CN115991669A - 一类用于蛋白质半胱氨酸残基修饰的含氟标签及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白质修饰技术领域，具体公开了一类用于蛋白质半胱氨酸残基修饰的含氟标签及应用。本发明利用砜基化合物与巯基的特异性反应构建了水溶性19F标签，该标签能够在温和条件下实现半胱氨酸残基的修饰，形成稳定的碳硫键，标记的蛋白质有效地降低了蛋白质的核磁共振检测浓度，并且可以用于细胞内的研究。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质化学修饰技术领域，具体涉及到利用砜基含氟化合物特异性地与蛋白质中的巯基反应，利用核磁共振进行多肽或蛋白质结构、动态及相互作用的研究。
背景技术
生物体内几乎不含游离的氟元素，因此氟标记的蛋白质(或多肽)能够在没有背景干扰的情况下进行检测。目前，氟代氨基酸(前体)的生物合成仍然是获取氟标蛋白质的有效方法。但是多氟标记可能影响蛋白质的折叠过程、表达效率或稳定性等。位点特异性化学标记可以作为生物标记的有利补充，能够为难以重组表达、分子量超大或复杂系统的蛋白质提供有力标记工具。
但是目前用于19F化学标记的标签仍然存在一些问题，一方面这些化合物难以修饰，基本上属于脂溶性，需要大大过量或加入有机溶剂促溶才能实现高效连接；另一方面，蛋白质与标签形成的化学键在细胞环境下不稳定或形成异构体，影响信号归属。针对上述问题，本发明利用砜基与巯基的特异性反应，设计了含氟标签，既能够与蛋白质在温和的条件下实现高效率的连接，又可以通过离去基团的改造，构建水溶性的标签。结果显示，标记的蛋白质有效地降低了蛋白质的核磁共振检测浓度，并且可以用于细胞内的研究。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一类用于蛋白质半胱氨酸残基修饰的含氟标签及应用，利用砜基化合物与巯基的特异性反应构建了水溶性19F标签，该标签能够在温和条件下实现半胱氨酸残基的修饰，形成稳定的碳硫键，标记的蛋白质有效地降低了蛋白质的核磁共振检测浓度，并且可以用于细胞内的研究。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
含氟标签，具有如下结构：
其中，
为含三氟甲基单元的拉电子芳香环，包括：
所述标签的具体结构如下：
上述含氟标签在多肽或蛋白质标记中的应用：所述多肽或蛋白质含有半胱氨酸，含氟标签与半胱氨酸残基反应形成稳定的碳硫键，标记后的多肽或蛋白质能够用于氟-19核磁共振(19F NMR)研究。在本发明的具体实施例中，将含氟标签(标签1-4)对GB1蛋白质(链球菌的免疫G蛋白B1结构域)进行标记，通过质谱Q-TOF发现4个标签与GB1蛋白质的连接效率接近100％，尤其是标签1含有六个等价氟原子，比其它标签的信号增强能力更大，并验证了标签1在其它蛋白质标记中的普适性(钙调蛋白，CaM；泛素蛋白，UBQ；麦芽糖结合蛋白，MBP)，还可用于细胞内蛋白质的检测。
上述含氟标签在含巯基的小分子标记中的应用：含氟标签可与巯基发生反应，氟的化学位移发生变化。在本发明的具体实施例中，含氟标签(标签1-4)与谷胱甘肽反应，通过核磁氟谱可用于含巯基的小分子的检测。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明可以实现含氟标签水溶性的改造，避免标记过程中有机试剂或大量标记试剂对蛋白质结构造成影响；能够在温和条件下实现半胱氨酸残基的修饰，形成稳定的碳硫键；能够实现哺乳动物细胞内蛋白质的观测，将其检测浓度降低至微摩尔及以下，接近生理浓度。
附图说明
图1为标签1-4与谷胱甘肽(GSH)的反应速度比较。
图2为标签1-4与GSH反应之后的19F NMR谱。
图3为标签1-4与GB1蛋白质反应之后的质谱图。
图4为同时经3-氟酪氨酸生物标记和标签1-4化学标记的GB1蛋白质在缓冲溶液中19F NMR谱。
图5为经标签1标记的GB1、CaM、UBQ和MBP在缓冲溶液中的19F NMR谱。
图6为经标签1标记的GB1、CaM、UBQ和MBP在HeLa细胞中的19F NMR谱。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合水溶性含氟标签的合成、验证及应用对本发明的内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
本发明实施例中所用的原料可以由市场购得，或可用本领域已知的方法合成得到。
