CN113243387B - 一种防治柑橘类黄龙病的药物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防治柑橘类黄龙病的药物及方法。所述药物包含噻唑啉与络氨铜，所述方法具体是依次施用噻唑啉与络氨铜，两者联用用于柑橘类黄龙病的治疗与防控。实验结果显示，该方案对黄龙病治疗效果显著，且治疗方法可以有很长的持续性。同时我们对防控机制也做了探究，为黄龙病机制以及防控手段的研究提供了新的方向和思路。本发明对于黄龙病的治疗与防控具有重要的应用价值和前景。

Description

一种防治柑橘类黄龙病的药物及方法
技术领域
本发明属于农业技术领域。具体涉及一种防治柑橘类黄龙病的药物及方法。
背景技术
柑橘黄龙病即柑橘绿化病，是一种严重的柑橘毁灭性病害，典型症状包括芽黄、叶面斑驳、叶脉堵塞、水果早熟、果实干瘪偏小、树枝枯萎和树木死亡，降低了水果的产量和品质，同时严重损害了柑橘树的生长。黄龙病树每年损失的平均产量为总产量的30-100％，且通常在感病后2～5年内丧失结果能力或死亡，若不及时防治，其蔓延速度十分惊人，被称为柑橘“癌症”，影响着全世界的柑橘产业，是国内外柑橘产业头号检疫性病害。
目前，果农一般根据叶片症状诊断柑橘类黄龙病，但是这不够准确。而当前控制黄龙病的策略包括严格植物检疫、培育无毒苗、高温治疗、给树干注射药液(如抗生素、青霉素、链霉素、四环素等)、隔离传播载体柑橘木虱、及时挖除病株并妥善管理果园(如专利201910492760.1、201910508577.6等)。然而由于种种原因的限制，这些控制方法效果有限，部分相关研究尚处于初步阶段，效果的连续性也尚未得到证实，无法从根本上解决问题。
目前，柑橘黄龙病尚无有效防治手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以有效治疗柑橘类黄龙病的药物。
本发明另一目的是提供一种可以有效治疗柑橘类黄龙病的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
我们研究结果表明，一颗黄龙病柑橘树中带有韧皮部脱落且木质部暴露的根部的黄龙病细菌CLas(与Ca.Las相同)含量比叶片和没有韧皮部脱落且木质部暴露的根部的黄龙病细菌含量要高，因此韧皮部脱落且木质部暴露可以作为检测柑橘类黄龙病感染程度的标志物，且韧皮部脱落且木质部暴露的根为我们提供了一种了解黄龙病机制的新方向。为了研究络氨铜控制柑橘黄龙病的可能性，我们将柑橘枝条浸泡在不同浓度的络氨铜中，发现黄龙病体内的噬菌体marker基因FP1-GP235和FP2-GP240的相对拷贝数显著增加，这表明络氨铜可能有效控制黄龙病的作用，因此我们继续用与黄龙病亲缘关系很近的Agrobacterium tumefaciens和Sinorhizobium meliloti为材料，发现400μg/ml络氨铜处理，抑菌率分别达到50％and 100％。进一步的研究表明，噻唑啉和络氨铜联合治疗可以通过抑制黄龙病细菌CLas含量以及治疗后90天后长出新的根和叶来更有效地控制黄龙病。更进一步地，为了探索治疗的机理，我们还进行了转录组实验，结果表明PR1的基因表达水平、治疗后细胞分裂和芽萌生明显改善，以及根据转录组苯丙烷代谢途径中的上调基因可以推测出来flavonoid，scopolin，tyrosine等含量增加可能促进有益菌的生长。总而言之，我们研究显示，噻唑啉和络氨铜联合治疗可以有效控制柑橘黄龙病。
基于此研究结果，本发明要求保护如下方案：
噻唑啉与络氨铜联用在防治柑橘类黄龙病中的应用。
噻唑啉与络氨铜联用在制备柑橘类黄龙病防治药物中的应用。
优选地，噻唑啉与络氨铜的使用浓度分别为：50-90％噻唑啉稀释1000-3000倍，100-600μg/ml络氨铜。
更优选地，噻唑啉与络氨铜的使用浓度分别为：60-80％噻唑啉稀释1500-2500倍，200-600μg/ml络氨铜。
最优选地，噻唑啉与络氨铜的使用浓度分别为：75％噻唑啉稀释2000倍，200μg/ml络氨铜。
因此本发明还提供一种可以有效治疗柑橘类黄龙病的药物，该药物含有噻唑啉与络氨铜。
优选地，所述药物中，噻唑啉和络氨铜的用量比按照如下标准计：50-90％噻唑啉经稀释1000-3000倍：100-600μg/ml络氨铜。
更优选地，所述药物中，噻唑啉和络氨铜的用量比按照如下标准计：60-80％噻唑啉经稀释1500-2500倍：200-600μg/ml络氨铜。
最优选地，所述药物中，噻唑啉和络氨铜的用量比按照如下标准计：75％噻唑啉经稀释2000倍：200μg/ml络氨铜。
