CN115976032B - 一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因、抑菌肽及应用 - Google Patents
一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因、抑菌肽及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因、抑菌肽及应用。所述用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述抑菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。与现有技术相比，本发明首次通过NCBI数据库筛选出骆驼体内乳铁蛋白序列并预测了其中的保守区域从而获得核苷酸序列，并通过基因工程获得具有抑菌活性的抑菌肽，实验证明其能有效地抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，具有显著的抑菌功能，可有效替代抗生素类药物，解决耐药性问题。
Description
技术领域
本发明属于抑菌肽技术领域，具体涉及一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因、抑菌肽及应用。
背景技术
骆驼乳铁蛋白肽CM-1是在酸性环境下，经胃蛋白酶水解得到的小分子生物活性肽，具有多种生物活性，具有良好的耐热性、非抗原性、免疫调节活性、广谱抗菌和抗病毒活性，可广泛作为食品防腐剂、抗氧化剂、营养添加剂等。CM-1分子量 3716.33 Da，抑菌过程中，CM-1两亲性结构与膜脂多糖相结合，疏水残基与膜的亲脂部分相互作用，使细胞膜形成穿孔，细胞内容物外泄起到抑菌杀菌作用，且不产生耐药性。
目前抗生素耐药性的对人体健康的影响存在很严重的威胁，CM-1无耐药性特点表明其是极具潜力的抗菌药物。由于当前情况下，一些主流的纯化制备过程中如酶解分离纯化较困难而化学合成的方法成本高昂，因此利用分子生物技术来生产抗生素已经成为当下的主流趋势。
发明内容
发明目的：为了解决现有抑菌类药物中耐药性的问题，本发明提供了一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因、抑菌肽及应用。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种抑菌肽，其氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码。
所述抑菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种质粒，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选的，所述质粒包含有表达载体pPIC9K。
本发明还提供了所述的抑菌肽在制备抗菌剂中的应用。
优选的，所述抗菌剂能够抑制金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌。
本发明最后提供了一种抑菌组合物，所述抑菌组合物的有效成分包括所述的抑菌肽。
有益效果：与现有技术相比，本发明首次通过NCBI数据库筛选出骆驼体内乳铁蛋白序列并预测了其中的保守区域从而获得核苷酸序列，并通过基因工程获得具有抑菌活性的抑菌肽，实验证明其能有效地抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，具有显著的抑菌功能，可有效替代抗生素类药物，解决耐药性问题。
附图说明
图1为Camelus-F/R融合条带。
图2为Cam-LF-F/R扩增片段。
图3为片段及载体双酶切验证。
图4 为CM-1小肽片段连接载体验证。
图5为CM-1小肽片段转入酵母后的验证。
图6为Tricine-SDS-PAGE蛋白胶验证小肽。
图7为大肠杆菌半乳糖浓度3%发酵1-5天。
图8为金葡菌半乳糖浓度3%发酵1-5天。
图9为大肠杆菌半乳糖浓度1-5%发酵3天。
图10为金葡菌半乳糖浓度1-5%发酵3天。
图11为大肠杆菌半乳糖浓度3%发酵3天 。
图12为金葡菌半乳糖浓度3%发酵3天。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1
通过NCBI数据库筛选出骆驼体内乳铁蛋白序列并预测了其中的保守区域：
Ser Lys Cys Ala Gln Trp Gln Arg Arg Met Lys Lys Val Arg Gly Pro SerVal Thr Cys Val Lys Lys Thr Ser 将乳铁蛋白肽的保守区域中的氨基酸序列根据NCBI序列比对转换为碱基序列（碱基及引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成）：
TCAAAATGTGCCCAATGGCAACGGAGGATGAAAAAAGTGCGTGGTCCCTCTGTCACCTGCGTAAAGAAGACATCT
再设计融合引物进行融合PCR （带下标序列为EcoR1/Not1酶切位点）：
Camelus-F:CCGGAATTCTCAAAATGTGCCCAATGGCAACGGAGGATGAAAAAAGTGCGTGGTCCCTC
Camelus-R:AATAGGATGCGGCCGCAGATGTCTTCTTTACGCAGGTGACAGAGGGACCACGCACTTTTTTCATCCTCCG
Cam-LF-F:CCGGAATTCATGTCAAAATGTGCCCAATGGC
Cam-LF-R:AATAGGATGCGGCCGCAGATGTCTTCTTTAC
融合体系如下（50μl）：
dNTP 5μl
5X Buffer 10μl
Camelus-F 15μl
Camelus-R 15μl