实施例1：水溶性含氟标签构建
标签结构如下
标签1的合成
步骤一：在氮气保护下，将4-甲苯亚磺酸钠(TolSO2Na,227mg,1.27mmol)，化合物4-溴-2,6-双(三氟甲基)吡啶(A1,250mg,0.85mmol)和四丁基溴化铵(Bu4NBr,82mg,0.26mmol)溶于4mL N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水30mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱(洗脱剂：二氯甲烷)分离纯化，真空干燥，得到中间体B1(300mg，产率：95.6％)。中间体B1的表征数据：1H NMR(CDCl3,600MHz)δ(ppm):8.29(s,2H),7.90(d,2H,J＝8.4Hz),7.43(d,2H,J＝8.4Hz),2.47(s,3H)；13C NMR(CDCl3,150MHz)δ(ppm):154.73,150.50(q,JCF＝37.1Hz),146.86,134.99,130.88,128.60,120.09(q,JCF＝273.9Hz),120.64,21.79；19F NMR(CDCl3,564MHz)δ(ppm):-67.91(s,6F)。
步骤二：在氮气保护下，将化合物B1(280mg,0.76mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(NBS,148mg,0.83mmol)和过氧化二苯甲酰(BPO,9mg,0.04mmol)溶解在5mL四氯化碳中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，向反应液中加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸溶剂得到粗产品。粗产品快速柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚＝2:1)，得到含原料及目标产物C1的混合物，未进行纯化，直接用于下一步反应。
步骤三：在氮气保护下，将上述混合物和无水吡啶(120mg,1.52mmol)溶解在5mL乙腈中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，冷却到室温，旋蒸溶剂得到粗产品。将粗产品溶于尽可能少的甲醇中，并加入大量乙醚使产品析出，抽滤，并用乙醚洗涤数次，得到淡黄色标签1(210mg,步骤二、三的两步产率：52.4％)。标签1的表征数据：1H NMR(MeOD-d4,600MHz)δ(ppm):9.10(s,br,2H),8.67(t,1H,J＝7.8Hz),8.59(s,2H),8.25(d,2H,J＝8.4Hz),8.16(s,br,2H),7.76(s,br,2H),6.01(s,2H)；13C NMR(MeOD-d4,150MHz)δ(ppm):155.55,151.39(q,JCF＝37.1Hz),147.80,146.48,141.93,141.14(s,br),131.56(s,br),131.03,129.97,122.82,120.17(q,JCF＝272.9Hz),64.49；19F NMR(MeOD-d4,564MHz)δ(ppm):-71.02(s,6F)。
标签2的合成
步骤一：在氮气保护下，将4-甲苯亚磺酸钠(345mg,1.94mmol)，化合物2-氯-6-三氟甲基烟腈(A2,200mg,0.97mmol)和四丁基溴化铵(94mg,0.29mmol)溶于3mL N,N-二甲基乙酰胺，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水30mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱(洗脱剂：二氯甲烷)分离纯化，真空干燥，得到中间体B2(137mg，产率：43.4％)。中间体B2的表征数据：1H NMR(CDCl3,600MHz)δ(ppm):8.40(d,1H,J＝7.8Hz),8.05(d,2H,J＝8.4Hz),7.94(d,1H,J＝8.4Hz),7.41(d,2H,J＝8.4Hz),2.46(s,3H)；13C NMR(CDCl3,150MHz)δ(ppm):160.98,150.32(q,JCF＝37.4Hz),146.77,145.76,133.71,130.31,130.03,123.07,119.92(q,JCF＝274.2Hz),113.08,110.96,21.97；19F NMR(CDCl3,564MHz)δ(ppm):-68.32(s,3F)。