基于此本发明还提供一种可以有效治疗柑橘类黄龙病的方法，具体是利用上述药物进行防治。
优选地，所述治疗柑橘类黄龙病的方法是：选择无雨水的日子，先用噻唑啉喷施树木根部土壤，2-5天后施用络氨铜浇灌根部。
更优选地，所述治疗柑橘类黄龙病的方法是：选择晴天的日子，先将50-90％噻唑啉稀释1000-3000倍后喷施根部土壤，2-5天后施用1-5次100-600μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天左右。
更优选地，所述治疗柑橘类黄龙病的方法是：选择晴天的日子，先将60-80％噻唑啉稀释1500-2500倍后喷施根部土壤，2-5天后施用1-3次200-600μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天左右。
最优选地，所述治疗柑橘类黄龙病的方法是：选择晴天的日子，先将75％噻唑啉稀释2000倍后喷施根部土壤，3天后施用1-2次200μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天左右。
另外具体操作时根据柑橘黄龙病感染程度决定施用量，病情越严重药物施用量相对高一些。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的有效防控黄龙病的新药物方案和治疗方法，具体是将噻唑啉和络氨铜联用用于黄龙病的治疗与控制。该方案对黄龙病治疗效果显著，且治疗方法可以有很长的持续性。
同时我们对防控机制也做了探究，为黄龙病机制以及防控手段的研究提供了新的方向和思路。本发明对于黄龙病的治疗与防控具有重要的应用价值和前景。
附图说明
图1为药物使用和药物治疗根部示意图。(A)两种根部药物治疗的具体位置，络氨铜靶向治疗位置最终是在韧皮部杀死黄龙病菌CLas，噻唑啉通过消灭根结线虫主要作用部位是薄壁组织和中柱鞘。(B)使用两种药物进行治疗的示意图，根部用噻唑啉(2000x)和络氨铜(200μg/ml)处理。
图2为不同感染程度HLB的视觉评价。1，2，3-疾病的中晚期。4，5，6-疾病的早期阶段
图3为柑桔感染HLB早期不同部位的检测。A)1-叶；2-没有-韧皮部脱落且木质部暴露的根；3-韧皮部脱落且木质部暴露的根。B)不同样品的Ca.Las滴度(每克植物组织细胞数)。C)在ERRX(韧皮部脱落且木质部暴露的根)根部检测到SDE1的表达水平远高于叶片。每个实验重复三次。
图4为不同样品中黄龙病细菌的数量(每克植物组织中的细胞数)。(A)1-有中度感染症状的叶子，2-有严重感染症状的叶子，3-没有-韧皮部脱落且木质部暴露的根，4-韧皮部脱落且木质部暴露的根。(B)不同样品的黄龙病细菌Ca.Las滴度，每个实验重复3次。星号(*)表示差异显着(P<0.05；Dunnett’s test)。
图5噻唑啉和络氨铜的抑菌实验及使用络氨铜治疗后FP1-GP235和FP2-GP240的相对表达量。(A)噻唑啉的抑菌率；(B)络氨铜的抑菌率；(C)FP1-GP235基因的相对表达量；(D)FP2-GP240基因的相对表达量；数据以平均值±标准误差表示(n＝3)。我们用与黄龙病亲缘关系很近的Agrobacteriumtumefaciens和Sinorhizobium meliloti为材料，发现400μg/ml络氨铜处理，抑菌率分别达到50％and 100％，这暗示络氨铜可能有抑制黄龙病菌的能力。随着络氨铜处理浓度的增加FP1-GP235和FP2-GP240的相对表达量显著增加，这表明抗黄龙病的噬菌体在增加，说明络氨铜可能有效控制了黄龙病菌的繁殖(P<0.05)。
图6为分别使用噻唑啉和络氨铜单独治疗以及噻唑啉与络氨铜联合治疗30天后的根部状态比较。(A)用噻唑啉处理过的根。(B)用络氨铜处理过的根。(C)用两种药物(噻唑啉；络氨铜)联合处理过的根。黄色箭头表示韧皮部脱落且木质部暴露，红色箭头表示新的根。
图7为使用两种药物(噻唑啉；络氨铜)联合治疗90天后，黄龙病得到有效控制。(A)治疗前叶片的症状。(B)治疗3个月后叶片的症状。(C)治疗3个月后根部的症状。(D)治疗后不同时间的黄龙病细菌滴度CLas变化。用水作为对照(WSC)。星号(*)表示WSC和络氨铜之间有显着差异(P<0.05；Dunnett’s test)。实线表示WSC，虚线表示用2种药物联合治疗。
图8为两种药物联合治疗前后样本的根和叶的变化。A)处理前的根系生长状况。B)处理1个月后的根系生长状况。C)处理前叶片表面状态。D)叶面处理1个月后的状态。ABCD都表示同一棵树。
