CN115968831A - 一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种糖尿病并发抑郁症小鼠模型的构建方法，包括：向8周龄，体重质量18‑25gSPF级雄性C57BL小鼠腹腔注射1次用量为150mg/kg的STZ溶液，注射STZ溶液5天后，隔夜禁食12h，不禁水，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖值。若血糖值>11.3mmol/L，则连续7天，每天腹腔注射1次用量为0.5mg/kg的LPS溶液，即得所述小鼠模型。通过旷场实验、高架十字迷宫实验、悬尾实验、强迫游泳实验、糖水偏好实验、血清炎症因子检测对所述模型进行了评价，显示该模型效果良好，可用于糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究或体外药物筛选或药物评价。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，特别是一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，并发症多，能损伤多个靶器官并造成多器官不良危害，严重影响人民健康。2021年国际糖尿病联合会(IDF)发布的数据显示全球成年糖尿病患者人数已高达5.37亿。与正常人群相比，糖尿病病人患抑郁症的风险增加24％，在1型糖尿病和2型糖尿病人群中分别升高3倍和2倍。糖尿病并发抑郁症(Diabetes mellituswith depression,DD)患者自杀危险率高达10％，远高于普通人群的10-30/10万人，因此糖尿病并发抑郁症已成为全球重大公共卫生问题之一并受到广泛关注。
建立动物模型并利用动物疾病模型来研究人类疾病，可以克服平时一些不易见到，而且不便于在病人身上进行实验的各种人类疾病的研究，同时还可克服人类疾病发生发展缓慢、潜伏期长、发病原因多样、经常伴有各种其他各种疾病的发生、发展规律和防治疾病疗效的机理等极为重要的手段和工具。实验动物是生物医学研究中不可或缺的工具，实验动物在探究基因基础功能、探寻疾病的发病机制以及应用药物的临床前筛选等方面有着十分重要的作用。小鼠在发育和代谢上与人类具有极大的相似性，其基因与人类基因也具有极高的相似度(小鼠99％的基因能在人类基因组中找到同源基因)，且其生命周期短，被认为是哺乳动物中理想的模式生物。随着生物医学研究的不断发展，目前尚无一种小鼠模型能够模拟人类DD的临床症状与体征，故极大限制了DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等。
现有与糖尿病和/或抑郁症相关的小鼠模型的技术介绍如下：
现有技术涉及了一种糖尿病共病抑郁的小鼠模型，提供了一种筛选预防和/或治疗I型及Ⅱ型糖尿病的药物的小鼠模型，但不能全面而整体的模拟DD的特点，此外只是局限于糖尿病单病的小鼠模型。关于糖尿病并发抑郁症的小鼠模型，迄今暂未见人报道或申请相关发明专利。因此，提供一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型，这对于DD的病理生理研究、发病机制研究、体外药物筛选和药物评价等，均具有广泛的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法及其应用。
根据本发明一方面，提供了一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，包括：
对小鼠施用STZ溶液，于腹腔注射STZ溶液，注射STZ溶液5天后，隔夜禁食12h，不禁水，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖值；若血糖值>11.3mmol/L视为得所述小鼠模型；若血糖值<11.3mmol/L，则连续7天，每天腹腔注射LPS溶液，即得所述小鼠模型。
作为优选的实施方式，所述的STZ溶液注射量为一次用量150mg/kg，所述的LPS溶液注射量为0.5mg/kg。
作为优选的实施方式，所述小鼠为8周龄SPF级雄性C57BL小鼠，体重质量18-25g。
作为优选的实施方式，所述小鼠模型的培养条件为温度22±2℃，湿度为55±5％，室内12h明暗切换。
作为优选的实施方式，所述STZ溶液包含柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂；所述LPS溶液包含无菌无热原的生理盐水和溶于无菌无热原的生理盐水中的LPS(No.L-2880，Sigma–Aldrich)。
作为优选的实施方式，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的制备方法包括如下步骤：
制备甲溶液：将2.1g柠檬酸溶解于100ml高压灭菌超纯水；
制备乙溶液：将2.9g柠檬酸钠溶解于100ml高压灭菌超纯水；
将甲溶液和乙溶液按照57：43的体积比混合后得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
作为优选的实施方式，所述的STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂的制备方法包括如下步骤：
将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液提前灭菌并预冷到4℃；
称取适量STZ迅速溶解于预冷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，即用即配，获得STZ的终浓度为1％；其中所述制备过程需在冰浴中避光完成，并在10min内注射完毕。
本发明的第二方面在于提供一种第一方面所述的构建方法得到的糖尿病并发抑郁症的小鼠模型。
