CN115990173A - 人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物及调节结肠癌肠道菌群药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物及调节结肠癌肠道菌群药物中的应用。人参皂苷Rh1能有效抑制结肠肿瘤生长；能降低肿瘤浸润Treg细胞比例，增加CD8+效应性T细胞比例，激活结肠癌T细胞免疫效应；能调节结肠癌肠道菌群丰富度及多样性，减少有害菌，增加有益菌。因此，人参皂苷Rh1能够用于制备结肠癌免疫治疗药物；制备改善与调节结肠癌肠道菌群的药物。

Description

人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物及调节结肠癌肠道菌群药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物及调节结肠癌肠道菌群药物中的应用。

背景技术

结肠癌的死亡率位居全球第二位，男性发病率高于女性。近年来，结肠癌在中国发病率呈上升趋势，病死率位列第五。结肠癌的治疗包括外科手术、肠镜、化疗、免疫治疗等。结肠癌常用的化疗药物包括5-氟尿嘧啶、奥沙利铂等，免疫治疗用药有人血管内皮生长的单克隆抗体与PD-1单抗等。但化疗药物对患者副作用大，费用高昂。结肠癌患者对免疫治疗的应答率很低。因此，寻找新的高效低毒的结肠癌免疫药物显得尤为重要。

中药是中医治病的物质基础，在治疗癌症中有多靶点，不易产生耐药性等诸多优势。人参是五加科植物人参的干燥根，为我国特产珍贵药材之一，有悠久的用药历史和极高的药用价值。人参主要化学成分包括人参皂苷、人参多糖、挥发油等。人参皂苷Rh1为人参的精华成分之一，已被证实对哮喘、过敏性皮炎、糖皮质激素抵抗、脑缺血、软骨退变等均有治疗作用(中国专利CN1883491)，并有较好的抗疲劳作用(王学芳，基于代谢组学的人参皂苷Rh1的抗疲劳研究[D]，青岛大学，2020)。

目前已有人参皂苷Rh1对乳腺癌(Jin Y.,et al，Ginsenoside Rh1 inhibitstumor growth in MDA-MB-231 breast cancer cells via mitochondrial ROS and ERstress-mediated signaling pathway.Archives of pharmacal research,2022,45(3),174–184)、胃癌(Yang Z.,et al,Ginsenoside Rh1 regulates gastric cancer cellbiological behaviours and transplanted tumour growth in nude mice via theTGF-β/Smad pathway.Clinical and experimental pharmacology&physiology,2022,49(12),1270–1280)和肺癌(Mathiyalagan R.,et al,Preparation of PolyethyleneGlycol-Ginsenoside Rh1 and Rh2 Conjugates and Their Efficacy against LungCancer and Inflammation.Molecules(Basel,Switzerland),2022,24(23),4367.7)的治疗作用的报导，但上述研究均未就人参皂苷Rh1对肿瘤的免疫调节情况进行过评估。

目前，亦未见人参皂苷Rh1对结肠癌免疫治疗作用及应用价值的研究，人参皂苷Rh1对结肠癌的免疫治疗作用，以及口服后对结肠癌的肠道菌群的调节作用并不清楚。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物及调节结肠癌肠道菌群药物中的应用。人参皂苷Rh1能抑制结肠肿瘤生长；能降低Treg细胞比例，增加CD8+T细胞比例，激活结肠癌T细胞免疫效应；能调节结肠癌肠道菌群，减少有害菌，增加有益菌。

目前尚无人参皂苷Rh1对免疫调节的报导，因此本发明评估了肿瘤部位的免疫情况，Treg细胞在肿瘤组织中，可通过免疫抑制作用，使机体对肿瘤细胞产生抗原耐受，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。且可以在各种免疫细胞亚群中通过细胞间接触和分泌抑制性细胞因子，对机体的免疫反应起到负性调节作用，抑制机体免疫反应。CD8+T细胞为公认的主要抗肿瘤免疫效应性细胞，可专一辨识肿瘤相关抗原，与肿瘤细胞结合后产生穿孔素与其他细胞毒素，且肿瘤组织中高丰度的CD8+T细胞是良好的预后指标。本发明通过这两种细胞的比例来评估免疫情况。

