CN115968907A - 抵抗柑橘黄龙病的组合物及其应用和检测黄龙病的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了抵抗柑橘黄龙病的组合物及其应用和检测黄龙病的方法，涉及柑桔无病毒苗木繁育技术领域。所述组合物包括抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌。本申请通过利用抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌共同使用或单独使用，在盆栽柑橘苗木上进行试验，针对柑桔黄龙病病原，采用PCR和QPCR两种分子检测方法进行跟踪检测，并进行了形态和生理指标观察，从而获得降低病原滴度或杀灭病原的效果，同时具有促进苗木生长作用的处理方法。确定了抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌在抵抗柑橘黄龙病上的有效性，为降低柑橘黄龙病病原的浓度或清除病原，获得健康无病的柑橘母本苗木提供了安全、有效的手段。

Description

抵抗柑橘黄龙病的组合物及其应用和检测黄龙病的方法

技术领域

本申请涉及柑桔无病毒苗木繁育技术领域，具体涉及抵抗柑橘黄龙病的组合物及其应用和检测黄龙病的方法。

背景技术

植物病害的生物防治是利用有益微生物或微生物的代谢产物对植物病害进行防治。与化学防治方法相比，生物防治方法没有农药残留的弊端，对环境友好，有利于人类健康，具有可持续发展的特点(韩长志2015)，因而，越来越受到人们的重视。本专利利用生防菌和生物发酵提取而来的次生代谢物共同应用，探索它们对柑橘黄龙病病原的抑制效果，从而为无病柑橘苗木的繁育，提供方便、安全和有效的方法，为柑桔茎尖微芽嫁接脱毒提供带病浓度低或不带病原的母本材料。

前人研究已发现在芽孢杆菌中有多种益生菌，它们能分泌不同的天然抗菌活性物质，其中，酯肽是一类重要的化合物，多数为环酯肽结构。酯肽中的表面活性素、依枯草菌素、芬原素、杆菌霉素、多粘菌素等是研究最广泛的成分，它们具有表面活性剂的特性，并具有抗真菌、细菌、病毒、肿瘤、抗炎症等功能，应用潜力巨大(李道明等，2022)。酯肽类可能通过拮抗作用对其他有害微生物的活性产生抑制作用，甚至有杀灭作用。尽管芽孢杆菌产生的酯肽的研究取得了较大的进展，具有重要的应用价值，但是，酯肽作为商品应用却十分有限，因为，即使是同一种分子量的酯肽，通常也包含着多种同分异构体，加之获得纯化的和稳定性好的产品还是比较困难的(瞿少伟等，2015)。因此，能够产生酯肽的菌却在多个领域得到更为广泛的应用。

芽孢杆菌属细菌，它广泛存在于生物体和环境中，是一类在农业、工业、医药、食品等领域具有重要应用价值的细菌。其中枯草芽孢杆菌是公认的益生菌，是防治植物病害的化学农药最有前途的替代品，它通常具有促生作用，并能诱导植物提高自身的免疫能力，通过空间和营养竞争直接对微生物的病原产生抵抗，因此，它们在种植业中有着重要的开发利用价值(姚琳2009)。

柑橘病毒病，是指由病毒引起的柑橘病害，柑橘的类似病毒病害是指由类病毒，螺原体，植原体某些细菌引起的柑橘病害。它们的共同特征是系统侵染、嫁接传播。由于柑橘生产中长期采用无性繁殖的方式繁育苗木，且病害种类繁多，导致苗木感染一种或同时感染几种细菌、病毒、类病毒的病害(林雄杰等2012)。危害柑橘生产的常见病害主要有20多种，包括：柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing，HLB)、衰退病(Citrus tristeza virus，CTV)、黄脉病(Citrus yellow vein clearing virus)、碎叶病(Citrus tatter leafvirus，CTLV)、裂皮病(Citrus excocortis viroid，CEVd)等(李红叶等2000)。

然而，目前对于这些病害尚未发现有效的根治方法。其中，柑橘黄龙病是对我国乃至世界柑橘产业造成严重威胁的病害。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于能够提供一种抵抗柑橘黄龙病的组合物及其应用和检测黄龙病的方法，旨在解决上述背景技术中存在的无有效控制柑橘黄龙病方法的问题。