本发明的第三方面在于提供一种根据第一方面所述的构建方法得到的小鼠模型在筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物中的应用以及在糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究中的应用。
本发明的第四方面在于提供一种筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测试药物施用于第一方面所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；
(2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善小鼠模型糖尿病并发抑郁症病理特征的测试药物。
本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果。借由上述技术方案，本发明提供的方法和装置可取得显著的技术进步性及实用性，并具有产业上的广泛利用价值，其至少具有下列优点：
(1)本发明首次提供一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型，并提供了所述小鼠模型的构建方法，解决了目前本领域存在的缺乏糖尿病并发抑郁症小鼠模型这一技术问题，为糖尿病并发抑郁症的发病机制和干预策略的研究提供了基础；
(2)本发明提供的糖尿病并发抑郁症小鼠模型的构建方法具有成模率高、造模时间短、操作简单的有点，对构建得到的糖尿病并发抑郁症小鼠模型进行实验验证发现，该小鼠模型具有糖尿病并发抑郁症的病理特征，可用于糖尿病并发抑郁症治疗药物的筛选；
(3)与现有技术相比，本发明首次发现只采用注射STZ溶液+LPS溶液的方法即可构建糖尿病并发抑郁症小鼠模型，本发明提供的这一构建方法不仅具有高效、快速、经济的有点，而且极易推广并广泛使用，具有很好的应用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图,详细说明如下。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。本发明的目标及特征考虑到如下结合附图的描述将更加明显，附图中：
图1为根据本发明实施例的小鼠模型中体重测量的结果示意图；
图2-7为根据本发明实施例的小鼠模型中旷场实验的结果示意图；
图8-13为根据本发明实施例的小鼠模型中高架十字迷宫实验的结果示意图；
图14为根据本发明实施例的小鼠模型中悬尾实验的结果示意图；
图15为根据本发明实施例的小鼠模型中强迫游泳实验的结果示意图；
附图中，*表示P<0.05；**表示P<0.01。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的具体实施方式、方法、步骤及其功效，详细说明如后。
通过具体实施方式的说明，当可对本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效得一更加深入且具体的了解，然而所附图式仅是提供参考与说明之用，并非用来对本发明加以限制。
本实施例提供了一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，包括：
对小鼠施用STZ溶液，于腹腔注射STZ溶液，注射STZ溶液5天后，隔夜禁食12h，不禁水，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖值；若血糖值>11.3mmol/L视为得所述小鼠模型；若血糖值<11.3mmol/L，则连续7天，每天腹腔注射LPS溶液，即得所述小鼠模型。
作为优选的实施方式，所述的STZ溶液注射量为一次用量150mg/kg，所述的LPS溶液注射量为0.5mg/kg。
作为优选的实施方式，所述小鼠为8周龄SPF级雄性C57BL小鼠，体重质量18-25g。
作为优选的实施方式，所述小鼠模型的培养条件为温度22±2℃，湿度为55±5％，室内12h明暗切换。
作为优选的实施方式，所述STZ溶液包含柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂；所述LPS溶液包含无菌无热原的生理盐水和溶于无菌无热原的生理盐水中的LPS(No.L-2880，Sigma–Aldrich)。
作为优选的实施方式，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的制备方法包括如下步骤：
制备甲溶液：将2.1g柠檬酸溶解于100ml高压灭菌超纯水；
制备乙溶液：将2.9g柠檬酸钠溶解于100ml高压灭菌超纯水；
将甲溶液和乙溶液按照57：43的体积比混合后得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
作为优选的实施方式，所述的STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂的制备方法包括如下步骤：
将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液提前灭菌并预冷到4℃；
称取适量STZ迅速溶解于预冷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，即用即配，获得STZ的终浓度为1％；其中所述制备过程需在冰浴中避光完成，并在10min内注射完毕。
实施例二
根据实施例一所述的构建方法得到的糖尿病并发抑郁症的小鼠模型。
实施例三
根据实施例一所述的构建方法得到的小鼠模型在筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物中的应用以及在糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究中的应用。
实施例四
