과하면 하이드로젤의 형성이 어려울 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 다중블록 공중합체가 알부민과 결합되어 형성되는 결합체를 포함하는 서방성 약물 전달체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 서방성 약물 전달체에 사용 가능한 약물로는 파클리탁솔, 독소루비신, 도세탁솔, 클로로람부실, 인슐린, 엑센딘-4, 인체성장호르몬(hGH), 에리트로포이에틴(EPO), 조혈성장인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), GM-CSF(granulocyte-macrophage stimulating factor), 라이소자임(lysozyme), 소혈청 알부민, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제 등이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 다중블록 공중합체의 3차 아민 부분은 pH 7.0 이하에서 이온화되어 양 전하(+)를 띌 수 있으며, 반면 상기 약물들은 pH 7.0 이하에서 음 전하(-)를 띌 수 있어 이에 따라 상기 약물들은 pH 7.0 이하의 주사 전 졸 상태에 서 상기 다중블록 공중합체에 결합되어 약물 전달체를 형성할 수 있다. 이후 상기 약물 전달체가 체내에 주사되면 pH 7.0 내지 7.4 부근의 체내 환경에서 젤화가 이루어지고 상기 약물들이 서서히 방출되게 된다.
본 발명에서, 상기 장기 서방성 약물 전달체는 주사용 하이드로젤 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 다중블록 공중합체들이 알부민에 결합되어 물리적으로 가교된 구조를 제공하여 상기 약물들이 상기 가교 구조 내에서 더욱 서서히 방출되어 알부민에 결합되지 않은 다중블록 공중합체에 비해 약물의 초기과다방출을 낮추고 더욱 장기간 동안 약물을 방출할 수 있는 약물 전달체를 제공할 수 있다.
본 발명에서, 상기 장기 서방성 약물 전달체는 2주 내지 5주 동안 약물 방출이 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 다중블록 공중합체가 알부민과 결합되어 형성되는 결합체는 친수성 및 온도 특성을 갖는 화학식 2로 표시되는 화합물에 pH에 따른 이온화 특성을 갖는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 혼합하여 반응시켜 얻은 온도 민감성 및 pH 민감성을 갖는 다중블록 공중합체를 알부민과 결합시켜 약물의 초기과다방출을 현저하게 낮출 수 있고 약물 방출 속도도 더욱 늦춰 더욱 연장된 장기 서방성 약물방출주기를 갖는 효과가 있다.
또한, 온도 및 pH 민감성 다중블록 공중합체는 체내에서 안전하므로 의료용, 유전자 전달, 약물 전달 분야, 특히 약물 담지 및 방출 등의 서방형 약물 전달체로 적용될 수 있을 뿐만 아니라 병의 진단을 위한 물질을 비정상 세포에 전달함으로써, 진단 이미징 등의 진단 용도에 유용하게 응용할 수 있다.
또한, 정상 체내 조건과 동일한 pH 7.0 내지 7.4 범위에서는 하이드로젤을 형성하고 암세포와 같은 비정상 조건인 pH 7.0 이하에서는 졸 상태로 유지되어 암세포 표적 지향적인 디자인을 적용하였으나, 상기 다중블록 공중합체가 알부민과 결합되어 형성되는 결합체의 구성 성분, 이들의 몰비, 분자량 및/또는 블록 내 관능기를 적절히 변경함으로써 암세포뿐만 아니라 유전자 변이 또는 다른 응용분야에 표적 지향적으로 디자인하여 이를 유용하게 응용할 수 있다.
도 1은 실시예 1의 BSA(a), PAU 다중블록 공중합체(b), 및 PAUBSA 결합체로서 PAUBSA1(c)과 PAUBSA2(d)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 25 wt% PAU 용액(□), 20 wt% PAUBSA1 용액(●), 25 wt% PAUBSA1 용액(○), 20 wt% PAUBSA2 용액(▲) 및 25 wt% PAUBSA2 용액(△)의 졸-젤 상 다이아그램을 나타낸다.
도 3은 PAU(■), PAUBSA1(●) 및 PAUBSA2(▲) 하이드로젤로부터의 시험관 내 라이소자임 방출 거동을 보여주는 그래프이다.
도 4는 pH 7.4에서의 다양한 중합체/라이소자임 비율에 따른 제타 포텐셜 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 수컷 SD 래트 내 PAUBSA1/라이소자임 하이드로젤의 인시츄 젤화 및 안정성을 보여주는 사진도이다.
도 6은 라이소자임 용액(■), 라이소자임 로딩된 PAU 하이드로젤(●) 및 라이소자임 로딩된 PAUBSA1 하이드로젤(▲) 투여 후 수컷 SD 래트의 혈장 내 라이소자임의 농도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 7은 실시예 2의 BSA(상단), PAU 공중합체(중간) 및 결합체(하단)의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 PAU2와 PAU2BSA의 졸-젤 상 다이아그램(a), PAU4와 PAU4BSA의 졸-젤 상 다이아그램(b), 및 결합체의 졸 상태로부터 젤 상태로의 pH 및 온도 감응 전이에 대한 대표적인 사진도를 나타낸다.
도 9는 25 wt% PAU2 및 PAU2BSA로부터의 시험관 내 DOX 방출 거동을 보여주는 그래프이다.
도 10은 L929 섬유아세포를 사용한 다양한 농도에서의 PAU2BSA의 시험관 내 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 3의 PAEU 결합체의 졸-젤 상 다이아그램을 나타낸다.
도 12는 실시예 3의 PAEU 결합체의 시험관 내 및 생체 내 젤 분해 거동을 보여주는 그래프이다.
도 13은 실시예 3의 BSA(○), PAEU(▲) 및 PAEU 결합체(■)의 생체 내 라이소자임 방출 거동을 보여주는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 알부민 시스테인에 대한 PAU 의 몰비가 다른 PAU - BSA 결합체의 제조
실험에 사용한 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Mn=2000 및 Mn=4600), 비스-1,4-(히드록실에틸)피페라진(HEP), 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HDI), 디부틸틴(II) 디라우레이트, 무수 톨루엔, 무수 N,N-디메틸 포름아미드(DMF), 무수 클로로포름(CHCl3), 인산완충식염수(PBS), BSA, 계란 난백 라이소자임, 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 히드로클로라이드(TCEP-HCl), 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민은 시그마-알드리치(Simga-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 디에틸 에테르, 아세톤 및 모든 다른 시약들은 분석용을 사용하였다.
단계 1: PAU 합성
PAU는 이전 문헌에 기재된 방법을 이용하여 합성했다(D. S. Lee et al., Polymer, 2008, 49, 4968).
간략히 설명하면, 축중합(polycondensation)은 OH기와 NCO 기의 화학양론적인 비, OH/NCO=1로 수행하였다. 1.0 mmol의 PEG(Mn=2000)를 마그네틱 스터 바가 구비된 건조된 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. PEG로부터 수분을 제거하기 위하여 플라스크는 2시간 동안 진공 하에 100℃의 오일 배스에 넣었다. 80℃로 식힌 후, HEP, 및 CHCl3 내 1wt% 디부틸틴 디라우레이트를 플라스크 안에 넣었고, 진공을 30분 동안 더 가하였다. 그 뒤에, 무수 톨루엔/DMF(50:50) 60 mL를 용매로 첨가하고, 상기 혼합물을 HEP가 완전히 녹을 때까지 교반하였다. 미리 결정된 양의 HDI를 첨가하고, 상기 용액을 80℃에서 반응시켰다. 2시간 후에, 용매를 증발시켜 제거하고, 생성물을 CHCl3에 다시 용해시켰다. 10배의 과량의 얼음 냉각된 디에틸 에테르 내에서 침전시켜 PAU를 얻고, 이를 여과 후, 반복적으로 디에틸 에테르로 세척하여 최종적으로 최소 48 시간 동안 진공 오븐에서 건조하였다.
