CN115975064A

CN115975064A - 一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖、制备方法及应用

Info

Publication number: CN115975064A
Application number: CN202310024436.3A
Authority: CN
Inventors: 刘振; 张风; 王瑾瑶; 周远卓; 朱旺宝; 向岑; 滕玉鸥
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明公开了一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖、制备方法及应用，该多糖是从枳椇子中提取获得的一种α‑构型多糖，枳椇子多糖中的总糖含量为45％‑55％，蛋白的含量为5％‑10％。枳椇子多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其制备方法为粉碎过筛，水提醇沉，冷冻干燥，此制备方法操作简单，安全性高。本发明制备的枳椇子多糖可以降低高尿酸血症模型中血清尿酸以及肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，同时可以改善由高尿酸血症所致的肝肾损伤，而枳椇子多糖的降尿酸作用并未有报道，说明枳椇子多糖在抗高尿酸血症和痛风药物中的应用具有广泛的前景。

Description

一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖、制备方法及应用

技术领域

本发明属于食品保健、中药技术领域，尤其是一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖、制备方法及应用。

背景技术

尿酸是人类嘌呤化合物的终末代谢产物，嘌呤代谢紊乱导致高尿酸血症，近年来，由于生活水平和饮食结构的改变，我国高尿酸血症呈明显上升和年轻化趋势。高尿酸血症目前已成为继高血压、高血糖、高血脂后的“第四高”，且已成为继糖尿病之后的第二大代谢疾病。当尿酸生成增多或排泄困难时，尿酸会在体内生成尿酸单钠结晶，从而在关节处和肾脏等部位的沉积，最终导致痛风。

目前高尿酸血症及痛风的治疗仍然是依赖药物控制，然而药物往往对心、肝、肾等造成损伤，天然活性物质包括多糖、生物碱类、甾醇类等，具有多种药理活性，安全性高，副作用低，被广泛用于保健、疾病治疗领域，具有广阔的应用前景。

枳椇子为鼠李科枳椇属植物枳椇的带有肉质果柄的果实或种子，为药食同源中药。枳椇子味甘酸，平，归心、脾二经，主产于甘肃、陕西、河南等地，能治酒醉、烦热、口渴、呕吐、二便不利。现代药理学表明枳椇子具有解酒保肝、抗氧化、抗炎等药理活性。目前对枳椇子的成分研究大多集中在小分子物质上，如黄酮类、生物碱类等。多糖是枳椇子的主要功能性成分，虽然有报道称枳椇子提取物有抑制黄嘌呤氧化酶的活性，但枳椇子多糖降尿酸的活性研究还未见报道。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖、制备方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖，所述枳椇子多糖中总糖的含量为45％-55％，蛋白的含量为5％-10％。

进一步地，所述枳椇子多糖经酸水解后的单糖组成包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。

进一步地，所述枳椇子多糖的构型为α-构型多糖。

如上所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)枳椇子干燥后粉碎过筛，得枳椇子粉；

(2)向步骤(1)得到的枳椇子粉中加10-30倍质量的蒸馏水回流提取2-3次，将滤液合并得枳椇子水提液；

(3)将步骤(2)得到的枳椇子水提液浓缩，加入乙醇，使乙醇的体积浓度达到70-90％(v/v)，4℃下过夜静置沉淀，离心10min收集沉淀，沉淀用乙醇浸洗1-3次，干燥，得到枳椇子醇沉物；

(4)将步骤(3)得到的枳椇子醇沉物用1～2倍重量的蒸馏水复溶，60-70℃水浴挥去多余醇，得到浓缩液；

(5)将步骤(4)中得到的浓缩液反复冻融，4000-5000rpm离心10min，冷冻干燥，得枳椇子多糖。

进一步地，所述步骤(1)中粉碎过筛为：粉碎过30-60目筛；

所述步骤(2)中向枳椇子粉中加20倍质量的蒸馏水，回流提取温度为70-90℃，回流时间为1.5-3h，回流提取2次。

进一步地，粉碎过40目筛，所述回流提取温度为80℃，回流时间为2h。

进一步地，所述步骤(3)中乙醇的体积浓度达到80％(v/v)，乙醇浸洗时加入乙醇的体积为沉淀的2-4倍。

如上所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备高尿酸血症和/或痛风的药物方面中的应用。

如上所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症的血清尿酸、降低肝脏黄嘌呤氧化酶的活性、改善高尿酸血症所致的肝肾损伤的药物方面中的应用。