为了实现上述技术目的，本申请主要采用如下技术方案：

第一方面，本申请提供了一种抵抗柑橘黄龙病的组合物，所述组合物包括抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌。

第二方面，本申请提供了一种如第一方面所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用。

第三方面，本申请提供了一种如第二方面所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法，所述应用方法为：将所述抵抗柑橘黄龙病的组合物稀释后对柑橘苗木进行叶面喷施和灌根处理。

第四方面，本申请提供了一种利用第三方面所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法在培育柑橘无病毒苗木中的应用。

第五方面，本申请提供了一种检测经过第四方面所述的应用方法处理后的柑橘苗木中黄龙病的方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘叶片组DNA，

(2)以柑橘黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c对柑橘叶片DNA进行PCR扩增，以黄龙病病原质粒载体作为阳性对照，灭菌的蒸馏水作为阴性对照，出现目标条带的样品即认为是含有黄龙病的阳性植株；

或；

以A04为目标基因、COX为看家基因，进行实时定量PCR分析，以经实验室检测为阳性植株的‘砂糖橘’叶片DNA作为qPCR的阳性对照，试验数据采用2^－△△CT法进行分析，若样品的2^－△△CT值大于1则认为是黄龙病阳性植株。

与现有技术相比，本申请至少具有如下有益效果：

本申请通过利用抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌共同使用或单独使用，在盆栽春见苗木上进行试验，采用PCR和QPCR针对柑桔黄龙病病原进行跟踪检测，从而获得抑制病原的生长、繁殖或杀灭病原效果的处理方法，确定了抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌在抵抗柑橘黄龙病上的有效性，为降低柑橘黄龙病病原的浓度或清除病原，获得健康无病的柑橘母本苗木提供了安全、有效的方法。

附图说明

图1为本申请实施例提供的处理前和处理后苗木的生长状况比较图；其中，(a)处理后苗木；(b)处理前苗木；

图2为本申请实施例提供的苗木经处理后形态和生理指标的变化图；其中，(a)SPAD值，(b)氮的含量，(c)叶片投影面积，(d)根冠投影面积；

图3为本申请实施例提供的不同制剂处理前和处理后黄龙病PCR检测的凝胶电泳图。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

本申请实施例提供了一种抵抗柑橘黄龙病的组合物，所述组合物包括抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌。

在一些实施例中，所述抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌的体积比为0.5－2:1。

在一些实施例中，所述抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌的体积比为1:1。

本申请实施例提供了一种如上所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用。

本申请实施例提供了一种如上所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法，所述应用方法为：将所述抵抗柑橘黄龙病的组合物稀释后对柑橘苗木进行叶面喷施和灌根处理。

在一些实施例中，所述应用方法具体为：将抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌粉剂分别用清水各稀释500倍，按抗菌酯肽用量50ml/株和枯草芽孢杆菌用量50ml/株进行叶面喷施；按抗菌酯肽用量500ml/株和枯草芽孢杆菌用量500ml/株进行灌根处理。

本申请实施例提供了一种利用上述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法在培育柑橘无病毒苗木中的应用。

本申请实施例还提供了一种检测经过上述的应用方法处理后的柑橘苗木中黄龙病的方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘叶片组DNA，

(2)以柑橘黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c对柑橘叶片DNA进行PCR扩增，以黄龙病病原质粒载体作为阳性对照，灭菌的蒸馏水作为阴性对照，出现目标条带的样品即认为是含有黄龙病的阳性植株；

或；

以A04为目标基因、COX为看家基因，进行实时定量PCR分析，以经实验室检测为阳性植株的‘砂糖橘’叶片DNA作为qPCR的阳性对照，试验数据采用2^－△△CT法进行分析，若样品的2^－△△CT值大于1则认为是黄龙病阳性植株。