단계 2: 아크릴레이트화 PAU 의 제조
아크릴레이트화 PAU(acrylated PAU, APAU)는 상기 단계 1에서 합성된 PAU로부터 하기와 같이 제조되었다.
간략하게 설명하면, PAU는 아르곤 하에서 OH 기 대비 1.5:1 몰비의 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 및 트리에틸아민과 반응시켜 아크릴레이트화되었다. 상기 생성물을 얼음 냉각된 디에틸 에테르 내에서 침전시키고 최소 48시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 프로톤 NMR(1H NMR)을 사용하여 말단기 전환율(>90%)을 확인하고 최종 생성물의 순도를 확인하였다.
단계 3: PAU - BSA 결합체의 합성
PAU와 BSA의 결합은 이전 문헌에 기재된 방법을 변형하여 하기 반응식 1과 같이 수행하였다(L. Oss-Ronen, D. Seliktar, Acta Biomater. 2011, 7, 163).
[반응식 1]
Figure pat00011

상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 8M 우레아를 포함하는 PBS 내 BSA(TCEP:알부민 시스테인의 몰비 2:1)의 7 mg/mL 용액에 TCEP-HCl을 첨가하였다. APAU를 BSA 용액에 첨가하고 하룻밤 동안 상온에서 반응시켰다(APAU:알부민 시스테인의 몰비 1:1). 상기 반응물을 아세톤 내에서 침전시키고, 8M 우레아를 포함하는 PBS에 다시 녹이고, 2일 동안 4℃에서 PBS로 투석(12-14 kDa MW cut-off, Spectrum, Gardena, CA)을 수행한 다음, 이후에 사용하기 전까지 동결건조시켜 결합체(PAUBSA1)를 얻었다. APAU:알부민 시스테인의 몰비가 1:2인 결합체(PAUBSA2)를 비슷한 과정을 통해 합성하였다. 하기 표 1에 상기 합성 내용을 요약하였다.
[표 1]
Figure pat00012

실험예 1: 본 발명의 결합체의 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 PAU-BSA 결합체의 특성을 하기와 같이 분석하였다.
1) FT-IR 및 SDS-PAGE 분석
상기 실시예 1에서 제조된 다중블록 공중합체의 작용기의 도입 및 말단기들의 반응을 확인하기 위하여, FT-IR 측정을 수행하였다. FT-IR 스펙트럼은 FT-IR 스펙트로미터(FT/IR-4100 Type A, TGS, Jasco)로 얻었다. 또한, 원래의 BSA와 결합체를 8% 폴리아크릴아미드 젤에 로딩(각 레인에 시료 5-10 ㎍)함으로써 SDS-PAGE를 통하여 PAU와 BSA의 결합 생성물, 즉 결합체의 생성을 확인하였다. 상기 젤은 쿠마시에 블루로 염색하고, 디지털 이미지를 얻었다.
상기 실시예 1에서, 다중블록 공중합체는 PEG, HDI 및 HEP를 단량체로 사용하여 합성하였다. BSA와 결합되기 전에 PAU는 아크릴로일 클로라이드와 반응시켜 아크릴레이트화되었다. PAU의 아크릴레이트화 PAU로의 변환은 95% 이상이었다. PAU-BSA 결합은 아크릴레이트화 PAU의 비닐기와 BSA의 티올기 사이에 미첼(Michael) 부가반응에 의해 달성하였다. BSA(a), PAU 다중블록 공중합체(b), 및 PAUBSA 결합체로서 PAUBSA1(c)과 PAUBSA2(d)의 FT-IR 스펙트럼을 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.
도 1a 내지 도 1d를 통해, 원래의 BSA와 PAU의 스펙트럼과 비교하여 PAUBSA 결합체(PAUBSA1 및 PAUBSA2 둘 다)의 스펙트럼이 BSA와 PAU의 특징적인 밴드를 모두 보여주는 것을 확인할 수 있다. 즉, 3421 cm-1에서의 주목할 만한 N-H 스트레칭 진동 이외에도, 펩타이드 부분의 다른 진동을 나타내는 아미드 밴드가 결합체의 스펙트럼에서 명확하게 나타났다. 아미드 I 밴드(#1, C=0 스트레칭 모드에 관련된 흡수) 및 아미드 II 밴드(#2, C-N 스트레칭 모드 및 N-H 벤딩 모드에 관련된 흡수)가 각각 1600-1700 및 1533 cm-1에서 나타났다. 이들의 두 진동들은 단백질 특징분석(characterization)을 위한 전형적인 밴드로서 광범위하게 사용되는 것들이다. PAU 부분에 대하여는, PEG의 에테르 밴드(#4, C-O-C 스트레칭 모드에 관련된 흡수)는 1101 cm-1에서 관찰되었고, HEP 방향족기의 C-N 스트레칭에 상응하는 밴드(#3)는 1259 cm-1에서 나타났다. 상기 결합체의 FT-IR 스펙트럼에 나타난 상기 밴드들은 다중블록 공중합체와 BSA 간의 결합이 성공적으로 이루어졌음을 보여준다.
또한, 상기 결합체의 다중블록 공중합체와 BSA 간의 결합은 도 1e에서 보여주는 것처럼 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.
BSA, PAUBSA1 및 PAUBSA2를 8% 폴리아크릴아미드 젤에 로딩하고 분자량 마커로 비교하였다. 그 결과, 결합체의 분자량 증가와 다분산성을 보여주었다. 상기 PAUBSA1와 PAUBSA2의 분자량은 각각 100kDa 내지 250kDa의 범위 및 50kDa 내지 250kDa의 범위이었다. 결합체의 이동성(PAUBSA1 및 PAUBSA2는 각각 레인 B 및 C임)은 원래의 BSA(레인 A)와 비교하여 현저하게 줄었다. BSA는 PAU/시스테인의 비가 1:1일 경우(PAUBSA1)에 상기 공중합체에 완전히 결합되었으며, 상기 반응에서 시스테인의 농도가 증가되는 경우(PAUBSA2)에 BSA의 잔류물이 관찰되었다.
2) pH 및 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동
수용액 중에서의 PAU와 PAUBSA 결합체의 졸-젤 상 전이 거동을 테스트 튜브 인버팅 방법(test tube inverting method)으로 측정하였다.
먼저, pH에 따른 졸-젤 상 전이거동은 각 샘플을 주어진 농도로 5 mL 바이알 튜브 내 pH 4의 PBS 중에 용해시킨 다음, 상기 용액의 pH를 NaOH와 HCl를 이용하여 원하는 값으로 조절하면서 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
또한, 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동은 대략 0.5 mL의 용액을 포함하는 바이알을 온도 조절된 워터 배쓰에 넣고, 2℃의 온도 간격으로 가열하고, 10분 동안 평형을 유지하는 방식으로 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
상기 PAU, 및 PAUBSA1과 PAUBSA2의 결합체의 졸-젤 상 다이아그램을 도 2에 나타내었다.