如上所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸、降低肝脏黄嘌呤氧化酶的活性、改善高尿酸血症所致的肝肾损伤的药物方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖，具有明确的构型，确定了单糖组成，为枳椇子多糖降尿酸作用的成分研究以及抗高尿酸血症乃至防治痛风药物的研发奠定了基础。

2、本发明提供了一种枳椇子多糖的制备方法，具有操作简单、条件温和的优点，安全有效且成本较低。

3、本发明制备得到的枳椇子多糖能显著降低高尿酸血症小鼠中的的血清尿酸水平，在200mg/kg灌胃下比模型组小鼠血清尿酸值降低了58.82％，同时能改善高尿酸血症引起的肝肾损伤，在抗高尿酸血症新药开发和市场应用方面具有巨大的前景。

4、本发明采用氧嗪酸钾(PO)诱导小鼠高尿酸血症，应用本发明的枳椇子多糖100mg/kg和200mg/kg灌胃给药，结果表明，枳椇子多糖能显著降低PO诱导的高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，给药后肝脏黄嘌呤氧化酶的活性也显著降低，同时枳椇子多糖能够改善高尿酸血症所致的肝肾损伤。

5、本发明多糖是从枳椇子中提取获得的一种α-构型多糖，枳椇子多糖中的总糖含量为45％-55％，蛋白的含量为5％-10％。枳椇子多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其制备方法为粉碎过筛，水提醇沉，冷冻干燥，此制备方法操作简单，安全性高。本发明制备的枳椇子多糖可以降低高尿酸血症模型中血清尿酸以及肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，同时可以改善由高尿酸血症所致的肝肾损伤，而枳椇子多糖的降尿酸作用并未有报道，说明枳椇子多糖在抗高尿酸血症和痛风药物中的应用具有广泛的前景。

附图说明

图1为本发明中枳椇子多糖的单糖组成分析HPLC图；其中，(a)为单糖标准品PMP衍生物；(b)为枳椇子多糖水解后PMP衍生物；

图2为本发明中枳椇子多糖的FT-IR图；

图3为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清中尿酸(UA)的影响图；其中，#表示与正常组相比，p<0.05；*表示与模型组相比，p<0.05；

图4为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性的影响图；

图5为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清谷草转氨酶(AST)的影响图；

图6为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的影响图；

图7为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清肌酐(Cre)水平的影响图；

图8为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠血清尿素氮(BUN)的影响图；

图9为本发明中枳椇子多糖对氧嗪酸钾诱导高尿酸血症小鼠肝肾组织病理学的影响图；其中，A为肝组织，B为肾组织。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。

较优地，所述枳椇子多糖经酸水解后的单糖组成包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。

较优地，所述枳椇子多糖的构型为α-构型多糖。

(1)枳椇子干燥后粉碎过筛，得枳椇子粉；

较优地，所述步骤(1)中粉碎过筛为：粉碎过30-60目筛；

较优地，粉碎过40目筛，所述回流提取温度为80℃，回流时间为2h。

较优地，所述步骤(3)中乙醇的体积浓度达到80％(v/v)，乙醇浸洗时加入乙醇的体积为沉淀的2-4倍。

具体地，相关制备及检测如下：

实施例1

枳椇子多糖的制备方法：

将枳椇子粉碎过筛，枳椇子粉加入20倍质量的蒸馏水回流提取2次，每次设定温度80℃回流2h，将滤液合并得枳椇子水提液。将枳椇子水提液浓缩，加入4倍体积的乙醇，乙醇的体积浓度为80％，进行醇沉，4℃下静置过夜，4500rpm离心10min收集沉淀，得到枳椇子醇沉物，枳椇子醇沉物用乙醇浸洗3次，干燥后用2倍重量的蒸馏水复溶，70℃水浴除去多余乙醇，得到浓缩液，浓缩液反复冻融，4500rpm离心10min，冷冻干燥，得枳椇子多糖。

经上述步骤处理，制备得到的枳椇子多糖的提取率为1.67％-1.89％，枳椇子多糖中含有总糖的含量为45％-55％，蛋白的含量为5％-10％。

实施例2

制备得到的枳椇子多糖的结构表征：

1)采用PMP柱前衍生HPLC法测定实施例1所得的枳椇子多糖的单糖组成

供试品溶液配制：称取2mg实施例1中得到的枳椇子多糖溶于5mL、2mol/L的三氟乙酸中，120℃水解4h，冷却后挥干多余液体，为除去多余的三氟乙酸，用甲醇复溶后挥干，重复三次。