图9为两种药物联合治疗后受感染树木的产量与上一年产量的比较(受黄龙病(HLB)感染越严重的树木治疗后效果越显著)；表明两种药物联合应用可有效地治疗HLB。A)柑桔治疗前症状。B)柑桔经3个月处理后的症状。C)柑桔经5个月处理后的症状。D)柑桔经9个月处理后的症状。E)表明不同程度HLB感染的治疗前后的果实产量比较：严重、一般、中度。试验田I药物治疗后(2014-2015年)与上年产量(2013-2014年)比较，试验田II没有药物治疗的严重的HLB柑橘果实产量无差异。
图10为差异表达基因(DEGs)分析结果。A)A组和B组DEGs的维恩图A-治疗前，B-治疗后。B)两个阶段(治疗前和治疗后)的火山图。横坐标表示治疗组和对照组基因的表达倍数变化(log2倍变化)，纵坐标表示治疗组和对照组基因表达差异的显著性水平(-log10padj)。上调基因用红点表示。下调基因用绿点表示。蓝色表示的是无显著性差异的变化。我们发现有527个基因上调，1050个基因下调，22270个基因无显著差异。
图11为差异表达基因(DEGs)在治疗前后的表达谱。用K-均值法对差异表达蛋白进行聚类分析的热图。颜色表示折叠变化(红色表示上调；蓝色表示下调，均为BvsA)。
图12为GO富集统计图。(A)GO富集的散点图，用于对所有基因和不同表达的基因进行综合分析。横坐标为注释到GO Term上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为GOTerm，点的大小代表GO Term上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小。(B)GO分析的柱状图。从GO富集分析结果中，选取最显著的30个Term绘制柱状图。图中横坐标为GOTerm，纵坐标为GO Term富集的显著性水平，数值越高越显著，不同颜色分别代表BP，CC，MF三个GO子类。
图13为KEGG富集统计图。(A)KEGG富集的散点图，用于对所有基因和不同表达的基因进行综合分析。横坐标为KEGG通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为KEGG通路，点的大小代表KEGG通路上的基因数，颜色从红到紫代表富集的显著性大小，该图显示了治疗后比治疗前上调的基因。(B)KEGG分析的柱状图。从KEGG富集结果中，选取最显著的20个KEGG通路绘制柱状图，横坐标为KEGG通路，纵坐标为通路富集的显著性水平，数值越高越显著。
图14为植物激素信号转导途径(cic04075)。红色箭头指示治疗后基因表达水平上调，绿色箭头指示治疗后基因表达水平下调。垂直虚线表示细胞膜，垂直实线表示细胞壁。
图15为苯丙氨酸相关代谢通路的次级代谢。红色箭头表示用两种药物(噻唑啉、络氨铜)联合处理后的基因表达水平上调，用黄色字符表示的次级代谢产物产生了有益的细菌并且激活了植物抗性基因的表达。PAL表示苯丙氨酸氨裂解酶；C4H表示4-羟化酶。
图16为通过qRT-PCR验证转录组结果。9个差异表达基因(差异基因)的相对表达涉及苯丙烷代谢和葡萄糖醛酸酯相互转化(cic00040)，类黄酮生物合成(cic00941)和植物激素信号传导(cic04075)。C4H对应的基因为Ciclev10000921m，PAL对应的基因为Ciclev10027912m；PGA对应的基因为Ciclev10004783m；PR-1对应的基因为Ciclev10029459m；beta-glucosidase对应的基因为Ciclev10028018m；AHP对应的基因为Ciclev10029493m。(参与苯丙烷生物合成代谢途径(CIC00 940)的基因包括一个PAL基因(苯丙氨酸解氨酶)、一个C4H基因(肉桂酸4-羟化酶)、一个β-葡萄糖苷酶基因和一个POD基因(过氧化物酶)。一个PGA酶基因和一个果胶酯酶参与戊糖和葡萄糖醛酸盐相互转化的代谢途径。一个PR1基因(病原相关基因-1)和一个AHP基因(含组氨酸磷酸转移蛋白)参与植物激素信号转导。)
图17为噻唑啉和络氨铜的治疗机理图。红色箭头表示治疗后基因表达水平上调；蓝色箭头表示特定的治疗途径；红色字符的PR1表示治疗后基因表达水平上调。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例主要包括三大实验：(1)络氨铜治疗实验；(2)噻唑啉和络氨铜联用治疗实验；(3)转录组实验(探索治疗机理)。
实施例1
一、实验材料与方法
1.1.实验植物材料