在一些实施例中，所述特异性引物OI1/OI2c中；

正向引物OI1：GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA，如SEQ ID NO.1所示；

反向引物OI2c：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT，如SEQ ID NO.2所示。

在一些实施例中，所述A04中；

正向引物A04+：TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA，如SEQ ID NO.3所示

反向引物A04－：CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA，如SEQ ID NO.4所示；

所述COX中；

正向引物COX+：GTATGCCACGTCGCATTCCAGA，如SEQ ID NO.5所示

反向引物COX－：GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC，如SEQ ID NO.6所示。

下面结合附图对本发明的应用原理做进一步详细说明。

1试验材料和方法

1.1植物材料

柑橘‘春见’苗木隔离种植于华中农业大学农业微生物工程中心院内网棚中。砧木为枳壳，为二年生苗木。苗木的日常管理方法一致，主要采用MS培养基(包含大量元素，微量元素，铁盐的混合溶液)施用量200ml/株，复合肥(N：P：K＝15：15：15)，10g/株，有机肥腐熟发酵的鸡粪20g/株。每间隔10天施用一次，共5次。

1.2抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌处理苗木的方法

抗菌酯肽为生物发酵提取而来的次生代谢物(康植肽)(L1)，枯草芽孢杆菌(生物肥2018准字6534)，均为粉剂(L2)，将两种粉剂用清水各稀释500倍，设计成：L1+L2、L1、L2和CK共4组试验，包含3种处理和1个对照，其中，L1为100ml用于叶面喷布，500ml用于灌根；L2为100ml用于叶面喷布，500ml用于灌根；L1+L2按L1,50ml/株+L2 50ml/株进行叶面喷施，L1用量500ml/株+L2用量500ml/株进行灌根处理，CK苗木用100ml清水叶面喷，500ml的清水灌根处理。从2022年6月中旬开始试验到2022年9月下旬，间隔7天进行一次处理，共处理15次，然后，取当年生枝条从顶稍往下数第2－3片叶，东、南、西、北四个方向的叶片，剪取柑橘叶脉放在离心管中冰浴保存，带回实验室后用液氮处理，将样品保存于－80℃冰箱备用，用于黄龙病的分子检测。

1.3柑橘黄龙病的PCR和QPCR检测方法

1.3.1DNA提取

采用CTAB法提取柑橘叶脉基因组DNA，利用植物基因组DNA提取试剂盒(编号ZP309－30)，提取柑桔叶脉的DNA，操作过程按照产品说明书进行，当DNA达到质量标准时，用于后续的分子检测。

1.3.2柑橘黄龙病病原的PCR和qPCR检测

用OI1/OI2c引物对进行PCR扩增，扩增程序为：94℃，变性3min，94℃，变性30sec，62℃，退火30sec，72℃，延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。灭菌的蒸馏水作为阴性对照，利用本实验室有黄龙病病原目标片段的质粒作为阳性对照。每个样品重复检测3次。能扩增出目标条带的样品即认为是阳性植株。

表1引物信息

利用Corbett RG 6000(德国)荧光定量PCR仪进行实时定量PCR分析。引物信息见表1。A04为目标基因，COX为看家基因。黄龙病病原的实时荧光定量PCR检测步骤为：94℃，变性3min，94℃，变性5sec，56℃，退火30sec，72℃，延伸35sec，共35个循环，72℃，10min。每个样品设置3次生物学重复。健康的‘暗柳橙’的愈伤组织DNA作为阴性对照，将其2－△△CT值设定为1。经实验室检测为阳性植株的‘砂糖橘’叶片DNA作为qPCR的阳性对照。试验数据采用2－△△CT法进行分析，若样品的2－△△CT值大于1则认为是黄龙病阳性植株。

2结果

2.1春见苗木的形态和生理特征的变化

研究表明，原始试验苗木生长状态相对一致，经过枯草芽孢杆菌和抗菌酯肽共同处理(L1+L2)或单独处理(L1、L2)后，与对照相比，苗木的生长状况表现出差异。L1+L2处理后苗木的地上部分生长势比L2处理、L1处理和对照要好(见图1a&1b)；L1+L2处理的SPAD值和含N量大于对照，其差异达均到显著水平(P<0.05)(图2a&2b)；L1+L2、L1处理后叶片投影面积与L2处理和对照相比明显增大，差异达到显著水平(P<0.05)(图2c)；L1+L2处理和L1处理的苗木根系发达，新根生长茂盛，其效果明显比L2处理和对照要好，差异达到显著水平(P<0.05)(图2d)。这说明：枯草芽孢杆菌处理和抗菌酯肽共同处理后，苗木的生长状况明显改善，柑桔植株的活力增强。