标准溶液的配制：取甘露糖、木糖、鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖标准品，精准配制含有每种单糖2mg/mL的混合标准品水溶液。取200μL的水解液和混合溶液加400μL 0.3mol/L的NaOH溶液和400μL 0.5mol/L的PMP溶液，70℃下静置2h，再加入400μL 0.3mol/L的盐酸。加入等量的氯仿剧烈振荡1min，5000rpm离心5min，重复三次，取水层过0.22μM微孔滤膜后进行HPLC分析。

HPLC分析条件：Agilent 1100Infinity系统；Kromasil 100-5-C18色谱柱(4.6ⅹ250mm，5μM)；流动相：磷酸盐缓冲液(0.1M,pH 6.6)-乙腈(等度洗脱，83:17，v/v)；流速：0.8mL/min；紫外检测波长：250nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

经检测，实施例1所得到的枳椇子多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中，图1中(a)为单糖标准品PMP衍生物HPLC谱图，图1中(b)为枳椇子多糖水解后衍生物HPLC谱图，通过两图对照，枳椇子多糖主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成。

2)采用红外光谱仪分析实施例1所得的枳椇子多糖的特征基团

取1mg的实施例1中得到的枳椇子多糖与150mg KBr充分混匀研磨并压成薄片，放入傅里叶变换红外光谱仪中进行检测，扫描波数范围为500-4000cm^-1。使用Origin软件进行分析。

经检测，实施例1所得到的枳椇子多糖具有多糖的特征峰，如图2所示，3404.69cm^-1处的宽峰对应羟基的O-H伸缩振动，表明含有-OH结构；1653.21cm^-1和1446.79cm^-1处的吸收峰代表羧酸根基团的对称和不对称伸缩振动。1083.33cm^-1处的吸收峰是由于C-O-C和C-O-H的拉伸振动，在841.03cm^-1处的吸收峰表明枳椇子多糖是α-构型多糖。

实施例3

制备得到的枳椇子多糖对氧嗪酸钾(PO)诱导的高尿酸血症小鼠的影响：

1)试验动物及给药方式

雄性昆明小鼠，SPF级，6-8周龄，普通饲料适应性喂养3-5天，随机分为5组，按分组给药，连续灌胃给药8天，第8天灌胃给药1h后除正常组外，其余组腹腔注射氧嗪酸钾，剂量300mg/kg。

(1)正常组：灌胃0.5％羧甲基纤维素钠CMC-Na，10mL/kg；

(2)模型组：灌胃0.5％CMC-Na，10mL/kg；

(3)别嘌呤醇(APL)组：灌胃10mg/kg/d的别嘌呤醇；

(4)枳椇子多糖低剂量组：按100mg/kg/d的剂量灌服实施例1制备得到的枳椇子多糖；

(5)枳椇子多糖高剂量组：按200mg/kg/d的剂量灌服实施例1制备得到的枳椇子多糖；

2)检测指标

给药最后一天对小鼠股动脉取血，颈椎处死，血样充分静置后在4℃，3500rpm下离心10min，取血清，-80℃保存。按照不同试剂盒的检测方法检测小鼠血清中尿酸(UA)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)的变化以及肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性的变化。取肝、肾称重，计算肝、肾指数。取一部分肝肾组织浸泡在多聚甲醛中，进行HE染色。

3)结果分析

本实验通过建立高尿酸血症小鼠经典模型，以别嘌呤醇为阳性对照，给与不同剂量的枳椇子多糖进行治疗，评价枳椇子多糖对高尿酸血症小鼠的影响，结果如下：

(1)枳椇子多糖显著降低高尿酸血尿症小鼠血清尿酸

尿酸产生过多或排泄障碍导致血清尿酸增加进而引发高尿酸血症或痛风，血清尿酸水平是评价高尿酸血症或痛风的最关键的指标。如图3所示，模型组与正常组相比，小鼠血清尿酸水平显著升高，别嘌呤醇组血清尿酸水平显著降低，说明模型建立成功，给与枳椇子多糖治疗后，与模型组相比，血清尿酸显著下降，且成剂量依赖性，并且在200mg/kg枳椇子多糖治疗后，相比于模型组小鼠其血清尿酸值降低了58.82％。

(2)枳椇子多糖显著降低高尿酸血尿症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性

尿酸的生成主要在肝脏中进行，黄嘌呤氧化酶是尿酸生成过程中最关键的限速酶，催化次黄嘌呤或黄嘌呤生成尿酸，黄嘌呤氧化酶活性增加会加速尿酸的生成，黄嘌呤氧化酶活性的变化也是筛选降尿酸药物的一个重要指标。如图4所示，小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶活性由正常组的78.26U/gprot升高至131.14U/gprot，而给与药物治疗后，与模型组相比，肝脏黄嘌呤氧化酶的活性有所下降，其中，200mg/kg枳椇子多糖治疗的小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的活性比模型组降低了19.63％。