本发明针对人参皂苷Rh1在结肠癌免疫治疗及结肠癌肠道菌群调节领域新的应用，扩大我国中药在结肠癌免疫调节领域的应用。特别研究了人参皂苷Rh1对结肠肿瘤的Treg细胞及CD8+T细胞的干预作用，以及调节结肠癌肠道微生物平衡，增加有益肠道微生物的含量，减少有害微生物的含量，从而对机体起到保护作用。具体的说，本发明所述的人参皂苷Rh1是在制备结肠癌免疫治疗药物中的应用；是在制备改善与调节结肠癌肠道菌群的药物中的应用。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物中的应用。

所述人参皂苷Rh1降低肿瘤浸润和结肠Treg细胞的比例，促进CD8+T细胞活化增殖。

所述人参皂苷Rh1降低肿瘤浸润的巨噬细胞，减少炎症因子的产生。

所述炎症因子包括IL-6、TNF-α。

本发明还提供了一种人参皂苷Rh1在制备调节结肠癌肠道菌群药物中的应用。

所述肠道菌群中的微生物包括脱铁杆菌属Mucispirillum，阿克曼菌属Akkermansia、拟杆菌属Muribaculaceae。

所述人参皂苷Rh1能够降低有害菌脱铁杆菌属Mucispirillum，增加有益菌阿克曼菌属Akkermansia、拟杆菌属Muribaculaceae。

所述药物包括人参皂苷Rh1及药学上可接受的辅料。

常用的药学上可接受的辅料包括稀释剂、表面活性剂、润滑剂、抗氧剂、粘合剂、着色剂、乳化剂等。

所述药物的剂型包括颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、注射剂或输液剂。

可以改变本发明的药物中活性成分的实际剂量水平以获得对特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗响应、对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于多种因素，包括所用的具体的本发明的药物的活性、施用途径、施用时间、所用的具体组合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况和既往病史以及医学领域中公知的类似因素。

有益效果：

本发明所述人参皂苷Rh1能作为活性成分，应用于结肠癌的免疫治疗。实验结果表明，人参皂苷Rh1能抑制结肠肿瘤生长；能降低Treg细胞比例，增加CD8+T细胞比例，增强结肠癌免疫；能抑制结肠炎症；能调节结肠癌肠道菌群，减少有害菌，增加有益菌。因此，人参皂苷Rh1能够用于制备结肠癌免疫治疗药物；制备改善与调节结肠癌肠道菌群的药物。

附图说明

图1为人参皂苷Rh1对小鼠MC38移植瘤生长的抑制作用；其中，图1(A)为MC38移植瘤小鼠肿瘤生长曲线图，图1(B)为MC38移植瘤小鼠肿瘤系数图，图1(C-F)分别是小鼠肝脏、肾脏、肺、心脏的脏器系数图。

图2为人参皂苷Rh1干预的MC38荷瘤小鼠的免疫水平；其中图2(A)为肿瘤浸润Treg细胞的比例，图2(B)为肿瘤浸润CD8+T细胞的比例。

图3为人参皂苷Rh1抑制肿瘤组织炎症水平；其中图3(A)为肿瘤浸润巨噬细胞的比例，图3(B)为不同组肿瘤组织TNF-αmRNA表达情况；图3(C)为不同组肿瘤组织IL-6mRNA表达情况。

图4为人参皂苷Rh1对Apc^min/+小鼠结肠肿瘤生长的抑制作用；其中，图4(A)为不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤数量图，图4(B)为不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤负荷图，图4(C)为不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤面积图，图4(D)为不同组APC^min/+小鼠结肠长度图，图4(E)为病理切片结果，图4(F)为不同组结肠HE染色的炎症评分，图4(G、H)为小鼠肝脏、肾脏的脏器系数。