2.2不同制剂处理前和处理后春见苗木柑橘黄龙病病原的变化

根据PCR检测和QPCR两种方法的检测，对处理前和处理后苗木的黄龙病进行判断，其中，如果有一种方法检测为阳性，即认为苗木为阳性植株。试验材料均是在处理前采用PCR检测和QPCR两种方法综合评价为黄龙病阳性的苗木，每种处理有6个生物学重复。结果表明：当抗菌酯肽(L1)和枯草芽孢杆菌(L2)同时处理时，黄龙病阳性率为50％，单独用L2处理时黄龙病阳性率为66.7％，单独用L1处理时黄龙病阳性率为50％，对照样品的阳性率为83.3％，说明抗菌酯肽(L1)和枯草芽孢杆菌(L2)共同使用，对于降低柑桔苗木韧皮部杆菌的滴度的结果最佳，比抗菌酯肽(L1)单独使用要好，比枯草芽孢杆菌(L2)单独使用要好。对照样品可能受到温度变化的影响，有1个样品阳性变为阴性(见下表2和图2)。

表2抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌处理前、后春见的黄龙病检测结果

注：公式：ΔΔCT＝(CT目标基因－CT看家基因)x－(CT目标基因－CT看家基因)ckX为处理，o为对照。QPCR是采用上述公式进行计算，2^－ΔΔCT是目标基因的相对表达量用该数据衡量黄龙病病原的阳性还是阴性，当2^－ΔΔCT<1时或＝1是，样品为阴性，当2^－ΔΔCT>1时，样品为阳性。

由此可见：抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌共同处理苗木，能明显地改善使柑桔苗木的生长状况，增加叶绿素SPAD值，增加叶面积，促进新根萌发和根系旺盛生长，增强柑桔植株的活力。PCR检测和QPCR两种分子检测方法综合评价表明，抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌(L1+L2)共同处理、L2处理和L1处理各处理15次后，柑桔黄龙病的阳性率分别从100％降到50％、66.7％和50％，从而为柑桔脱毒培育无病苗木提供了适用的母本材料。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抵抗柑橘黄龙病的组合物，所述组合物包括抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物，所述抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌的体积比为0.5～2:1。

3.根据权利要求1所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物，所述抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌的体积比为1:1。

4.如权利要求1～3任一项所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用。

5.一种如权利要求4所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法，所述应用方法为：将所述抵抗柑橘黄龙病的组合物稀释后对柑橘苗木进行叶面喷施和灌根处理。

6.根据权利要求5所述的抵抗柑橘黄龙病的组合物在抗柑橘黄龙病中的应用方法，所述应用方法具体为：将抗菌酯肽和枯草芽孢杆菌粉剂分别用清水各稀释500倍，按抗菌酯肽用量50ml/株和枯草芽孢杆菌用量50ml/株进行叶面喷施；按抗菌酯肽用量500ml/株和枯草芽孢杆菌用量500ml/株进行灌根处理。

7.权利要求1～3任一所述的组合物在培育抗柑橘黄龙病的柑橘无病毒苗木中的用途。

8.一种检测经过权利要求5或6所述的应用方法处理后的柑橘苗木中黄龙病的方法，包括如下步骤：

(1)提取柑橘叶片组DNA，

(2)以柑橘黄龙病菌特异性引物OI1/OI2c对柑橘叶片DNA进行PCR扩增，以黄龙病病原质粒载体作为阳性对照，灭菌的蒸馏水作为阴性对照，出现目标条带的样品即认为是含有黄龙病的阳性植株；

或；

以A04为目标基因、COX为看家基因，进行实时定量PCR分析，以经实验室检测为阳性植株的‘砂糖橘’叶片DNA作为qPCR的阳性对照，试验数据采用2^－△△CT法进行分析，若样品的2^－△△CT值大于1则认为是黄龙病阳性植株。

9.根据权利要求8所述的检测处理后的柑橘苗木中黄龙病的方法，所述特异性引物OI1/OI2c中；

正向引物OI1：GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA

反向引物OI2c：GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT。

10.根据权利要求8所述的检测处理后的柑橘苗木中黄龙病的方法，所述A04中；

正向引物A04+：TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA

反向引物A04－：CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA；

所述COX中；

正向引物COX+：GTATGCCACGTCGCATTCCAGA反向引物COX－：GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC。

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