(3)枳椇子多糖改善高尿酸血症引起的肝、肾损伤

脏器指数是各脏器与体重的比值，如表1所示，模型组肝肾指数显著升高说明对肝肾造成了一定的损伤，治疗后肝肾指数显著下降，提示了枳椇子多糖能够减轻高尿酸血症所致的肝肾损伤。

表1枳椇子多糖对高尿酸血症小鼠肝肾指数的影响

注：表中数据为平均值±标准差(n＝6-8)；同列中，^*表示与正常组相比，P＜0.05；^#表示与模型组相比，P＜0.05。

AST和ALT作为临床的常规肝酶参考指标，能够对肝脏损伤评价起到一定的参考价值，AST和ALT升高提示肝功能异常。如图5和图6所示，模型组的血清AST和ALT与正常组相比分别升高了59.15U/L和81.70U/L，与模型组相比，给与枳椇子多糖的治疗组的血清AST和ALT显著降低，且高剂量的枳椇子多糖治疗后的血清AST和ALT水平接近正常组的AST和ALT的水平，同时与阳性药别嘌呤醇组相比，枳椇子多糖治疗后的肝损伤较轻，提示枳椇子多糖一定程度上改善了由高尿酸血症造成的肝损伤并且优于别嘌呤醇。

Cre和BUN均是通过肾脏进行代谢，肾功能不全时，肌酐在体内蓄积成为对人体有害的毒素，而当肾小球滤过率下降时，血尿素氮的浓度迅速升高，因此，Cre和BUN升高表明肾脏功能受损。如图7和图8所示，与正常组相比，模型组血清Cre由14.56μM升高至18.19μM，BUN由10.89mM升高至14.10mM，说明高尿酸血症造起了小鼠肾脏损伤，与模型组相比，治疗后血清Cre和BUN显著降低且高剂量组治疗后的Cre和BUN低于阳性药组，说明枳椇子多糖能够减轻高尿酸血症引起的肾损伤，相比于别嘌呤醇有更高的安全性。

苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法，是石蜡切片技术中常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色可直观的观察组织及细胞的结构，对于病理的判断至关重要。如图9所示，经HE染色拍照的肝肾组织病理学结果显示，与正常组相比，模型组中肝组织的肝索排列紊乱，出现空泡样变以及核溶解现象，肾组织出现肾小管扩张，上皮细胞脱落，微管蛋白形成以及少量炎性浸润，给药后改善了氧嗪酸钾诱导高尿酸血症引起的肝肾损伤。

综上实验结果表明：本发明的枳椇子多糖能够降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠血清尿酸水平，同时可以降低肝脏黄嘌呤氧化酶的活性，并且可以改善高尿酸血症所致的肝肾损伤，且相比于阳性药有更高的安全性。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims

1.一种具有降尿酸作用的枳椇子多糖，其特征在于：所述枳椇子多糖中总糖的含量为45％-55％，蛋白的含量为5％-10％。

2.根据权利要求1所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖，其特征在于：所述枳椇子多糖经酸水解后的单糖组成包括甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。

3.根据权利要求1或2所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖，其特征在于：所述枳椇子多糖的构型为α-构型多糖。

4.如权利要求1至3任一项所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)枳椇子干燥后粉碎过筛，得枳椇子粉；

(3)将步骤(2)得到的枳椇子水提液浓缩，加入乙醇，使乙醇的体积浓度达到70-90％，4℃下过夜静置沉淀，离心10min收集沉淀，沉淀用乙醇浸洗1-3次，干燥，得到枳椇子醇沉物；

5.根据权利要求4所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中粉碎过筛为：粉碎过30-60目筛；

6.根据权利要求5所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖的制备方法，其特征在于：粉碎过40目筛，所述回流提取温度为80℃，回流时间为2h。

7.根据权利要求4所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中乙醇的体积浓度达到80％，乙醇浸洗时加入乙醇的体积为沉淀体积的2-4倍。

8.如权利要求1至3任一项所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备高尿酸血症和/或痛风的药物方面中的应用。

9.如权利要求1至3任一项所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症的血清尿酸、降低肝脏黄嘌呤氧化酶的活性、改善高尿酸血症所致的肝肾损伤的药物方面中的应用。

10.如权利要求1至3任一项所述的具有降尿酸作用的枳椇子多糖在制备降低氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠的血清尿酸、降低肝脏黄嘌呤氧化酶的活性、改善高尿酸血症所致的肝肾损伤的药物方面中的应用。