步骤二：在氮气保护下，将化合物B2(130mg,0.40mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(78mg,0.44mmol)和过氧化二苯甲酰(5mg,0.02mmol)溶解在5mL四氯化碳中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，向反应液中加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸溶剂得到粗产品。粗产品快速柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚＝2:1)，得到含原料及目标产物C2的混合物，未进行纯化，直接用于下一步反应。
步骤三：在氮气保护下，将上述混合物和无水吡啶(63mg,0.8mmol)溶解在4mL乙腈中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，冷却到室温，旋蒸溶剂得到粗产品。将粗产品溶于尽可能少的甲醇中，并加入大量乙醚使产品析出，抽滤，并用乙醚洗涤数次，得到淡黄色标签2(85mg,步骤二、三的两步产率：43.9％)。标签2的表征数据：1H NMR(MeOD-d4,500MHz)δ(ppm):9.21(d,2H,J＝5.8Hz),8.79(d,1H,J＝8.1Hz),8.70(t,1H,J＝7.8Hz),8.26(d,1H,J＝8.1Hz),8.21(m,2H),8.14(d,2H,J＝8.1Hz),7.86(d,2H,J＝8.1Hz),6.13(s,2H)；13C NMR(MeOD-d4,126MHz)δ(ppm):160.40,150.49(q,J＝37.0Hz),148.81,147.80,146.44,142.03,139.14,131.73,131.11,130.01,125.58,121.36(q,J＝274.6Hz),114.18,112.00,64.49；19F NMR(MeOD-d4,471MHz)δ(ppm):-69.73(s,3F)。
标签3的合成
步骤一：在氮气保护下，将4-甲苯亚磺酸钠(296mg,1.66mmol)，化合物2-三氟甲基-4-溴吡啶(A3,250mg,1.11mmol)和四丁基溴化铵(107mg,0.33mmol)溶于3mL N,N-二甲基乙酰胺，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水30mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱(洗脱剂：二氯甲烷)分离纯化，真空干燥，得到中间体B3(330mg，产率：98.7％)。中间体B3的表征数据：1H NMR(CDCl3,500MHz)δ(ppm):8.92(d,1H,J＝4.8Hz),8.11(s,1H),7.96(d,1H,J＝4.6Hz),7.87(d,2H,J＝8.1Hz),7.39(d,2H,J＝8.0Hz),2.45(s,3H)；13C NMR(CDCl3,126MHz)δ(ppm):152.53,151.85,150.18(q,J＝36.0Hz),146.42,136.11,130.86,128.68,123.76,121.02(q,J＝274.8Hz),117.99(q,J＝2.8Hz),22.01；19F NMR(CDCl3,471MHz)δ(ppm):-69.99(s,3F)。
步骤二：在氮气保护下，将化合物B3(250mg,0.83mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(162mg,0.91mmol)和过氧化二苯甲酰(10mg,0.04mmol)溶解在5mL四氯化碳中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，向反应液中加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸溶剂得到粗产品。粗产品快速柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚＝2:1)，得到含原料及目标产物C3的混合物，未进行纯化，直接用于下一步反应。