图5为人参皂苷Rh1干预的Apc^min/+小鼠结肠的免疫水平；其中图5(A)为结肠Treg细胞的比例，图5(B)为结肠CD8+T细胞的比例。

图6为Apc^min/+小鼠盲肠内容物16s rRNA测序；其中，图6(A)为微生物组PCoA分析，图6(B)为微生物组Alpha多样性分析，图6(C、D)为微生物组属水平上的物种相对丰度柱状图，图6(E)为不同组脱铁杆菌属(Mucispirillum)相对丰度图，图6(F)为不同组阿克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度图，图6(G)为不同组拟杆菌属(Muribaculaceae)的相对丰度图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例1 人参皂苷Rh1对小鼠MC38移植瘤的抑制实验

(1)小鼠MC38移植瘤模型建立

选取健康的C57BL/6雄性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司，6-8周龄)40只，体重18-20g，随机分为5组：对照组、5mg/kg Rh1组、10mg/kg Rh1组、20mg/kg Rh1组、5-氟尿嘧啶(5-FU)组，每组8只。适应性饲养(12小时光照，12小时黑暗，温度20-23摄氏度，湿度40-60％)一周后，每只小鼠皮下注入10⁶MC38细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)100μl/只，建立小鼠移植瘤模型。

(2)4天后，对照组灌胃给予安慰剂生理盐水(200μl，生理盐水与药物用量等体积)，给药组分别灌胃给予5、10、20mg/kg的人参皂苷Rh1，5-氟尿嘧啶(5-FU)组腹腔注射20mg/kg的5-氟尿嘧啶，并每2天测量小鼠体重及肿瘤体积。

(3)第21天脱颈处死小鼠，取各组小鼠心、肝、肺、肾及肿瘤组织称重，取肝、肾于4％多聚甲醛中进行固定、包埋、切片、HE染色，进行一般组织病理性观察。

(4)肿瘤浸润淋巴细胞提取：取部分肿瘤组织剪成小块，放入含IV型胶原酶(1mg/ml，Merk公司)和DNA酶(0.04mg/ml，Merk公司)的消化液(将IV型胶原酶1mg/ml与DNA酶0.04mg/ml用RPMI 1640培养基溶解)中，37℃消化约一小时，过70um筛网得到单细胞悬液，PBS溶液(博士德生物)3ml清洗后，用40％的percoll溶液(生工生物工程有限公司)3ml重悬，缓慢加到3ml 70％的percoll溶液上，900g离心25分钟后，吸取中间层淋巴细胞细胞到新的EP管中，PBS溶液300μl清洗后重悬待后续处理。

(5)流式细胞技术：

Treg细胞染色：取2×10⁵个上述获得的肿瘤浸润淋巴细胞，加入CD45、CD4、CD25流式抗体(CD45：0.25ug/t，CD4：0.25ug/t，CD25：0.25ug/t；Biolenged)，室温避光孵育1小时后，用500μl PBS溶液清洗重悬，根据说明书加入FOXP3打孔试剂(赛默飞生物)后孵育一小时，300μl透化缓冲液(赛默飞生物)清洗后，加入2.5ug/t FOXP3流式抗体(赛默飞生物)孵育1小时，500μl PBS溶液洗去游离抗体；

CD8+T细胞染色：取2×10⁵个上述获得的肿瘤浸润淋巴细胞，加入CD3、CD8流式抗体(CD3：0.5ug/t，CD8：0.25ug/t；Biolenged)，室温避光孵育1小时后，加入500μl PBS溶液洗去游离抗体。

巨噬细胞染色：取2×10⁵个上述获得的肿瘤浸润淋巴细胞，每个样加入0.25ugCD45，0.125ug CD11b，0.25ug F4/80流式抗体(流式抗体均购自biolegend)，室温孵育1小时后，加入500μl PBS后3000rpm离心5分钟，弃上清。

将上述得到的细胞分别用300μl PBS溶液重悬后，用流式细胞仪FACS Calibur(BD，USA)检测Treg、巨噬细胞以及CD8+T细胞的比例。

(6)QPCR技术：

称取10mg肿瘤组织，加入500μl RNA快速分离试剂(购自Vazyme)研磨均匀，向其中加入200μl的无酶水(购自碧云天)，上下颠倒混匀，室温静置5min。12,000×g室温离心15min。取出离心管，小心吸取500μl上层水相至一个新的无酶离心管中。加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。12,000×g室温离心10min，小心弃去上清。加入500μl 75％乙醇(无酶水配制)，轻弹管底，让沉淀悬浮起来，并上下颠倒数次。8,000×g室温离心3min，弃去上清。室温放置晾干，加入20μl无酶水溶解沉淀，室温涡旋3min，使RNA沉淀充分溶解。检测RNA浓度并将其保存于-80℃待用。由RNA逆转录合成cDNA，使用诺唯赞公司HiScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，具体步骤如下：