(1)实验室培养感病枝条：2016年4月，我们将感染了黄龙病的沙糖桔树嫁接到健康的2年沙糖桔幼苗上，然后将其保存在培养室中培养。10个月后，叶片上出现静脉阻塞和斑点的典型黄龙病症状。
(2)野外试验田I：来自中国广东省果园-黄龙病感染的约10年的沙糖桔树。
(3)野外试验田II：来自中国江西省赣州市果园-感染黄龙病脐橙树约十年大的树。
(4)为了最大程度地减少黄龙病细菌分布不均的影响，采样方法如下：
在用络氨铜浸泡离体枝条的实验中，采样方法：在顶部收集一片叶子，底部收集一片叶子，中间收集一片叶子。在两种药物(噻唑啉；络氨铜)联合治疗柑橘类黄龙病的实验中，采样方法：收集顶部的三片叶子，底部的三片叶子和中间的三片叶子；收集后称重，将其保持在-80℃的冰箱中。
另外根组织的采样方法：在距树干2英尺范围内的四个不同象限中，从土壤表面以下2-5英寸处收集柑橘根组织，然后将其在室温(20℃～25℃)的纸袋中风干约24小时，以方便用手指轻拍去除过多的土壤污垢。
样品采集后立即进行治疗，根或者叶片材料放在冰箱中保持在-80℃。
对于转录组实验，我们的根纤维样品来自中国广东省广州市的沙糖桔树根。
1.2.实验分组与处理方法
1.2.1.络氨铜治疗
实验用的是有黄龙病感染症状的直径约0.5-0.8厘米的柑橘树枝(沙糖桔)。每个枝条包括约20-24片叶子，然后将枝条浸入在15ml的试管中，试管里装有不同浓度的络氨铜(50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml)，试管外面用铝箔纸覆盖，将只用水浸泡作对照。在络氨铜治疗后1h，5h，12h，1d，3d和5d收集叶片样品。每个实验至少重复三次。
1.2.2.两种药物联合治疗(噻唑啉；络氨铜)
(1)培养室治疗试验
培养室中的治疗试验分为联合治疗组(噻唑啉和络氨铜两种药物联用)和对照组(水处理)，每组三棵树。
联合治疗方法如下：首先用噻唑啉(稀释2000倍)(河北三农农化有限公司)浸泡柑橘树的根。3-5天后，使用200μg/ml络氨铜喷洒柑橘根(图1)。在治疗后的第0、15、30、60、90和120天收集叶片样品。
(2)野外实验：
野外治疗受黄龙病感染的树木的方法类似于培养室治疗。选择天晴的日子，先将75％噻唑啉稀释2000倍后喷施树木根部土壤，3天后施用1-2次200μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天左右。
野外试验田为示范面积为40000平方米的脐橙果园，始于2015年3月，截至2015年11月。我们将试验分为A组和B组。A组用两种药物(噻唑啉和络氨铜)联合治疗，B组用水处理作为对照。根据黄龙病的感染程度将每组进一步分为3类，如重度感染，中度感染，轻度感染，之后与上一年度(2014-2015年)的产量相比。
1.3.定量PCR实验方法
1.3.1DNA和RNA提取
使用液氮在研钵中快速研磨-80℃收集称重的叶片中脉或纤维根组织。按照厂家提供的说明书，使用生工生物工程股份有限公司(中国上海Sangon)的基因组DNA提取试剂盒提取总基因组DNA。这些基因组DNA被用作模板，以进行qPCR检测黄龙病细菌CLas含量和FP1-GP235和FP2-GP240的相对拷贝数。按照厂家提供的说明，使用生工(中国上海Sangon)的RNA提取试剂盒提取总RNA。使用NanoDrop ND-1000测定RNA样品的含量。将RNA浓度调节至200ng/μl作为模板，使用PrimeScriptTM RT Master Mix Kit(中国辽宁省TAKARA)反转录获得cDNA，并以cDNA为模板进行qPCR以获取相对表达量。所有qPCR反应均重复至少3次。
1.3.2.黄龙病细菌CLas含量测量
嵌入柑橘黄龙病原16S rDNA的重组质粒pMD-19来自广东省农业科学院。通过qPCR测定黄龙病细菌含量，使用特异性引物(黄龙病asf，黄龙病r和黄龙病-p-Table.1)-特异性针对黄龙病细菌的16S rDNA区域的引物黄龙病asf和黄龙病r被用作黄龙病细菌的参考，将7种梯度16S rDNA的重组质粒pMD-19稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5个、10-6、10-7，7个梯度分别作为模板，以ddH2O为空白对照。健康的柑橘叶片DNA样品为阴性对照，重复了3次以上的实验。实验均在qPCR仪器Applied Biosystems QuantstudionTM 6Flex中进行，得到相应的标准曲线y＝-3.2215x+35.238，R2＝0.9965(y表示Ct值，x表示lg(病原体拷贝数)。