도 2를 통해, pH 6.8인 PAU 다중블록 공중합체는 40℃에서 졸로부터 젤로 전이되는 것으로 나타났고, 젤화 온도는 용액의 pH가 증가함에 따라 감소하였다. 젤의 형성은 고분자 마이셀의 상호연결(interconnection)을 통하여 일어나는 것으로 여겨졌다. HEP-HDI 소수성 코어와 PEG 친수성 쉘로 구성된 마이셀이 용액 내에 형성된다. 상기 시스템은, 저온에서는 PEG의 친수성으로 인하여, 그리고 낮은 pH에서는 HEP의 이온화로 인하여, 수용액 중에서 전체 시스템이 완전히 용해되어 졸 상태가 유지되었다. pH가 증가함에 따라, HEP는 점진적으로 탈 이온화되고 더욱 소수성이 되었다. 또한, PEG는 온도가 증가함에 따라 탈수되기 시작하였다. PEG의 탈수와 HDI의 소수성 성질에 따라, HEP-HDI 부분 간의 소수성 상호작용이 물과 PEG 부분 간의 친수성 상호작용을 극복하고, 그 결과로 상기 공중합체 용액은 전이 온도 및 pH에서 젤화 되었다. 생리학적인 조건, 즉 pH 7.4 및 37℃에서의 완전한 전이와 하이드로젤의 안정성은 하이드로젤 투여에 요구된다. 상기 용액은, 사실상 상 경계에 매우 근접하게 위치한 체내 조건을 이루는 pH 값이 7.4일 때 32℃에서 젤화 되었다. 젤화는 모든 pH 값에서 32℃ 이하에서 관찰되지 않았다. 이는 친수성이 이들 조건에서 우세하기 때문이다. 또한, 젤로부터 졸로의 상 전이는 모든 pH 값에서 84℃일 때 나타났다. PEG의 완전한 탈수로 인하여 상부 상 경계가 나타났다.
결합체(PAUBSA1 및 PAUBSA2 모두)의 상 다이아그램은 유사한 농도(25 wt%)를 갖는 PAU 하이드로젤보다 더 강한 소수성을 보여주었다. 젤 윈도우(gel window)는 생리학적 조건을 잘 커버하고, 이에 따라 생리학적 조건에서 상기 용액은 안정한 젤로 완전하게 전환되었다. BSA에 결합될 때, PAUBSA1과 PAUBSA2의 졸-젤 전이는 단백질의 부가로 인하여 더 낮은 온도로 이동하였다. PAU의 아크릴레이트화가 공중합체 사슬의 양 말단에 반응성 비닐기를 가지는 디아크릴레이트화 공중합체를 생성시킬 수 있다. 즉, 디아크릴레이트화 PAU와 BSA 내 수개의 티올기 간의 공유적으로 결합된 네트워크를 생성시킬 수 있다. 가교된 네트워크는 분자량의 급격한 증가를 야기하고 소수성을 증가시켜, 모든 pH값에서 결합체의 졸로부터 젤로의 전이 온도를 낮추는 것으로 여겨졌다.
또한, 졸-젤 다이아그램에 대한 농도의 영향을 결합체 용액에 대해 조사하였다. 25 wt%로부터 20 wt%로 용액의 농도가 감소함에 따라 졸-젤 전이가 모든 pH값에서 더욱 높은 온도로 이동하였다. 20 wt% 용액의 비교적 낮은 소수성 밀도로 인하여, 상기 시스템은 네트워크의 젤화를 위한 충분한 소수성 상호작용이 요구되고, 이는 온도를 증가시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 상부 상 경계가 상기 결합체 하이드로젤에서 나타나지 않았다.
또한, 졸-젤 상 전이에 대한 알부민 조성의 영향을 조사하기 위해 PAUBSA1 및 PAUBSA2의 상 다이어그램을 동일한 농도 범위에서 비교하였다. 도 2는 각 농도에서 PAUBSA2의 상 다이아그램이 PAUBSA1의 상 다이아그램 아래에 있음을 보여준다. 이러한 결과는 졸-젤 전이 온도가 하이드로젤 내 BSA의 몰비가 증가함에 따라 낮아지는 것을 나타낸다. 도 2는 또한 졸 상태와 젤 상태에서 각각 유동적인 액체와 고체 젤 상태를 삽입도에서 보여준다.
상기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 결합체의 제조에 사용한 PAU(Mn=7250)의 분자량은 이전에 Dayananda에 의해 합성된 PAU(Mn=30000)보다 현저하게 더욱 낮았다(K. Dayananda et al., Polymer, 2008, 49, 4968). 그러나, 두 PAU 시스템의 졸-젤 상 다이어그램은 비슷하였다. 소변 배출 분석은 특정한 분자량 범위(MW<20000)을 갖는 PEG를 기반한 중합체가 24시간 내에 배출되는 것을 보여주었다(R. B. Greenwald et al., Adv. Drug Delivery Rev., 2003, 55, 217). BSA의 효소적 분해에 따라, 이러한 비교적 낮은 분자량의 PAU는 하이드로젤의 분해 이후에 신장의 클리어런스에 적합한 이점이 있다.
3) 시험관 내 방출
25 wt% 농도의 각각의 샘플 용액을 10 mg/mL 농도의 라이소자임과 혼합하였다. 각 샘플의 0.5 g을 바이알에 넣고, 37℃로 세팅된 워터 배쓰 내에서 pH를 7.4로 조정함으로써 젤화시켰다. 방출 매질(release medium)로서 0.02 wt% NaN3를 포함하는 PBS 5mL를 상기 하이드로젤이 함유된 바이알에 넣었다. 일정한 시간 간격으로 2 mL의 방출 매질을 측정을 위하여 제거하고, 대신에 2 mL의 새로운 버퍼를 동일한 바이알에 대체해주었다. 라이소자임 방출은 BCA 어세이로 측정하였다. 또한, 라이소좀이 없는 하이드로젤을 백그라운드로서 측정하고, 그 값을 실질적인 라이소자임 방출량을 측정하기 위해 라이소자임이 로딩된 하이드로젤의 값에서 빼주었다.
시험관 내 방출 실험은 단백질 로딩된 하이드로젤의 방출 거동을 비교하기 위하여 수행되었다. 라이소자임은 각기 다른 하이드로젤 매트릭스에 로딩되었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. PAU 하이드로젤로부터 라이소자임 방출의 초기 단계 동안에 버스트 효과가 나타났으며 방출량은 대략 2주에 한계치(threshold)(거의 80%)에 도달하였다. 다른 한편으로, 결합체 하이드로젤은 초기 방출 기간 동안 버스트 효과가 상당히 감소하였다. PAUBSA1 및 PAUBSA2로부터의 라이소자임 방출은 PAU 하이드로젤과 비교하여 더욱 지속적인 방출 양상을 보였다. 이러한 결합체 하이드로젤은 라이소자임이 방출되는 이들 거동을 4주 이상 유지하였고, 이때 PAUBSA1 및 PAUBSA2로부터 방출되는 라이소자임의 양은 각각 60% 및 40%에 달하였다. 비교적 느린 결합체 하이드로젤에서의 라이소자임의 방출은 약물과 단백질에 대한 BSA의 결합 친화도에 의한 것으로 여겨지며, 이로 인해 트래핑된 분자들의 매트릭스로부터의 특이적인 방출 지연을 야기시켰다. 상기 결과는 상이한 BSA 조성으로 구성된 결합체 하이드로젤로부터의 라이소자임의 방출을 비교함으로써 입증되었다. PAUBSA2로부터의 라이소자임 방출은 BSA의 양이 절반인 PAUBSA1으로부터의 방출보다 더욱 느리게 진행되었다. BSA 조성이 증가함에 따라, 트래핑된 분자는 더 많은 친화 부위(affinity site)에 접근할 수 있고, 이에 따라 PAUBSA2 내에 잘 보유되었다. 라이소자임 방출의 충분한 양을 갖는 우수한 서방성(3주 내 >50%)으로 인하여, PAUBSA1을 추가적인 생체 내 실험을 위해 선택하였다.