在200μl无酶EP管中配置以下混合液：

RNase free ddH₂O To 20μl

2×RT mix 10μl

HiSccript Enzyme Mix 2μl

Oligo(dT)23VN(50μM)1μl

Random hexamers(50ng/μl)1μl

Total RNA 1μg

轻轻吹打混匀，短暂离心后进行逆转录，反应条件为25℃反应5min，50℃反应15min，85℃反应2min。反应产物cDNA于-20℃保存备用。

实时荧光定量PCR使用诺唯赞公司ChamQ SYBR Qpcr Master Mix(Low ROXPremixed)试剂盒，具体步骤如下：

(1)在200μl无酶EP管中配置以下混合液：

2×ChamQ SYBR Qpcr Master Mix 5μl

Primer F(10μM)0.2μl

Primer R(10μM)0.2μl

cDNA 1μl

RNase free ddH2O 3.6μl

(2)涡旋混匀后短暂离心进行qPCR反应：

1、预变性95℃30s；

2、变性95℃10s，60℃30s，40个循环；

3、95℃15s，60℃60s，9℃15s。

(3)检测结果以β-actin的循环数(cycle threshold，Ct)作为参照，检测基因的相对表达量按照2^-ΔΔCt的方法进行计算：ΔCt＝待测基因的Ct值-同一样本的β-actin的Ct值。ΔΔCt＝实验组待测基因的ΔCt值-对照组待测基因的ΔCt值。

待测基因的相对表达量＝2^-ΔΔCt

引物序列：

IL-6:

Primer F：CTGCAAGAGACTTCCATCCAG

Primer R：AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG

TNF-a：

Primer F：CAGGCGGTGCCTATGTCTC

Primer R：CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG

β-actin:

Primer F：CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG

Primer R：TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG

引物购自生工生物工程。

实验结果：

(1)人参皂苷Rh1能够有效抑制小鼠MC38移植瘤的生长。

本发明建立了小鼠MC38移植瘤模型并给予5、10、20mg/kg的人参皂苷Rh1和20mg/kg的5-FU。图1为人参皂苷Rh1对小鼠MC38移植瘤生长的抑制作用。其中，图1(A)为MC38移植瘤小鼠肿瘤生长曲线图；每两天用游标卡尺测量移植瘤的长宽高，并计算体积，绘制生长曲线。图1(B)是MC38移植瘤小鼠肿瘤系数图，结果表明人参皂苷Rh1能够显著抑制肿瘤的生长，且在同样的剂量下(20mg/kg)肿瘤体积比阳性药5-FU更小，表明同样的剂量下其疗效优于阳性药5-FU。图1(C-F)分别是小鼠肝脏、肾脏、肺、心脏的脏器系数，结果显示小鼠各脏器系数均无显著差异，表明人参皂苷Rh1在应用剂量下无脏器毒性。

以上结果显示人参皂苷Rh1能够有效抑制MC38移植瘤的生长。

(2)人参皂苷Rh1主要通过降低肿瘤浸润Treg细胞的比例，并促进CD8+T细胞活化增殖，来实现对小鼠MC38移植瘤生长的抑制。

本发明提取了肿瘤浸润淋巴细胞并使用流式细胞仪检测了肿瘤中Treg细胞及CD8+T细胞的比例。图2为人参皂苷Rh1干预的MC38荷瘤小鼠的免疫水平。图2(A)是小鼠肿瘤浸润淋巴细胞Treg细胞流式检测结果图，结果显示与对照组小鼠Treg比例相比，10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤组织内的Treg细胞比例，有显著性差异；图2(B)是小鼠肿瘤浸润淋巴细胞CD8+T细胞流式检测结果图，结果显示与对照组小鼠CD8+T比例相比，10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著增加肿瘤组织内的CD8+T细胞比例，有显著性差异。