对于TaqMan实时定量PCR，反应混合物的总体积为20μl：引物HLBasf和HLBr(中国上海Sangon)分别为0.4μl，探针HLBp(辽宁Takara)为0.4μl，TaqMan混合液(中国辽宁省TAKARA)为10μl，DNA模板为1μl，水为7.8μl。实时定量PCR程序如下：95℃5min，95℃30s，60℃30s；40个循环。表中列出了所有引物参照表1，计算方法参考Li(Li,W.,L.Levy,andJ.S.Hartung,Quantitative distribution of‘Candidatus Liberibacter asiaticus’incitrus plants with citrus huanglongbing.Phytopathology,2009.99(2):p.139-144)。
表1.实时PCR引物和探针的寡核苷酸序列
Figure BDA0002382518730000091
a其他鸟嘌呤核苷酸(粗体，带下划线“G”)被添加到黄龙病as序列63基于16S rDNA序列在‘Ca.Liberibacter asiaticus’Psy62基因组被称为HLBasf
b 6-FAMTM在5’末端
c Iowa Black FQ在3’末端
1.3.3.FP1和FP2相对拷贝数
将CLas的16s rDNA用作内参，以检测FP1-GP235和FP2-GP240的相对拷贝数。表1中列出了所有引物。对于以基因组DNA为模板的SYBR实时定量PCR，每个反应均包含以下成分，总体积为20μl：引物为0.4μl，SYBR Mix为10μl，DNA为1μl，水为8.2μl。所有反应均重复三次。实时定量PCR程序如下：95℃5min，95℃30s，60℃30s。40个循环，计算方法参考Ding(Ding,F.,et al.,Molecular mechanisms underlying heat or tetracyclinetreatments for citrus HLB control.Horticulture research,2018.5(1):p.30)。
1.3.4.SDE1(CLas Sec-delivery effector-1)的基因表达水平
检测SDE1的基因表达水平，我们将柑橘COX基因作为内参。引物见表2。对于SYBR实时PCR，以cDNA为模板，每个反应包含以下成分，总体积为20μl：引物为0.4μl，SYBR Mix为10μl，cDNA为1μl，水为8.2μl。所有反应均一式三份进行，实时qPCR程序如下：95℃5min，95℃10s，60℃20s。40个循环。SDE1计算方法的基因表达水平参考Pagliaccia D(Pagliaccia,D.,et al.,A pathogen secreted protein as a detection marker for CitrusHuanglongbing.Frontiers in microbiology,2017.8:p.2041)。
表2.SDE1及COX基因引物序列
Figure BDA0002382518730000101
1.4.RNA-seq数据分析过程
我们将两种药物治疗后的根纤维命名为A组，将治疗前的根纤维命名为B组。从每个组中获取每个样品的三个重复样本。如上所述的采样方法。我们将样品发送到北京诺和基因技术有限公司进行转录组分析。
1.5.通过qPCR验证RNA-seq
为了验证RNA-seq的结果，通过qPCR比较差异基因相对丰度变化，该变化涉及苯丙烷代谢、葡糖醛酸相互转化(cic00040)、类黄酮生物合成(cic00941)和植物激素信号转导(cic04075)(表3)，以cDNA为模板，每个反应均包含以下组分，总体积为20μl：引物为0.4μl，SYBR Mix为10μl，cDNA为1μl，水为8.2μl。所有反应均一式三份进行，实时qPCR程序如下：95℃5min，95℃10s，60℃20s.40个循环。选择GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内部参照基因，并用Ct法(2-ΔΔCt)计算相对表达量。
表3.治疗前后三种途径中差异基因的变化情况列表
Figure BDA0002382518730000102
Figure BDA0002382518730000111
PAL,phenylalanine ammonia lyase；C4H,cinnamate 4-hydroxylase；4CL,4-coumaroyl CoA ligase.