라이소자임은 이의 구조와 용액 거동(solution behavior)을 포함하는 특성으로 인하여 모델 단백질로서 사용되어 왔다. 음이온 개질된 중합체의 존재 하에 라이소자임은 최대 72℃까지 열적 안정성을 유지하였다. 이는 라이소자임의 2차 구조가 이러한 온도 이하에서 보존되는 것을 나타낸다. 또한, 라이소자임의 활성은 넓은 pH 범위(6.0~9.0)에 걸쳐 유지되었다. 또한, PEG에 기반한 하이드로젤 및 다른 중합체적인 고안물로부터 방출되는 라이소자임에 대한 이전의 연구들은 최대 28일까지 약 95%의 생활성 및 최대 50일까지 심지어 100%의 생활성을 유지하였다. 이러한 이전 연구들에 근거하였을 때, 본 발명의 하이드로젤로부터 방출되는 라이소자임의 생활성은 보존되거나 최악의 경우에 실험과정 중에 일부 손실되었을 것으로 보였다.
4) 제타 포텐셜 측정
PAU 및 PAUBSA 결합체의 제타 포텐셜 값은 상온에서 Metasizer Nano ZS instrument (Malvern Instrument)을 이용하여 측정하였다. 모든 샘플에 대한 용액의 농도는 1mg/mL이고, pH값은 7.4로 조정하였다. 용액은 측정에 앞서 상온에서 20분 동안 안정화시켰다.
트래핑된 단백질과 하이드로젤 간의 복합체 형성(complexation)은 샘플의 제타 포텐셜을 모니터링 함으로써 측정하였다. 라이소자임 용액 단독의 제타 포텐셜은 11.2 mV이었다. 이는 생리학적인 pH 내에서의 라이소자임의 양이온성 성질을 나타낸다. 도 4a에서 보여지는 바와 같이, 소량의 PAU가 존재할 경우 제타 포텐셜은 약간 떨어졌으나, 용액 내 PAU 비율을 증가시킴에 따라 제타 포텐셜은 증가하였다. PAU와 라이소자임이 양이온성 분자이고 pH 7.4에서 양전하를 약하게 형성하기 때문에(즉, 이에 따라 중합체가 특별한 이온성 인력 없이 라이소자임을 트래핑시키기 때문에) 모든 PAU/라이소자임 제형에 대한 양의 값은 이온성 결합체가 존재하지 않음을 나타내었다. 그러므로, 라이소자임의 방출은 라이소자임과 하이드로젤 매트릭스 간의 정전기적인 반발력에 의해 가속화되었다. 다른 한편으로, 소량의 PAUBSA1이 존재하면 제타 포텐셜의 급격한 감소가 명백히 나타났고, 용액 내 PAUBSA1의 비율이 증가함에 따라 감소하고 상당히 음의 값이 되었다. PAUBSA1이 음이온적으로 개질된 하이드로젤일 수 있고 라이소자임과 BSA 간의 상호작용이 더욱 인력으로 작용할 수 있기 때문에, 로딩된 라이소자임은 BSA 부분으로부터 우위적인 음의 전하에 의해 고정됨으로써 상대적으로 느린 동력학적인 과정으로 방출된다.
5) 생체 내 젤 형성
25 wt% PAUBSA 결합체 용액을 수컷 Sprangue-Dawley (SD) 래트의 등 피하에 주사하여 주입성(injectability)과 생체 내 젤화를 평가하였다. 미리 정해진 시간에, 래트를 희생시키고 인 시츄(in situ) 젤화를 육안으로 관찰하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. PAUBSA1 용액의 농도는 25 wt%이었고 로딩된 라이소자임의 농도는 10 mg/mL이었다. 단회의 피하 주사 후에, PAUBSA1 용액은 래트 피부 아래에서 30분 내에 즉시 고체 젤을 형성하였다. 젤의 형태는 3주 이상 동안 안정적으로 유지되었고, 크기는 물리적인 외형으로 관찰되는 바와 같이 공중합체의 분해로 인하여 더욱 작아졌다.
6) 생체 내 방출
생체 내 라이소자임 방출을 조사하기 위하여, 250 ㎕의 라이소자임이 로딩된 샘플 용액을 수컷 SD 래트(그룹당 3마리)에 주사하였다. 미리 정해진 시간에, 혈액샘플을 꼬리 혈관으로부터 모았고, 원심분리하여 혈청을 얻은 다음 분석 전까지 -21℃에 보관하였다. 혈청 내 라이소자임 농도는 상업적인 라이소자임 (LZM) ELISA 키트(Cusabio, China)를 사용하여 측정하였다.
도 6은 수컷 SD 래트 내로의 라이소자임 로딩된 샘플의 단일 피하 주사로부터의 생체 내 라이소자임 방출을 보여준다. 각각의 샘플은 제형 내에 10 mg/mL의 라이소자임을 함유하였다. 예측된 바와 같이, 초기과다방출이 라이소자임 용액을 주사한 래트에서 명백하게 관찰되었다. 혈장 내 라이소자임 수준은 주사 후 2일 내에 약 447 ng/mL에 도달하였고, 그 후 감소하기 시작하여 9일 내에 정상 수준으로 떨어졌다. PAU 하이드로젤은 약물의 초기과다방출 효과가 약간 감소하였으며, 297 ng/mL에서 피크 수준을 보여주었다. 그러나, 용액일 경우와 라이소자임 로딩된 PAU 하이드로젤일 경우의 주사된 라이소자임 간의 방출 동력학에 차이가 없었다. 두 운반체 모두가 혈장 내 라이소자임이 정상 수준까지 떨어지기까지 9일 이하로 방출을 유지하였다. 이와 반대로, PAUBSA1 하이드로젤은 270 ng/mL에서 피크를 가지며 약물의 초기과다방출 효과를 감소시킬 뿐 아니라 혈장 내 라이소자임의 농도가 최종적으로 정상 수준에 도달하기까지 2주 이상 라이소자임의 방출을 지속하였다.
실시예 2: 분자량이 다른 PEG 를 사용한 PAU - BSA 결합체의 제조
모든 시약은 시그마 알드리치로부터 구입하였으며, 추가적인 정제 없이 사용하였다. 분자량 2000 또는 4600인 PEG를 PAU 합성에 사용하였으며, 각각 PAU2와 PAU4로 명명했다. PAU의 합성과 아크릴레이트화는 상기 실시예 1에 기재된 방법에 기초하여 수행하였다. 1H-NMR을 사용하여 말단기의 전환율을 평가하고 마지막 반응물의 순도를 확인하였다.