以上结果显示：10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤组织内的Treg细胞比例，并显著增加CD8+T细胞的比例，起到免疫激活作用。

(3)人参皂苷Rh1可通过降低肿瘤浸润的巨噬细胞以及减少炎症因子的产生减轻肿瘤组织炎症。

本发明用流式细胞仪检测了肿瘤浸润的巨噬细胞比例，并用QPCR检测了肿瘤组织中IL-6、TNF-a的产生。图3为人参皂苷Rh1抑制肿瘤组织炎症水平；其中图3(A)是小鼠肿瘤浸润巨噬细胞流式检测结果图，结果显示与对照组小鼠巨噬细胞比例相比，10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤组织内的巨噬细胞比例，有显著性差异；图3(B)是不同组肿瘤组织TNF-a mRNA表达情况，结果显示10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤组织TNF-a mRNA的表达，有显著性差异；图3(C)是不同组肿瘤组织IL-6 mRNA表达情况，结果显示10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤组织IL-6mRNA的表达，有显著性差异。

以上结果显示：10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低肿瘤浸润的巨噬细胞比例，并能够减少肿瘤部位炎症因子IL-6、TNF-a mRNA的表达，起到减轻肿瘤炎症的效果。

实施例2 人参皂苷Rh1抑制Apc^min/+小鼠结肠肿瘤生长的抑制试验

(1)Apc^min/+小鼠结肠癌模型建立：

选取健康的Apc^min/+小鼠(购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，6-8周，20-22克)24只，雌雄各半，随机分成3组：对照组、10mg/kg Rh1组、20mg/kg Rh1组，每组8只。适应性(12小时光照，12小时黑暗，温度20-23摄氏度，湿度40-60％)饲养一周后，给予小鼠40％高脂饮食7天，7天后恢复正常饮食。对照组小鼠每天灌胃给予安慰剂(生理盐水)200μl，给药组分别灌胃给予10、20mg/kg的人参皂苷Rh1，待观察到体重明显下降，并出现便血、脱肛等症状后，处死小鼠，解剖取结肠，统计结肠长度，肿瘤数量、面积、负荷。

(2)切片，进行HE染色，并进行一般组织病理学观察及评分，观察结肠损伤情况。

组织学评分：

1、上皮细胞变化：正常，0分；杯状细胞缺失，1分；杯状细胞大面积缺失，2分；隐窝缺失，3分；隐窝大面积缺失或息肉状再生，4分。

2、炎症浸润：无，0分；隐窝周围浸润，1分；粘膜肌层出现浸润，2分；粘膜肌层普遍浸润，3分；粘膜下层浸润，4分。

(3)结肠组织单细胞悬液制备：取长度约2cm的一段结肠，剪成小块，放入含IV型胶原酶(Merk，1mg/ml)和分散酶(Merk，1mg/ml)的消化液(IV型胶原酶和分散酶用RPMI1640培养基溶解即为消化液)中，37℃消化约一小时，过70um筛网得到单细胞悬液，3ml PBS溶液清洗后重悬(3000rpm离心5分钟，弃上清，加300ul PBS用移液枪吹匀)待后续处理。

(4)流式细胞技术：

Treg细胞染色：取2×10⁵上述获得的结肠单细胞悬液，加入CD45、CD4、CD25流式抗体(CD45:0.25ug/t,CD4:0.25ug/t,CD25:0.25ug/t)，室温避光孵育1小时后，用500μl PBS溶液清洗重悬，根据说明书加入FOXP3打孔试剂后孵育1小时，300μl透化缓冲液清洗后，加入2.5ug/t FOXP3流式抗体孵育1小时，500μl PBS溶液洗去游离抗体；

CD8+T细胞染色：取2×10⁵上述获得的结肠单细胞悬液，加入CD3、CD8流式抗体(CD3:0.5ug/t,CD8:0.25ug/t)，室温避光孵育1小时后，加入500μl PBS溶液洗去游离抗体。