1.6.数据分析
每个实验至少重复三遍。使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)，p<0.05，p<0.01和p<0.001被认为具有统计学意义。给出的数据是三个生物学重复的平均值，具有标准误。首先通过方差分析(ANOVA)分析络氨铜对FP1-GP235和FP2-GP240拷贝数的影响，然后通过Tukey的真实显着差异检验确定治疗之间的成对比较。所有统计分析均使用软件spss statistics 23进行，显着性水平设置为0.05。
二、实验结果
2.1.柑橘韧皮部脱落且木质部暴露中的黄龙病细菌含量高于叶片和非韧皮部脱落且木质部暴露的根部
叶子的症状是判断其是否感染了黄龙病的关键。我们研究了黄龙病不同侵染阶段的根与叶表面之间的差异，我们已经定义了在受感染的黄龙病的早期，中期和后期叶片的不同症状(图2)。
在早期，韧皮部脱落且木质部暴露根>非韧皮部脱落且木质部暴露根>叶的黄龙病细菌含量(每克植物组织细胞)(图3)。我们发现韧皮部脱落且木质部暴露根中SDE1的基因表达也高于叶片中的表达(图3)。
同时，在黄龙病感染中后期，黄龙病细菌CLas含量的结果如下-韧皮部脱落且木质部暴露根>严重症状叶片>非韧皮部脱落且木质部暴露根>中度症状叶片(图4)。
这些结果表明，在整个感染期间，韧皮部脱落且木质部暴露的黄龙病细菌含量高于叶片，因此韧皮部脱落且木质部暴露根可以在野外进行肉眼诊断时用作黄龙病诊断的标志物。
2.2.络氨铜有效抑制S.meliloti和Agrobacterium tumefaciens
因为到目前为止Ca.Las还没有有效的方法获取，我们根据报道选用两种菌(S.meliloti and Agrobacterium tumefaciens)与Ca.Las相近亲缘关系来进行抑菌实验(Stover,Stange et al.,2013,Hu,Akula et al.,2016)。我们发现络氨铜在100μg/ml到200μg/ml时就能有效地抑制S.meliloti的生长，抑菌率达到75％在200μg/ml,400μg/ml时抑菌率达到100％，而噻唑啉对于S.meliloti的抑菌率比较低(图5A&5B).络氨铜在400μg/ml时对Agrobacterium tumefaciens的抑菌率到达50％，在800μg/ml，抑菌率达到100％，相似的噻唑啉的抑菌率也很低(图5A&5B)。根据我们的结果，我们可以推测络氨铜对黄龙病也具有很大的抑制作用。噻唑啉主要破坏根结线虫，所以对HLB有弱的抗菌作用。
2.3.FP1-GP235和FP2-GP240对络氨铜治疗的有效性探讨
一种新颖的黄龙病控制策略是增强黄龙病细菌中的Ca.Las prophages向噬菌体的内源转化(Ding,F.,et al.,Molecular mechanisms underlying heat ortetracycline treatments for citrus HLB control.Horticulture research,2018.5(1):p.30)。为了研究络氨铜控制的柑橘黄龙病的有效性，我们将感染黄龙病的柑橘枝条浸入不同浓度的络氨铜中，分为A(水作为对照)，B(50μg/ml络氨铜)，C(100)微克/毫升络氨铜)和D(200微克/毫升络氨铜)。在络氨铜治疗后1、5和12小时以及在络氨铜治疗后1、3和5天分别收集叶片样品。我们的结果表明，用200μg/ml络氨铜治疗12h后，FP1-GP235的相对拷贝数增加了12倍(图5C)，治疗12h后，FP2-GP240的相对拷贝数增加了约25倍(图5D)。
随着络氨铜浓度的增加，柑橘中FP1-GP235和FP2-GP240的相对拷贝数增加。同时，研究表明黄龙病细菌和根结线虫总是同时感染柑橘树，我们用噻唑啉或络氨铜单独治疗黄龙病并没有取得明显的效果，但是当两种药物联合使用时，其效果变得很明显。图6A示出了单独的噻唑啉治疗的有效性，其不能使韧皮部脱落且木质部暴露根(黄色箭头表示韧皮部脱落且木质部暴露)消失并且没有新的根生长(图6A)。图6B代表单独络氨铜治疗的有效性，少量新根生长(红色箭头表示新根)并且韧皮部脱落且木质部暴露根已显着减少(图6B)。至于两种药物(噻唑啉；络氨铜)的组合治疗，已经长出了许多新的根，并且没有韧皮部脱落且木质部暴露根(图6C)。
2.4.结合两种药物(噻唑啉；络氨铜)可以有效控制柑橘黄龙病
为了确认这两种药物(噻唑啉；络氨铜)在治疗黄龙病中的有效性，我们进行了以下操作：对于培养室治疗。我们进行了两组实验，分为A和B，每组三棵树。A作为对照(用水治疗)，B组则用两种药物(噻唑啉；络氨铜)联合治疗。经过3个月的治疗，我们发现叶子从黄色变成绿色(图7A，7B)，并且长出了许多新的根，我们用标签纸标记了韧皮部脱落且木质部暴露的根部(图7C)。我们的结果表明，治疗30天后，叶片中的黄龙病细菌CLas含量显着降低，治疗90天后，黄龙病细菌CLas含量处于较低水平(图7D)。
在比较治疗前和治疗后的样品时，我们发现治疗后会长出许多新根和新芽(图8)。为了进一步确认该药物可以进行大规模治疗，我们进行了野外治疗。
对于野外治疗：在野外试验I中，我们看到了树木在治疗前后的完整变化过程，叶子从黄色变为绿色，最终果实成熟(图9A-D)。通过比较治疗后和治疗前之间不同感染状态下果树的产量，我们发现黄龙病严重感染的树木在治疗后产量显着提高。然而，对于轻度和中度感染的黄龙病树，其增加幅度略低(图9E)。