PAU와 BSA의 결합은 이전 문헌에 기재된 방법을 변형하여 하기 반응식 2와 같이 수행하였다(L. Oss-Ronen, D. Seliktar, Acta Biomater. 2011, 7, 163).
[반응식 2]
Figure pat00013

상기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 공중합체 용액(PAU:알부민 시스테인의 몰비 1:1)을 8M 우레아 내 BSA의 7 mg/mL 용액에 첨가하고 하룻밤 동안 상온에서 반응시켰다. 상기 반응물을 아세톤 내에서 침전시키고, 8M 우레아를 포함하는 PBS에 다시 녹이고, 2일 동안 4℃에서 PBS로 투석(12-14 kDa MW cut-off, Spectrum, Gardena, CA)을 수행한 다음, 이후에 사용하기 전까지 동결건조시켜 결합체를 얻었다.
실험예 2: 본 발명의 결합체의 특성 분석
상기 실시예 2에서 제조된 PAU-BSA 결합체의 특성을 하기와 같이 분석하였다.
1) FT-IR 및 SDS-PAGE 분석
공중합체와 결합체는 FT-IR을 통해 특징 분석하였다.
결합체는 도 7에서 보여주는 바와 같이, FT-IR 스펙트럼으로 특징 분석되었다. 원래의 BSA 분자의 스펙트럼(상단, 좌우)은 3421 cm-1에서 N-H 스트레칭 진동에 상응하는 주목할만한 흡수를 보여주었다. 각각 1656 cm-1과 1533 cm-1에서 나타난 흡수 밴드, 즉 아미드 I(AI, C=0 스트레칭 진동) 및 아미드 II(AII, C-N 스트레칭 진동과 N-H 벤딩 진동) 밴드는 전형적으로 단백질 특징 분석에 대한 특징적인 밴드로 인정되는 것들이다. 공중합체의 스펙트럼(중간, 좌: PAU2 및 우: PAU4)은 둘 다 각각 HEP의 N-H 스트레칭, 우레탄의 C=O 스트레칭, HEP 방향족의 C-N 스트레칭 및 PEG의 C-O-C 스트레칭을 나타내는 3338, 1695, 1265 및 1101 cm-1에서 흡수가 나타났다. PAU4가 비교적 고분자량의 PEG로부터 합성되었기 때문에, 1101 cm-1에서의 밴드는 직관적으로 더 강한 흡수를 나타내었다. BSA(AI과 AII) 및 PAU(PI과 PII)에 상응하는 모든 특징적인 밴드가 결합체의 스펙트럼(하단, 좌: PAU2BSA 및 우: PAU4BSA)에서 나타났다. FT-IR 결과 이외에, 결합 형성은 SDS-PAGE를 통해서도 확인하였다. 그 결과, 공중합체와 BSA 간에 성공적인 결합 형성을 확인할 수 있었다.
2) pH 및 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동
수용액에서의 공중합체(PAU2 및 PAU4) 및 결합체(PAU2BSA 및 PAU4BSA)의 졸-젤 상 전이는 테스트 튜브 인버팅 방법에 의해 확인하였다.
공중합체의 젤화가 자극 반응성 중합체 네트워크를 자극함으로써 형성되는 마이셀의 상호연결을 통하여 발생하기 때문에, 졸-젤 상 다이아그램은 용액의 pH와 온도를 변경함으로써 조작할 수 있다.
도 8은 졸 상태에서 젤 상태로의 PAU2의 전이온도가 pH 6.8에서 40℃이었으나, pH 7.08 및 pH 7.40에서 각각 36℃ 및 32℃로 낮아졌음을 보여준다. PAU2는 모든 pH 값에서 76℃일 경우 단단한 젤에서 유동적인 액체로 변화하는 상부 상 경계를 나타내었다. PAU4도 비슷한 졸-젤 상 다이어그램을 나타내었으나, 더욱 높은 전이온도(즉, 전이온도는 pH 6.68, 7.12, 7.43 및 7.58일 때, 각각 68, 52, 40 및 36℃이었음)를 나타내었다. 더욱 긴 PEG 사슬 길이에 의해 형성되는 더욱 큰 마이셀 크기가 상 다이아그램을 넓히고 비교적 높은 상부 상 경계를 형성하는 것으로 여겨졌다.
본 발명에서, 단백질의 부가 하에 공중합체의 졸-젤 전이 온도가 낮아졌다. 이때 PAU2 및 PAU4는 결합체 형성 후에 마이셀 크기의 증가로 인하여 영향을 받을 수 있다. 상 다이아그램은 공중합체가 단백질에 결합될 때, 모든 pH 값에서 더욱 낮은 온도로 이동하였다. PAU4BSA는 모든 pH값과 20℃ 이하의 온도에서 졸 상태로 존재하였다. 용액은 pH 7.48에서 24℃부터 젤화되기 시작하였고, 용액의 pH가 더욱 산성이 되었을 때 전이온도가 증가하였다. PAU2BSA는 비슷한 상 거동을 나타내었지만, pH 7.48에서 4℃부터 젤화가 시작되었다. 이는 동일한 pH 값에서의 PAU4BSA의 전이 온도보다 훨씬 더 낮았다. 졸-젤 전이는 용액의 pH가 더욱 산성화될 때 전이 온도가 증가하는 동일한 방식으로 거동하였다. 결합 형성 후에, PAU2BSA 및 PAU4BSA는 둘 다 비교적 넓은 상 다이아그램을 나타내었고, 상부 상 경계가 사라졌다. 또한, 젤 윈도우는 생리학적 조건(37℃ 및 pH 7.4)을 잘 커버하므로, 이들 결합체 하이드로젤은 생리학적 응용에 사용될 수 있다. 졸 상태(또는 액체 상태)와 젤 상태의 결합체의 모습을 도 8(c)에서 보여주었다.
3) 시험관 내 DOX 방출
25 wt% 농도의 PAU2 및 PAU2BSA 용액을 500 ㎍/mL의 최종 농도로 DOX와 혼합하였다. 0.5 g의 각 샘플을 바이알에 넣고, 37℃로 세팅된 워터 배쓰 내에서 pH를 7.4로 조정함으로써 젤화시켰다. 방출 매질로서 0.02 wt% NaN3를 포함하는 5mL의 PBS를 바이알에 넣었다. 미리 정해진 시간 간격으로, 2 mL의 방출 매질을 측정을 위하여 제거하고, 2 mL의 새로운 PBS를 동일한 바이알에 대체하였다. DOX 방출은 495 nm로 세팅한 UV-VIS 분광계로 분석하였다.