将上述得到的细胞分别用300μl PBS重悬后，用流式细胞仪仪FACS Calibur(BD，USA)检测Treg以及CD8+T细胞的比例。

(5)16srRNA技术：

取200mg盲肠内容物(上述APCmin/+的结肠的回盲内容物)于新微量离心管中，使用QIAamp Power Fecal Pro DNA试剂盒(天根生化)提取总DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

DNA质检达要求后，以此为模板，采用带barcode的引物对16SrRNA的V3～V4区进行第一轮PCR扩增。

正向引物：

5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG

反向引物

5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

引物购自生工生物工程。

PCR扩增体系(25μl)：

Microbial DNA(5ng/μl)          2.5μl,

正向引物(1μM)                  5μl，

反向引物(1μM)                  5μl，

2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5ul。

2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix购自KAPA Biosystems。

PCR扩增程序：

1、95℃3min；

2、95℃30s，55℃30s，70℃30s，25个循环；

3、72℃5min；

4、4℃维持。

用20g/L琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，检测合格后，进行文库浓度测定。通过Illumina Miseq PE300测序平台(美国Illumina公司)对DNA 片段进行双端高通量测序，获得原始数据。用Cutadapt v1.2.1软件(https://cut-adapt.readthedocs.io/en/stable/)去除接头序列，将成对的短序列用PEAR v0.9.6软件依据重叠关系进行数据拼接。采用PRINSEQ v0.20.4软件切除barcode序列和引物序列，并采用滑窗法检查各个序列的质量值，以去除含N部分序列、短序列以及低复杂度序列，长度阈值为200bp。使用USEARCHv8.1.1831软件(www.drive5.com/usearch)去除预处理后序列中非扩增区域序列，并用UCHIME v4.2.40软件检测嵌合体并予以删除，随后去除嵌合体序列，与核糖体数据库项目(Ribo-somal Database Project，RDP)代表性序列进行比对，剔除相似度低于80％的序列，得到合格序列。USEARCH v8.1.1831软件将上述数据进行97％相似性运算。

分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类，采用RDPClassifier v2.12软件(https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/files/)将各样本序列进行物种分类，选择丰度最高的序列作为OTU代表性序列。

在属水平对微生物群落构成及分布丰度进行分析。用Rv3.2对物种分类学统计结果做柱状图，云工具(https://www.lc-bio.cn，杭州联川生物技术股份有限公司)绘制桑基图观察微生物群落构成。基于前述OTU聚类结果进行α多样性分析，使用Mothur v1.30.1软件(https://mothur.org/)计算各个样本α多样性指数值(ACE指数和Shannon指数)，检验水准α＝0.05。线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)是一种线性判别分析(linear discriminant analysis，LDA)方法，结合Wilcoxon和Kruskal-Wallis非参数检验可以筛选出最能解释组间差异的微生物菌群，以及其对组间差异的影响程度，使用LEfSev1.1.0软件(http://huttenhower.sph.Harvard.edu/lefse/)选择各时间点LDA分值>2的差异细菌群落。利用

14.1(Q845)软件(德国Sartorius公司)建立PLS回归模型，得到决定系数(R2)和交叉验证均方根误差，分析PMI与肠道菌群之间的线性关系。

实验结果：

(1)人参皂苷Rh1能够有效抑制Apc^min/+小鼠结肠腺瘤的产生。

本发明建立了Apc^min/+小鼠结肠腺瘤模型，并给予10、20mg/kg的人参皂苷Rh1。图4为人参皂苷Rh1对Apc^min/+小鼠结肠肿瘤生长的抑制作用。图4(A)是不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤数量图，结果显示与对照组小鼠结肠肿瘤数量相比，人参皂苷Rh1能够明显减低肿瘤数量，有显著性差异；图4(B)是不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤负荷图，结果显示与对照组小鼠结肠肿瘤负荷相比，人参皂苷Rh1能够明显减低肿瘤负荷，有显著性差异(肿瘤负荷统计方法为一个结肠上所有肿瘤直径的和)；图4(C)是不同组APC^min/+小鼠结肠肿瘤面积图，结果显示与对照组小鼠结肠肿瘤面积相比，人参皂苷Rh1能够明显减低肿瘤面积，有显著性差异(肿瘤面积统计方法为一个结肠上所有肿瘤面积的和)；图4(D)是不同组APC^min/+小鼠结肠长度图；图4(E)是病理切片结果，HE染色结果显示对照组出现不同程度的病变，人参皂苷Rh1干预后病变均改善；图4(F)是不同组结肠HE染色的炎症评分，结果显示人参皂苷Rh1干预后炎症评分降低，有显著性差异；图4(G、H)是小鼠肝脏、肾脏的脏器系数，结果显示人参皂苷Rh1干预后小鼠肝脏、肾脏的脏器系数无显著性差异，说明人参皂苷Rh1在应用剂量下无肝肾毒性。