这些结果表明，改善根的生长状况和降低柑橘树的黄龙病细菌titers对治疗黄龙病至关重要。
为了更好地了解黄龙病的治疗机制，我们将治疗前和治疗后的根样品寄给了北京诺和公司进行转录组实验。
2.5.RNA-seq数据分析
2.5.1差异基因表达分析
维恩图显示在B(治疗前)和A(治疗后)样品中分别鉴定出18376和18565差异基因。进一步的分析表明，柑桔树(Citrus reticulata Blanco cv。Shatang Ju)的治疗前和治疗后样品之间有17035个差异基因重叠。这意味着B(治疗后)具有1341个独特的差异基因，而A(治疗后)具有1530个独特的差异基因(图10)。进一步的分析我们发现，在B和A的比较中，有527个上调基因和1050个下调基因以及22270个基因无显着差异(图10)。定量分析了治疗前和治疗后的基因表达样品，使用2倍变化标准(p值<0.05)鉴定并分析了总共1578个显着差异表达的基因，通过热图，我们发现治疗前后的基因发生了显着变化(图11)。
2.5.2.GO和KEGG分析
GO(Gene Ontology)是一种国际标准化的蛋白质功能分类系统，是对许多蛋白质功能进行分类的重要工具。GO分析已广泛应用于预测许多生物体中蛋白质的功能。GO数据库由三种组成：分子功能(MF)，细胞成分(CC)和生物过程(BP)(Zhang,C.,et al.,Seedlessmutant‘Wuzi Ougan’(Citrus suavissima Hort.ex Tanaka‘seedless’)and the wildtype were compared by iTRAQ-based quantitative proteomics and integratedlyanalyzed with transcriptome to improve understanding of male sterility.BMCgenetics,2018.19(1):p.106.)。在生物过程类别中，差异基因主要富集在“细胞过程的运动”；“亚细胞成分过程”；“基于移动过程的微管”和“基于过程的微管”。微管的作用主要是维持细胞形态，协助细胞内运输，与其他蛋白质形成颗粒中心体并参与细胞壁形成(图12)。微管运输取决于驱动蛋白，动力蛋白和ATP的可用性。结果表明，治疗后柑橘根的细胞内转运能力和细胞壁的形成均得到增强。至于细胞成分，“细胞壁”和“外部封装结构”是该类别的最主要成分(图12)。就分子功能而言，“微管结合”；“微管蛋白结合”和“微管马达活性”是主要的子类别。这些差异基因可能参与了黄龙病的治疗。
KEGG((Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes))主要是一个的生物过程数据库，包含七个类别：新陈代谢，遗传信息治疗，环境信息治疗，细胞过程，生物系统，人类疾病和药物开发(Zhang,C.,et al.,Seedless mutant‘Wuzi Ougan’(Citrus suavissimaHort.ex Tanaka‘seedless’)and the wild type were compared by iTRAQ-basedquantitative proteomics and integratedly analyzed with transcriptome toimprove understanding of male sterility.BMC genetics,2018.19(1):p.106.)。KEGG途径包括与代谢途径相关的途径。
我们的研究集中在差异最大的苯丙烷类生物合成，戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化(图13)。
2.5.2.GO和KEGG分析
植物激素信号转导对于研究植物抗性也很重要。为了更深入地了解三种代谢途径中差异基因，我们在治疗前和治疗后的途径中进行了差异基因变化的总结(表3)。我们发现，在治疗后的样品中，三个代谢途径的转录水平更高，而且在治疗后的戊糖和葡糖醛酸相互转化的途径中，所有基因均被上调(表3)，这意味着产生了更多的糖来加速柑橘的生长。关于植物激素信号转导的途径，结果表明细胞因子中的AHP(含组氨酸的磷酸转移蛋白)在治疗后显着下调，水杨酸中的PR1明显上调，这有助于细胞分裂和芽萌生以及诱导的植物抗性(图14，表4)。根据先前的研究，已发现苯丙烷生物合成途径的次生代谢产物和相关酶PAL，POD对植物病害具有抗性(Wang，Wang等人，2014)。因此，我们的研究集中在苯丙烷类生物合成的代谢途径上，结果表明，苯丙烷生物合成的代谢途径可以提高治疗后香豆素和scopolin中涉及的相关基因的表达水平，它们具有抗菌活性，并促进根际和根际中有益细菌的生长。同时抑制有害细菌(图15和16)。此外，类黄酮提高了植物的抗药性和对病虫害的抗性。
表4.qPCR引物的寡核苷酸序列(用于确定本文中使用的差异表达基因)
Figure BDA0002382518730000151
Figure BDA0002382518730000161
2.5.3通过qRT-PCR验证RNA-seq