도 8(a) 및 도 8(b)에 나타난 바와 같이, PAU2BSA와 PAU4BSA는 둘 다 주사가 가능하지만, 적절한 젤화(즉, 젤 윈도우가 생리학적 조건을 잘 커버해야 함)가 더 필수적이다. 이에 따라, 본 발명에서는 PAU2BSA를 기반으로 한 결합체 하이드로젤을 선택하여, 이러한 시스템이 잠재적으로 항암 약물인 DOX를 로딩할 수 있고 이의 방출을 연장시킬 수 있음을 확인하였다. 25 wt% PAU2BSA 하이드로젤로부터의 약물 방출을 원래의 PAU2 공중합체 하이드로젤과 비교하였다. 도 9는 PAU2 및 PAU2BSA 하이드로젤로부터의 DOX의 누적 방출이 약물의 초기과다방출 없이 5주 이상 지속되는 것을 보여준다. PAU2BSA로부터의 DOX 방출은 비교적 느린 방식(즉, PAU2로부터의 DOX 방출이 5주 내에 >60%에 도달한 반면, PAU2BSA로부터의 DOX 방출은 5주 내에 40%에 도달함)으로 진행되었다. 상기 방출 프로파일은 BSA가 약물에 대한 결합 친화도로 인하여 하이드로젤 네트워크 내에 로딩된 DOX를 유지하는데 도움을 주는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 결합체 하이드로젤은 장기 서방형 방출을 위한 약물의 방출을 효과적으로 연장시킬 수 있다.
4) 시험관 내 세포독성 분석
하이드로젤의 세포독성은 직접 접촉 방법으로 평가하였다. 이때 L929 섬유아세포를 사용하였으며 상기 세포는 96-웰 플레이트 내에 0.2 mL의 성장 배지 내 웰 당 10,000개 세포의 접종 밀도(seeding density)로 접종하고 37℃에서 24시간 동안 유지하였다. 상기 성장 배지를 제거하고 원하는 양의 중합체를 포함하는 새로운 배지를 첨가하였다. 세포를 다시 48시간 동안 인큐베이션시킨 후에 MTT assay를 통해 세포의 대사 활성을 마이크로플레이트 판독기 내 570 nm 파장에서 확인하였다.
PAU2BSA 세포독성을 평가한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10은 세포 생존율이 낮은 농도(즉, 50-300 ㎍/mL)에서 >90%이고, 500 및 1000 ㎍/mL의 높은 중합체 농도에서 각각 >80% 및 >70%임을 보여준다. 따라서, 본 발명의 결합체는 세포독성이 없고 생물학적 재료로서 활용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3: PAEU - BSA 결합체의 제조
실험에 사용한 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, Mn=2000 및 Mn=4600), 1,6-디이소시아네이토 헥사메틸렌(HDI), 디부틸틴 디라우레이트(DBTL), 무수 클로로포름, 무수 디클로로메탄(DCM), 1-(2-히드록시에틸) 피페라진(HP), 독소루비신 하이드로클로라이드 및 인산완충식염수(PBS)는 시그마-알드리치(Simga-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 입수한 그대로 사용하였다. 4-히드록실부틸 아크릴레이트(HBA)는 TCI Co. (Tokyo, Japan)로부터 구입하였으며, 입수한 그대로 사용하였다. NaOH, HCl, 디에틸 에테르 및 n-헥산은 Samchun Co. (Seoul, Korea)로부터 입수하였다. 모든 다른 시약들은 분석용을 사용하였으며, 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 1: PAEU 합성
PAEU는 이전 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기 반응식 3과 같이 합성하였다(D. S. Lee et al., Soft Matter, 2011, 7, 4974-4982). PAEU 합성 과정을 간략히 설명하면 하기와 같다.
[반응식 3]
Figure pat00014

먼저, 단량체 아미노 에스테르 디히드록실(HPB) 및 이의 공중합체를 합성하고 특징 분석을 수행하였다. 또 다른 단량체 HPB를 HP의 2차 아민기와 HBA의 비닐기 간의 미첼 부가반응으로 합성하였다(반응식 3). 상세한 반응은 다음과 같다: HP (20 mmol)를 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내 40 mL 무수 DCM 중에 상온에서 용해시켰다. 이어서, HBA (20 mmol)를 첨가하고 상기 플라스크를 2 시간 동안 일정하게 교반하면서 45℃ 오일-배쓰 내에 두었다. 상기 반응 용액을 진공 증발시켜 농축시키고 과량의 n-헥산 중에서 침전시켰다. 단량체 HPB를 여과하고 사용 전에 48 시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 합성된 단량체 HPB의 구조를 1H NMR로 확인하였다.
다중블록 공중합체 [PEG-PAEU]x는 촉매로서 DBTL의 존재 하에 클로로포름 내에서 HDI의 이소시아네이트기와 PEG 및 단량체 HPB 말단의 히드록실기의 부가반응(polyaddition)을 통해 합성하였다(반응식 3). [PEG-PAEU]x 공중합체 (PAEU-20-2)의 합성 과정은 다음과 같다: PEG (1 mmol) 및 0.002 g의 DBTL을 250 mL 2구 둥근 바닥 플라스크 내에서 2 시간 동안 100℃에서 진공 하에 건조시켰다. 온도를 60℃로 낮추고 단량체 HPB (12 mmol)를 첨가한 후 30분 동안 진공 하에 건조시켰다. 진공을 건조 질소로 대체하고 80 mL 무수 클로로포름을 첨가하였다. 반응물을 용해시킨 후, HDI (12 mmol)를 첨가하고 반응을 추가 3 시간 동안 60℃에서 계속하였다. 마지막으로, 반응 용액을 진공 증발시켜 농축시키고 과량의 디에틸 에테르 내에서 침전시켰다. 침전된 공중합체를 여과하고 48시간 동안 진공 하에 건조시켰다. 최종 수율은 대략 90%이었다. 공중합체의 분자량은 반응물의 공급 비 및 PEG의 분자량을 변경하여 조절하였다.
단계 2: 아크릴레이트화 PAEU 의 제조
아크릴레이트화 PAEU(acrylated PAEU, APAEU)는 상기 단계 1에서 합성된 PAEU로부터 하기와 같이 제조되었다.
간략하게 설명하면, PAEU는 아르곤 하에서 OH 기 대비 1.5:1 몰비의 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 및 트리에틸아민과 반응시켜 아크릴레이트화되었다. 상기 생성물을 얼음 냉각된 디에틸 에테르 내에서 침전시키고 최소 48시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 프로톤 NMR(1H NMR)을 사용하여 말단기 전환율(>90%)을 확인하고 최종 생성물의 순도를 확인하였다.
단계 3: PAEU - BSA 결합체의 합성
PAEU와 BSA의 결합은 이전 문헌에 기재된 방법을 변형하여 하기 반응식 4와 같이 수행하였다(L. Oss-Ronen, D. Seliktar, Acta Biomater. 2011, 7, 163).
[반응식 4]
Figure pat00015

상기 반응식 4에 나타낸 바와 같이, 8M 우레아를 포함하는 PBS 내 BSA(TCEP:알부민 시스테인의 몰비 2:1)의 7 mg/mL 용액에 TCEP-HCl을 첨가하였다. APAEU를 BSA 용액에 첨가하고 하룻밤 동안 상온에서 반응시켰다(APAEU:알부민 시스테인의 몰비 1:1). 상기 반응물을 아세톤 내에서 침전시키고, 8M 우레아를 포함하는 PBS에 다시 녹이고, 2일 동안 4℃에서 PBS로 투석(12-14 kDa MW cut-off, Spectrum, Gardena, CA)을 수행한 다음, 이후에 사용하기 전까지 동결건조시켜 결합체(PAEUBSA)를 얻었다.
실험예 3: 본 발명의 결합체의 특성 분석
상기 실시예 3에서 제조된 PAEU-BSA 결합체의 특성을 하기와 같이 분석하였다.
1) FT-IR 및 SDS-PAGE 분석
공중합체와 결합체는 FT-IR을 통해 특징 분석하였다.