去离子水 4μl
Star酶 1μl。
dNTP、5X Buffer及Star酶购自Takara公司，设定程序参考Takara Star酶说明书：95℃5min；95℃30s，TM值30s，72℃30min，15cycs，72℃7min。得到100bp左右的片段作为模板，以2000maker作参照进行琼脂糖凝胶电泳检测产物条带的正确性，根据PCR产物回收试剂盒的说明书回收PCR产物。
再用Cam-LF-F/Cam-LF-R,高保真酶用上轮pcr产物为模板，进行PCR扩增。
PCR扩增体系如下（50μl）：
dNTP 5μl
5X Buffer 10μl
Cam-LF-F 2μl
Cam-LF-R 2μl
去离子水 29μl
Star酶 1μl
模板 1μl。
设定程序参考Takara Star酶说明书：95℃5min；95℃30s，TM值30s，72℃30min，35cycs，72℃7min。得到150bp左右的片段，以2000maker作参照进行琼脂糖凝胶电泳检测产物条带的正确性，根据胶回收试剂盒的说明书回收PCR产物。
将扩增出目的条带的PCR回收产物和pPIC9K载体分别用限制性内切酶（购自Takara公司）进行双酶切，设置PCR反应程序为：37℃ 30min；65℃ 5min。（X根据回收浓度计算得到，根据测出的浓度加入1000ng）。
双酶切体系如下：
EcoR I/Not I 各1μl
载体质粒模板/片段回收产物 Xμl
Buffer 2μl
去离子水 补足到20ul。
将双酶切片段与载体跑胶回收纯化后的胶回收产物进行过夜连接（T4连接酶及Buffer购自Takara公司），16℃连接18h，连接体系如下：
目的片段胶回收产物 6μl
T4DNABuffer 1μl
T4DNA连接酶 1μl
载体胶回收产物 2μl。
感受态细胞制备步骤如下：
（1）从新鲜的LB平板上选取一个DH5a克隆，接种到6ml无抗LB中37℃，220rpm过夜扩大培养；
（2）取1ml扩大培养的菌液接种于100ml无抗LB中37℃，220rpm培养到OD600约为0.5-0.6之间；
（3）将摇瓶放在冰中冰浴30min后4℃，4000rpm离心20min；
（4）弃上清，加入预冷过后的15ml，10%甘油重悬菌体，4℃，4000rpm离心20min；
（5）重复一次步骤（4）；
（6）弃上清，加入预冷过后的15ml，10%甘油重悬菌体，4℃，3500rpm离心15min；
（7）小心的去掉上清，加入预冷过后的3ml，10%甘油重悬菌体；
（8）分装成100μl后立即置于-80℃冰箱保存。
连接产物转化至DH5a感受细胞内，步骤如下：
（1）将感受态细胞放置在冰上冰浴5min；
（2）将连接产物10μl全部加入感受态细胞内，冰浴30min；
（3）将冰浴后的感受态细胞42度金属浴热激90s；
（4）加入1ml无抗LB培养基至热失活后的感受态细胞中，37℃220rpm，培养1h后离心集菌涂板。
涂至氨苄青霉素Amp抗性的固体培养皿上过夜培养，第二天挑选单克隆进行重组载体的鉴定，鉴定无误后提取质粒备用。
提取质粒后，转入至INVSc1酵母感受态细胞中，步骤如下：
（1）取100μl冰上融化的INVSc1感受态细胞，加入预冷的目的质粒2-5μg，CarrierDNA（在95℃-100℃加热5min，快速冰浴且重复一次）10μl，PEG/LIAc500μl并吹打混匀几次，30℃水浴30min；
（2）42℃水浴15min；
（3）5000rpm离心40s弃上清，去离子水400μl重选，离心30s弃上清；
（4）去离子水50μl重选，涂于SD-U medium平板，29℃培养72h。
转化完成后通过PCR鉴定后将阳性克隆与10ml SD培养基中29℃ 220rpm/min培养16-20h得到种子液，再将种子液收集离心使用SC培养基重悬，重复一次洗脱后，将种子液中的菌体加入至50ml SC培养基中，初始OD为0.5。加入半乳糖诱导，29℃ 220rpm/min培养。为了探究不同半乳糖诱导浓度及发酵时间对抑菌肽活性的影响，采取了梯度实验。半乳糖浓度分别设置为1%、2%、3%、4%、5%，发酵时间分别设置为24h、48h、72h、96h、120h。收集了不同时间与浓度的发酵液上清进行冻干处理。
使用琼脂扩散法检测发酵液上清的抑菌活性，加入150μl菌体浓度为108CFU/ml的活化大肠杆菌与金葡菌分别接种于LB琼脂培养基中，充分混匀后制备平板，待平板凝固后使用5mm无菌打孔器打孔，每孔加入70μl发酵上清液，以氨苄青霉素Amp抗性作阳性对照，空白孔为阴性对照，37℃培养16-20h分析抑菌肽的活性。
收集发酵上清液，经 3 kDa超滤管过滤，收集5ml滤液进行冻干后浓缩30倍进行复溶，最后进行 Tricine-SDS-PAGE蛋白胶检测，实验设置未转入质粒的INVSc1酵母同等发酵条件获取的上清液为空白对照。
最终根据琼脂扩散法得到结果，半乳糖浓度3%发酵72小时后浓缩30倍达到最佳效果。
Claims (7)
1.一种用于表达骆驼乳铁蛋白抑菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种抑菌肽，其氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码。
3.一种质粒，其含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含有表达载体pPIC9K。
5.权利要求2所述的抑菌肽在制备抗菌剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂能够抑制金黄色葡萄球菌和/或大肠杆菌。
7.一种抑菌组合物，其特征在于，所述抑菌组合物的有效成分包括权利要求2所述的抑菌肽。
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