为了证实通过RNA-seq分析获得的结果，根据其差异基因，我们选取了共9种基因(如表4，图16所示)，分别是苯丙烷类生物合成的代谢途径(cic00940)的差异基因：1个C4H基因(肉桂酸4-羟化酶)，1个PAL基因(苯丙氨酸氨裂合酶)，1个β-葡萄糖苷酶基因，1个Ciclev10015700m基因(阿魏酰辅酶A-6羟化酶)，1个POD基因(Ciclev10017908m)；戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化(cic00040)的差异基因：1个果胶酶基因(Ciclev10004719m)，1个PGA酶基因；植物激素信号转导(cic04075)的差异基因：1个PR1基因(与病程相关-1)和1个AHP基因(含组氨酸的磷酸转移蛋白)；这些基因的表达水平基本上在qPCR和RNA-seq数据之间显示出相似的趋势，表明RNA-seq数据是可靠的(图16)。
2.6总结
我们分别验证了使用络氨铜、噻唑啉单独治疗，以及络氨铜和噻唑啉联合治疗的有效性。我们的结果表明，单独使用络氨铜治疗后，少量新根得以生长。结合这两种药物，治疗后可以生长更多的新根，这可能是两种药物(噻唑啉和络氨铜)结合起来治疗柑橘类黄龙病的原因。
然后为了探索噻唑啉和络氨铜的治疗机制，我们还进行了转录组实验。根据实验结果，总结治疗的机制是噻唑啉和络氨铜消除了部分根结线虫抑制了黄龙病细菌的生长，一些新的根吸收了更多的养分和水分，这有助于产生更多的抗性基因和次生代谢产物，从而改善了周围土壤的微生物环境。最终，它形成了一个良性循环，以消除残留的根结线虫和黄龙病细菌(图17)。
本发明为野外研究黄龙病提供了重要的方向，即韧皮部脱落且木质部暴露根是诊断黄龙病的标志物，特别是对于早期诊断。我们的结果表明，将噻唑啉和络氨铜两种药物联合使用可以有效控制柑橘类黄龙病，这对于治疗黄龙病和了解黄龙病的机理奠定了基础和重要意义。
另外经噻唑啉与络氨铜的使用浓度对黄龙病控制效果的影响实验显示，50-90％噻唑啉稀释1000-3000倍，结合100-600μg/ml络氨铜的施用，均可较好的控制柑橘黄龙病。施药方法为先在根部土壤喷施噻唑啉，2-5天后用络氨铜浇灌根部1-3次，每次浇灌时间相隔30天左右。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.噻唑啉与络氨铜联用在防治柑橘类黄龙病中的应用，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：50-90％噻唑啉经稀释1000-3000倍，100-600μg/ml络氨铜；应用方法为先用噻唑啉喷施根部土壤，2-5天后用络氨铜浇灌根部。
2.噻唑啉与络氨铜联用在制备柑橘类黄龙病防治药物中的应用，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：50-90％噻唑啉稀释1000-3000倍，100-600μg/ml络氨铜；应用方法为先用噻唑啉喷施根部土壤，2-5天后用络氨铜浇灌根部。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：60-80％噻唑啉稀释1500-2500倍，200-600μg/ml络氨铜。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：75％噻唑啉稀释2000倍，200μg/ml络氨铜。
5.一种治疗柑橘类黄龙病的药物，其特征在于，含有噻唑啉与络氨铜，噻唑啉和络氨铜的用量比按照如下标准计：50-90％噻唑啉经稀释1000-3000倍：100-600μg/ml络氨铜。
6.根据权利要求5所述药物，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：60-80％噻唑啉经稀释1500-2500倍：200-600μg/ml络氨铜。
7.根据权利要求6所述药物，其特征在于，噻唑啉和络氨铜的用量按照如下标准计：75％噻唑啉经稀释2000倍：200μg/ml络氨铜。
8.一种治疗柑橘类黄龙病的方法，其特征在于，利用权利要求5-7任一所述药物进行防治，具体是先用噻唑啉喷施根部土壤，2-5天后用络氨铜浇灌根部。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，选择无雨水的日子，先用噻唑啉喷施树木根部土壤，2-5天后施用络氨铜浇灌根部。
10.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于，选择晴天的日子，先将50-90％噻唑啉稀释1000-3000倍后喷施根部土壤，2-5天后施用1-5次100-600μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天。
11.根据权利要求10所述方法，其特征在于：选择晴天的日子，先将60-80％噻唑啉稀释1500-2500倍后喷施根部土壤，2-5天后施用1-3次200-600μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天。
12.根据权利要求11所述方法，其特征在于：选择晴天的日子，先将75％噻唑啉稀释2000倍后喷施根部土壤，3天后施用1-2次200μg/ml络氨铜浇灌根部，浇灌时间相隔30天。
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