결합체는 BSA 분자의 3421 cm-1에서 N-H 스트레칭 진동에 상응하는 주목할만한 흡수를 보여주었다. 각각 1656 cm-1과 1533 cm-1에서 나타난 흡수 밴드, 즉 아미드 I(AI, C=0 스트레칭 진동) 및 아미드 II(AII, C-N 스트레칭 진동과 N-H 벤딩 진동) 밴드는 전형적으로 단백질 특징 분석에 대한 특징적인 밴드로 인정되는 것들이다. 공중합체의 각각 HPB의 N-H 스트레칭, 우레탄의 C=O 스트레칭, HPB 방향족의 C-N 스트레칭 및 PEG의 C-O-C 스트레칭을 나타내는 3338, 1695, 1265 및 1101 cm-1에서 흡수가 나타났다. FT-IR 결과 이외에, 결합 형성은 SDS-PAGE를 통해서도 확인하였다. 그 결과, 공중합체와 BSA 간에 성공적인 결합 형성을 확인할 수 있었다.
2) pH 및 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동
수용액 중에서의 실시예 3에서 제조된 PAEU 공중합체의 졸-젤 상 전이 거동을 테스트 튜브 인버팅 방법(test tube inverting method)으로 측정하였다.
먼저, pH에 따른 졸-젤 상 전이거동은 각 샘플을 주어진 농도로 5 mL 바이알 튜브 내 pH 4의 PBS 중에 용해시킨 다음, 상기 용액의 pH를 NaOH와 HCl를 이용하여 원하는 값으로 조절하면서 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
또한, 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동은 대략 0.5 mL의 용액을 포함하는 바이알을 온도 조절된 워터 배쓰에 넣고, 2℃의 온도 간격으로 가열하고, 10분 동안 평형을 유지하는 방식으로 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
상기 실시예 3에서 제조된 PAEU 공중합체의 졸-젤 상 다이아그램을 도 11에 나타내었다.
도 11을 통해 알 수 있는 바와 같이, 실시예 3에서 제조된 PAEU 공중합체는 pH 및 온도에 따라 졸-젤 상 전이거동을 나타내었으며, 특히 생체 내 조건인 37℃ 및 pH 7.4의 조건에서 젤로 전환되는 것으로 확인되었다.
3) 시험관 내 및 생체 내 젤 분해 거동
상기 실시예 3에서 제조된 PAEU 공중합체의 시험관 내 및 생체 내 젤 분해 거동을 분석하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 통해 알 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 3에서 제조된 PAEU 공중합체는 시험관 내 및 생체 내에서 1달 이상 완전히 분해되지 않고 남아 있을 수 있음을 알 수 있다.
4) 생체 내 방출
생체 내 라이소자임 방출을 조사하기 위하여, 250 ㎕의 라이소자임이 로딩된 샘플 용액을 수컷 SD 래트(그룹당 3마리)에 주사하였다. 미리 정해진 시간에, 혈액샘플을 꼬리 혈관으로부터 모았고, 원심분리하여 혈청을 얻은 다음 분석 전까지 -21℃에 보관하였다. 혈청 내 라이소자임 농도는 상업적인 라이소자임 (LZM) ELISA 키트(Cusabio, China)를 사용하여 측정하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 통해 알 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 3에서 제조된 PAEU-BSA 결합체는 PAEU 공중합체에 비해 라이소자임의 초기과다방출을 낮추고 2주 이상 라이소자임의 방출을 지속하였다.
실시예 4: PAEU - BSA 결합체의 제조
단계 1: PAEU 합성
PAEU는 이전 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기 반응식 5와 같이 합성하였다(D. S. Lee et al., Soft Matter, 2011, 7, 4974-4982). PAEU 합성 과정을 간략히 설명하면 하기와 같다.
[반응식 5]
Figure pat00016

TMDP의 2차 아민기와 HBA의 비닐기 간의 미첼 부가반응으로 합성하였다(반응식 5). 상세한 반응은 다음과 같다.
먼저, TMDP (40 mmol)를 250 mL 둥근 바닥 플라스크 내 40 mL 무수 DCM 중에 상온에서 용해시켰다. 이어서, HBA (20 mmol)를 첨가하고 상기 플라스크를 2 시간 동안 일정하게 교반하면서 45℃ 오일-배쓰 내에 두었다. 상기 반응 용액을 진공 증발시켜 농축시키고 과량의 n-헥산 중에서 침전시켜 단량체 BTB를 얻었다. 둥근바닥 플라스크에 폴리에틸렌글리콜(2mmol)과 촉매인 디부틸틴 디아우레이트 0.002 g을 반응기에 넣고 수분을 제거하기 위하여 100℃에서 2시간 동안 진공 건조시켰다. 플라스크 온도를 50℃까지 떨어뜨린 후에, BTB(20mmol)를 첨가한 후에 진공 하에서 30분간 건조하였다. 진공을 파기시키면서 질소를 넣은 후에 80 ㎖의 무수클로로포름을 첨가하여 반응물을 완전히 용해시킨 후 1,6-헥사메틸렌 다이이소시아네이트(HDI)(21mmol)를 첨가하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후 반응온도를 60℃까지 올려서 3시간 동안 우레탄 반응을 시켰다. 제조된 생성물을 상온으로 냉각시킨 후 미반응물을 제거하기 위해 과량의 에틸에테르에 침전시킨 후 여과하여 폴리에틸렌글리콜-폴리(아미노우레탄) 다중블록 공중합체를 수득하였다.
단계 2: 아크릴레이트화 PAEU 의 제조
아크릴레이트화 PAEU(acrylated PAEU, APAEU)는 상기 단계 1에서 합성된 PAEU로부터 하기와 같이 제조되었다.
간략하게 설명하면, PAEU는 아르곤 하에서 OH 기 대비 1.5:1 몰비의 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 및 트리에틸아민과 반응시켜 아크릴레이트화되었다. 상기 생성물을 얼음 냉각된 디에틸 에테르 내에서 침전시키고 최소 48시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. 프로톤 NMR(1H NMR)을 사용하여 말단기 전환율(>90%)을 확인하고 최종 생성물의 순도를 확인하였다.
단계 3: PAEU - BSA 결합체의 합성
PAEU와 BSA의 결합은 이전 문헌에 기재된 방법을 변형하여 하기 반응식 6과 같이 수행하였다(L. Oss-Ronen, D. Seliktar, Acta Biomater. 2011, 7, 163).
[반응식 6]
Figure pat00017

상기 반응식 6에 나타낸 바와 같이, 8M 우레아를 포함하는 PBS 내 BSA(TCEP:알부민 시스테인의 몰비 2:1)의 7 mg/mL 용액에 TCEP-HCl을 첨가하였다. APAEU를 BSA 용액에 첨가하고 하룻밤 동안 상온에서 반응시켰다(APAEU:알부민 시스테인의 몰비 1:1). 상기 반응물을 아세톤 내에서 침전시키고, 8M 우레아를 포함하는 PBS에 다시 녹이고, 2일 동안 4℃에서 PBS로 투석(12-14 kDa MW cut-off, Spectrum, Gardena, CA)을 수행한 다음, 이후에 사용하기 전까지 동결건조시켜 결합체(PAEUBSA)를 얻었다.