步骤三：在氮气保护下，将上述混合物和无水吡啶(131mg,1.66mmol)溶解在3mL乙腈中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，冷却到室温，旋蒸溶剂得到粗产品。将粗产品溶于尽可能少的甲醇中，并加入大量乙醚使产品析出，抽滤，并用乙醚洗涤数次，得到淡黄色标签3(169mg,步骤二、三的两步产率：44.4％)。标签3的表征数据：1H NMR(MeOD-d4,600MHz)δ(ppm):9.10(d,2H,J＝5.9Hz),8.99(d,1H,J＝5.0Hz),8.65(t,1H,J＝7.8Hz),8.26(s,1H),8.17(m,5H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H),6.01(s,2H)；13C NMR(MeOD-d4,150MHz)δ(ppm):153.50,152.95,150.72(q,JCF＝36.2Hz),147.78,146.47,141.76,141.55,131.46,130.68,129.97,125.72,122.26(q,JCF＝273.7Hz),118.92,64.50；19F NMR(MeOD-d4,564MHz)δ(ppm):-69.54(s,3F)。
标签4的合成
步骤一：在氮气保护下，将4-甲苯亚磺酸钠(388mg,2.18mmol)，4-溴-2,8-二(三氟甲基)喹啉(A4，500mg,1.45mmol)和四丁基溴化铵(140mg,0.44mmol)溶于5mL N,N-二甲基乙酰胺，并在100℃的条件下搅拌(600转/分钟)20小时。反应液冷却至室温后缓慢加入去离子水30mL，抽滤，并用水洗涤3次得到产品。产品进一步用硅胶色谱柱(洗脱剂：二氯甲烷)分离纯化，真空干燥，得到中间体B4(500mg，产率：82.2％)。中间体B4的表征数据：1H NMR(CDCl3,600MHz)δ(ppm):8.99(d,1H,J＝8.7Hz),8.54(s,1H),8.23(d,1H,J＝7.2Hz),7.90(d,2H,J＝8.2Hz),7.85(t,1H,J＝8.0Hz),7.37(d,2H,J＝8.1Hz),2.42(s,3H)；13C NMR(CDCl3,150MHz)δ(ppm):148.58,148.41(q,JCF＝37.2Hz),146.26,145.00,136.25,130.63,130.09(q,JCF＝5.3Hz),129.97(q,JCF＝30.6Hz),129.62,128.66,128.37,123.73,123.17(q,JCF＝274.3Hz),120.68(q,JCF＝274.4Hz),118.05,21.82；19F NMR(CDCl3,564MHz)δ(ppm):-60.29(s,3F),-67.79(s,3F)。
步骤二：在氮气保护下，将化合物B4(300mg,0.72mmol)，N-溴代丁二酰亚胺(140mg,0.79mmol)和过氧化二苯甲酰(9mg,0.04mmol)溶解在5mL四氯化碳中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，向反应液中加入饱和食盐水，用二氯甲烷萃取，收集有机相并用无水硫酸钠干燥，旋蒸溶剂得到粗产品。粗产品快速柱层析(洗脱剂：二氯甲烷/石油醚＝2:1)，得到含原料及目标产物C4的混合物，未进行纯化，直接用于下一步反应。
步骤三：在氮气保护下，将上述混合物和无水吡啶(114mg,1.44mmol)溶解在5mL乙腈中，并搅拌(600转/分钟)回流过夜。反应结束后，冷却到室温，旋蒸溶剂得到粗产品。将粗产品溶于尽可能少的甲醇中，并加入大量乙醚使产品析出，抽滤，并用乙醚洗涤数次，得到棕色固体标签4(88mg,步骤二、三的两步产率：21.2％)。标签4的表征数据：1H NMR(MeOD-d4,600MHz)δ(ppm):9.11(d,2H,J＝5.1Hz,),8.99(d,1H,J＝8.7Hz),8.68(s,1H),8.63(t,1H,J＝7.8Hz),8.34(d,1H,J＝7.2Hz),8.21(d,2H,J＝8.3Hz),8.14(m,2H),8.00(t,1H,J＝8.0Hz),7.76(d,2H,J＝7.9Hz,),6.02(s,2H)；13C NMR(MeOD-d4,150MHz)δ(ppm):149.21(q,JCF＝36.4Hz),148.99,1 47.72,146.44,145.89,141.73,141.61,131.70(q,JCF＝5.3Hz),131.59,131.44,130.49,130.36(q,JCF＝31.6Hz),129.93,129.74,124.73,124.55(q,JCF＝271.6.4Hz),122.00(q,JCF＝273.5Hz),119.64,64.30；19F NMR(MeOD-d4,564MHz)δ(ppm):-61.50(s,3F),-69.28(s,3F)。