(2)人参皂苷Rh1可通过降低结肠Treg细胞的比例，并促进CD8+T细胞活化增殖来抑制结肠腺瘤的生长。

本发明用流式细胞仪检测了结肠组织中的Treg细胞及CD8+T细胞的比例，图5为人参皂苷Rh1干预的Apc^min/+小鼠结肠的免疫水平。图5(A)是人参皂苷Rh1干预的Apc^min/+小鼠结肠的Treg细胞流式检测结果图，结果显示与对照组小鼠结肠Treg比例相比，10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著降低结肠组织内的Treg细胞比例，有显著性差异；图5(B)是人参皂苷Rh1干预的Apc^min/+小鼠结肠的CD8+T细胞流式检测结果图，结果显示与对照组小鼠结肠CD8+T比例相比，10mg/kg的人参皂苷Rh1可显著增加结肠组织内的CD8+T细胞比例，有显著性差异。

以上结果显示：人参皂苷Rh1能显著降低结肠部位的Treg细胞比例，并显著增加CD8+T细胞的比例，起到免疫激活作用。

(3)人参皂苷Rh1能够有效改善Apc^min/+小鼠的肠道菌群。

本发明使用了16s rRNA检测了小鼠盲肠内容物的肠道菌群的组成，图6为Apc^min/+小鼠盲肠内容物16s rRNA测序。图6(A)是微生物组PCoA分析，可用来研究样本的差异性，不同组间距离越远表示差异越大。结果显示人参皂苷Rh1干预后给药组与对照组距离相隔很远，说明其可使小鼠的肠道菌群组成发生明显改变；图6(B)是微生物组Alpha多样性分析，反应菌群的物种丰富度和多样性，结果显示人参皂苷干预后给药组Alpha多样性上升，有显著性差异，说明人参皂苷Rh1可提高肠道菌群的物种丰富度和多样性；图6(C、D)是不同组属水平上的肠道菌群丰度，结果显示，不同组小鼠的肠道菌群在属水平上也有差异；图6(E-G)是不同组脱铁杆菌属(Mucispirillum)、阿克曼菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Muribaculaceae)的相对丰度图，结果显示人参皂苷Rh1干预后给药组的有害菌脱铁杆菌属(Mucispirillum)丰度显著降低，有显著性差异，并使有益菌阿克曼菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Muribaculaceae)的相对丰度明显增加，有显著性差异。

以上结果说明人参皂苷Rh1能够调节肠道微生物平衡，增加有益肠道微生物的含量，降低肠道中有害微生物的含量，从而对机体起到保护作用。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (9)

1.人参皂苷Rh1在制备结肠癌免疫治疗药物中的应用。

2.人参皂苷Rh1在制备调节结肠癌肠道菌群药物中的应用。

3.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rh1降低肿瘤浸润和结肠Treg细胞的比例，促进CD8+T细胞活化增殖。

4.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rh1降低肿瘤浸润的巨噬细胞，减少炎症因子的产生。

5.权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括IL-6、TNF-a。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群中的微生物包括脱铁杆菌属Mucispirillum，阿克曼菌属Akkermansia、拟杆菌属Muribaculaceae。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述人参皂苷Rh1能够降低有害菌脱铁杆菌属Mucispirillum，增加有益菌阿克曼菌属Akkermansia、拟杆菌属Muribaculaceae。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括人参皂苷Rh1及药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、注射剂或输液剂。

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