실험예 4: 본 발명의 결합체의 특성 분석
상기 실시예 4에서 제조된 PAEU-BSA 결합체의 특성을 하기와 같이 분석하였다.
1) FT-IR 및 SDS-PAGE 분석
공중합체와 결합체는 FT-IR을 통해 특징 분석하였다.
결합체는 BSA 분자의 3421 cm-1에서 N-H 스트레칭 진동에 상응하는 주목할만한 흡수를 보여주었다. 각각 1656 cm-1과 1533 cm-1에서 나타난 흡수 밴드, 즉 아미드 I(AI, C=0 스트레칭 진동) 및 아미드 II(AII, C-N 스트레칭 진동과 N-H 벤딩 진동) 밴드는 전형적으로 단백질 특징 분석에 대한 특징적인 밴드로 인정되는 것들이다. 공중합체의 각각 HPB의 N-H 스트레칭, 우레탄의 C=O 스트레칭, HPB 방향족의 C-N 스트레칭 및 PEG의 C-O-C 스트레칭을 나타내는 3338, 1695, 1265 및 1101 cm-1에서 흡수가 나타났다. FT-IR 결과 이외에, 결합 형성은 SDS-PAGE를 통해서도 확인하였다. 그 결과, 공중합체와 BSA 간에 성공적인 결합 형성을 확인할 수 있었다.
2) pH 및 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동
수용액 중에서의 PAEU와 PAEUBSA 결합체의 졸-젤 상 전이 거동을 테스트 튜브 인버팅 방법(test tube inverting method)으로 측정하였다.
먼저, pH에 따른 졸-젤 상 전이거동은 각 샘플을 주어진 농도로 5 mL 바이알 튜브 내 pH 4의 PBS 중에 용해시킨 다음, 상기 용액의 pH를 NaOH와 HCl를 이용하여 원하는 값으로 조절하면서 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
또한, 온도에 따른 졸-젤 상 전이거동은 대략 0.5 mL의 용액을 포함하는 바이알을 온도 조절된 워터 배쓰에 넣고, 2℃의 온도 간격으로 가열하고, 10분 동안 평형을 유지하는 방식으로 측정하였다. 졸-젤 전이는 바이알을 뒤집었을 때 샘플이 흐르지 않는 것으로 확인하였다.
그 결과, pH 및 온도에 따라 졸-젤 상 전이거동을 나타내었으며, 특히 생체 내 조건인 37℃ 및 pH 7.4의 조건에서 젤로 전환되는 것으로 확인되었다(데이터 미도시).
3) 시험관 내 및 생체 내 젤 분해 거동
상기 실시예 4에서 제조된 PAEU 공중합체의 시험관 내 및 생체 내 젤 분해 거동을 분석하였다.
그 결과, 상기 실시예 4에서 제조된 PAEU 공중합체는 시험관 내 및 생체 내에서 1달 이상 완전히 분해되지 않고 남아 있을 수 있음을 알 수 있었다(데이터 미도시).
4) 생체 내 방출
생체 내 라이소자임 방출을 조사하기 위하여, 250 ㎕의 라이소자임이 로딩된 샘플 용액을 수컷 SD 래트(그룹당 3마리)에 주사하였다. 미리 정해진 시간에, 혈액샘플을 꼬리 혈관으로부터 모았고, 원심분리하여 혈청을 얻은 다음 분석 전까지 -21℃에 보관하였다. 혈청 내 라이소자임 농도는 상업적인 라이소자임 (LZM) ELISA 키트(Cusabio, China)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 상기 실시예 4에서 제조된 PAEU-BSA 결합체는 라이소자임의 초기과다방출을 낮추고 2주 이상 라이소자임의 방출을 지속하였다(데이터 미도시).

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 다중블록 공중합체가 알부민과 결합되어 형성되는 결합체:
    [화학식 1]
    Figure pat00018

    상기 식에서,
    A는
    Figure pat00019
    또는
    Figure pat00020
    이고,
    n1은 5 내지 50의 정수이고,
    n2는 2 내지 8의 정수이고,
    n3는 1 내지 10의 정수이고,
    n4는 1 내지 10의 정수이고,
    p1은 0 또는 1이고,
    p2는 0 또는 1이고,
    m은 2 내지 6의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 n2는 6인 것을 특징으로 하는 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 n3는 2인 것을 특징으로 하는 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다중블록 공중합체와 알부민 간의 결합은 상기 다중블록 공중합체의 폴리에틸렌글리콜 블록의 말단이 아크릴로일(acryloyl) 기의 카보닐 부분과 결합하고 상기 아크릴로일 기의 비닐 부분이 환원된 알부민 표면의 티올기와 결합하여 단일 결합을 형성함으로써 하기 화학식 5로 표시되는 링커 부분을 형성함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 결합체:
    [화학식 5]

  5. 제1항에 있어서, 상기 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 몰비는 1:1 내지 10인 것을 특징으로 하는 결합체.
  6. 하기 단계를 포함하는 제1항의 결합체의 제조방법:
    하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 4로 표시되는 화합물을 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 반복 단위를 가지는 수평균 분자량 10,000 g/mol 내지 25,000 g/mol의 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 1);
    상기 다중블록 공중합체 및 아크릴로일 할로겐화물을 반응시켜 아크릴레이트화 다중블록 공중합체를 제조하는 단계(단계 2); 및
    알부민을 티올(thiol) 환원제와 반응시킨 다음 상기 아크릴레이트화 다중블록 공중합체와 반응시키는 단계(단계 3):
    [화학식 1]
    Figure pat00022

    [화학식 2]
    Figure pat00023

    [화학식 3]
    Figure pat00024

    [화학식 4]
    Figure pat00025

    상기 식에서,
    A는
    Figure pat00026
    또는
    Figure pat00027
    이고,
    n1은 5 내지 50의 정수이고,
    n2는 2 내지 8의 정수이고,
    n3는 1 내지 10의 정수이고,
    n4는 1 내지 10의 정수이고,
    p1은 0 또는 1이고,
    p2는 0 또는 1이고,
    m은 2 내지 6의 정수이다.
  7. 제6항에 있어서, 상기 반응은 디부틸틴 디라우레이트, 옥토산 주석, 염화주석, 산화철, 알루미늄 트리이소프로폭사이드, CaH2, Zn 및 염화리튬으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 촉매 하에 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 몰비는 1:5:10 내지 1:10:15인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 단계 1)의 반응은 40℃ 내지 80℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 단계 3)에서 아크릴레이트화 다중블록 공중합체 및 알부민 내 시스테인의 반응 몰비는 1:1 내지 10인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 결합체를 포함하는 서방성 약물 전달체.
  12. 제11항에 있어서, 약물로서 파클리탁솔, 독소루비신, 도세탁솔, 클로로람부실, 인슐린, 엑센딘-4, 인체성장호르몬, 에리트로포이에틴, 조혈성장인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), GM-CSF(granulocyte-macrophage stimulating factor), 라이소자임, 소혈청 알부민, 항균제, 스테로이드류, 소염진통제, 성호르몬, 면역 억제제, 항바이러스제, 마취제, 항구토제 또는 항히스타민제를 포함하는 서방성 약물 전달체.
  13. 제11항에 있어서, 주사용 하이드로젤 형태인 서방성 약물 전달체.
  14. 제11항에 있어서, 2주 내지 5주 동안 약물 방출이 유지되는 서방성 약물 전달체.
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