实施例2：含氟标签与硫醇的反应
实验以谷胱甘肽为例，验证了其反应活性。室温下，将谷胱甘肽(GSH)分别与标签1-4快速混合于磷酸缓冲溶液(pH＝7.4，含10％重水)，谷胱甘肽与标签的浓度分别为10.0mM和1.0mM，将反应液立即放入核磁共振波谱仪，采集核磁氟谱，并记录时间。根据标签积分强度的变化，比较标签的反应活性。结果如图1所示，说明这些标签可以与巯基发生反应，但是其活性各不相同。在此条件下的反应速率为：标签2≈标签4>标签1>标签3。标签在反应前后，氟的化学位移发生变化，说明标签1-4可以用于多肽或小分子硫醇检测，结果如图2所示(混合后180分钟的谱图)。
实施例3含氟标签标记GB1蛋白质
实验以模型蛋白质GB1(T11C)为例。室温下，将经过3-氟酪氨酸生物标记的蛋白质分别与标签1-4混合于Tris缓冲溶液中(pH＝7.4)，蛋白质与标签的浓度分别为0.1mM和0.3mM，反应过夜。混合液经过5次超滤离心，除去标签及其它小分子。通过质谱Q-TOF可以看出，几乎无法观察到未反应GB1的分子离子峰，说明所有标签的连接效率接近100％，结果如图3所示(蛋白质带多个电荷，计算结果及预测值已标识)。将经标记的GB1采集氟谱，结果如图4所示，说明这些标签可以与蛋白质反应，并且与3-氟酪氨酸生物标记相比，信号强度明显增强。
实施例4含氟标签1标记GB1、CaM、UBQ和MBP
从蛋白质信号增强的角度看，标签1含有六个等价氟原子，比其它标签的信号增强能力更大，因此以标签1作为示例。室温下将含有突变半胱氨酸的蛋白质(链球菌的免疫G蛋白B1结构域GB1、钙调蛋白CaM，泛素蛋白UBQ，麦芽糖结合蛋白MBP)分别与标签1混合于Tris缓冲溶液中(pH＝7.4)，蛋白质与标签的浓度分别为0.1mM和0.3mM，反应过夜。混合液经过多次超滤离心，除去标签及其它小分子，采集氟谱，结果如图5所示，说明标签1可以适用于不同分子量的蛋白质标记。
实施例5标签1可用于细胞内蛋白质的检测
实施例4中的蛋白质经过标签1标记后，通过电穿孔介导蛋白质进入细胞的方法，导入到HeLa细胞中。具体方法如下：将HeLa细胞用0.25％的胰蛋白酶消化洗脱，室温下200×g离心5分钟收集，并用PBS缓冲溶液洗涤1次。将目标蛋白质溶解在用于电穿孔的缓冲溶液EPB(100mM Na3PO4,5mM KCl,15mM MgCl2,15mM HEPES,5mM ATP,5mM GSH,pH 7.0)中，最终浓度在0.3-0.6mM。将约4×107细胞浓悬浮在100μL上述含目标蛋白质的EPB缓冲溶液中，并转移至100μL的电穿孔池(型号为NucleocuvetteTM Vessel)中，采用电穿孔仪器(型号为Amaxa 4D-Nucleofector)的CN114程序进行蛋白质转移，一般需要3-4次电击。其后将细胞转移至含2mL细胞培养基的培养皿中，恢复培养5小时左右。再次将已贴壁的细胞用PBS洗涤3次，用0.125％的胰蛋白酶消化洗脱，室温下200×g离心5分钟，收集细胞，并用PBS缓冲溶液洗涤1次。将细胞再次悬浮在用于核磁信号采集的培养基(5mM HEPES，pH 7.2，90mM D-葡萄糖,10％D2O)300μL中。采集其19F NMR谱，结果如图6所示，说明标签1与蛋白质的连接方式稳定，可以用于细胞内蛋白质的检测。通过加入含氟内标(3-氟酪氨酸)，对比积分强度确认蛋白质在细胞内的浓度在0.5-3μM之间，与其生理浓度相当。
Claims (3)
1.含氟标签，其特征在于，具有如下结构：
其中，
为含三氟甲基单元的拉电子芳香环，包括：
2.权利要求1所述含氟标签在多肽或蛋白质标记中的应用，其特征在于，所述多肽或蛋白质含有半胱氨酸。
3.权利要求1所述含氟标签在含巯基的小分子标记中的应用。
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2022
- 2022-04-15 CN CN202210402758.2A patent/CN115991669A/zh active Pending
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