一种筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测试药物施用于第一方面所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；
(2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善小鼠模型糖尿病并发抑郁症病理特征的测试药物。
糖尿病并发抑郁症小鼠模型的建立方法为：
一、实验动物
SPF级雄性C57BL小鼠，8周龄，体重质量18-25g
培养条件：温度22±2℃，湿度为55±5％，室内12h明暗切换。
二、实剂
1、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.5，浓度0.05mmol/L)：
甲溶液：2.1g柠檬酸溶解于100ml高压灭菌超纯水；
乙溶液：2.9g柠檬酸钠溶解于100ml高压灭菌超纯水；
将甲溶液和乙溶液按照57∶43混合，即得。
2、STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液需要提前灭菌并预冷到4℃；
称取适量STZ迅速溶解于预冷的柠檬酸缓冲液中，即用即配，STZ终浓度1％；
配制过程需在冰浴中避光完成，并在10min内注射完毕。
3、LPS(No.L-2880，Sigma–Aldrich)，溶于无菌，无热原的生理盐水中。
三、实验流程
1、取小鼠共20只适应性饲养7d后，随机分为4组，每组5只，三组分别为：A对照组、B糖尿病组、C抑郁症组、D糖尿病抑郁症组，所有小鼠可以自由食用鼠粮和饮水。
2、STZ药物注射：腹腔注射，STZ注射前小鼠禁食12h，不禁水。
A对照组：腹腔注射1次柠檬酸缓冲液(注射量按照STZ溶液用量150mg/kg计算)。
B抑郁症对照组：腹腔注射1次柠檬酸缓冲液(注射量按照STZ溶液用量150mg/kg计算)。
C糖尿病对照组：腹腔注射1次STZ溶液，用量150mg/kg。
D糖尿病抑郁症组：腹腔注射1次STZ溶液，用量150mg/kg。
3、血糖测定
空腹血糖的测定采用ACCU-
PerformaNano血糖仪及实纸条(RocheDiagnostics,USA)测定。
最后一次注射STZ后5d，隔夜禁食12h，不禁水，尾静脉取血，测定小鼠的空腹血糖值，血糖值>11.3mmol/L视为造模成功。
空腹血糖低于11.3mmol/L时给予STZ补充剂量(100mg/kg,i.p)。
4、LPS药物注射：腹腔注射
A对照组：0.9％生理盐水(注射量按照LPS溶液用量0.5mg/kg计算)
B抑郁症对照组：每天注射1次LPS溶液，用量为0.5mg/kg
C糖尿病对照组：0.9％生理盐水(注射量按照LPS溶液用量0.5mg/kg计算)
D糖尿病抑郁症组：每天注射1次LPS溶液，用量为0.5mg/kg
四组小鼠同时在白天固定时间进行腹腔注射，共注射7天。
四、评价方法
1、体重测量：实验过程中每天固定时间测量小鼠体重。
结果显示：实验过程中正常对照组小鼠的体重增加，而抑郁症组、糖尿病组、糖尿病抑郁症组小鼠的体重均下降，其中以糖尿病抑郁症组下降最明显。
(参见图1)
2、旷场实验：以50cm*50cm*40cm的正方形广场为单位，分为16个等距正方形，测量基本运动5分钟。在实验开始前30分钟将所有的小鼠放置在实验场地，以使其能够适应环境。
实验开始后，将单只小鼠置于广场中心，在5分钟内记录并测定其自主活动。在这段时间里，测量过线次数(至少有三只爪子)和直立次数。
每只动物实验完毕后，用75％酒精溶液清洗场地。通过统计每只小鼠在5分钟内完成的室间穿格次数、直立次数、运动距离等来评价总的运动活性。
结果显示：与正常对照组相比，抑郁症对照组、糖尿病对照组、糖尿病抑郁症组的直立次数、穿格总次数、外周穿格次数、运动总距离、中央运动距离、中央穿格次数均显著降低，而抑郁症对照组、糖尿病对照组相比，糖尿病抑郁症组的直立次数、穿格总次数、外周穿格次数、运动总距离显著降低。(参见图2-7)
3、高架十字迷宫实验：高架十字迷宫为无味的塑料材质，包括50cm*5cm的两个相对开臂(open arm)和两个50cm*5cm*20cm的相对闭臂(closed arm)，闭臂的上部是敞开的。迷宫中央有一5cm*5cm的开阔部，迷宫距离地面50cm高。迷宫上方安装录像监控器，记录小鼠在迷宫中的活动情况。实验时小鼠从饲养笼中取出，背向实验员，轻轻放在高架十字迷宫的中央区域，面向开臂，然后实验员迅速安静的离开。该实验以5分钟内小鼠进入开放臂次数、进入开放臂时间、进入开放臂距离、进入封闭臂次数、进入封闭臂时间、进入封闭臂距离等为主要检测指标。
结果显示：与正常对照组相比，抑郁症对照组、糖尿病对照组、糖尿病抑郁症组进入开放臂的次数显著降低，同时糖尿病对照组、糖尿病抑郁症组进入封闭臂的次数以及封闭臂的运动距离也显著降低。此外与正常对照组相比，只有糖尿病抑郁症组进入开放臂的时间、进入开放臂的距离显著降低，而进入封闭臂的时间显著增加。另外与抑郁症对照组和糖尿病对照组比较，糖尿病抑郁症组进入封闭臂的次数和进入封闭臂的距离明显降低。(参见图8-13)
4、悬尾实验：每只小鼠的实验空间在55cm*15cm*11.5cm左右，动物悬挂在隔间中间，宽度和深度足够大，不能与墙壁接触。悬挂后动物鼻尖与设备地板之前的距离在20-25cm左右。
悬挂用的胶带牢固地粘贴在小鼠尾部和悬挂杆上，并且足够坚固以承受正在测实的小鼠的重量。胶带应贴在尾部的尾端，尾部留2-3毫米的距离。分析时仅有前肢但没有后肢介入的小动作可判断为不动；因惯性产生的摆动可判断为不动；
实验进行6分钟记录后4分钟的不动时间，实验结束将动物放回鼠笼，轻轻将胶带从尾巴上取下，清洁用品，每次实验完成，收集粪便和尿液，彻底擦拭悬挂盒。
结果显示：与正常对照组相比，抑郁症对照组、糖尿病对照组、糖尿病抑郁症组的不动时间显著增加，另外与抑郁症对照组、糖尿病对照组相比，糖尿病抑郁症组的不动时间也是显著增加的。(参见图14)
5、强迫游泳实验：用一个有机玻璃圆筒(直径10cm，高度25cm)，圆筒中充满24±0.5℃的水，水深约15厘米。将小鼠分别放入有机玻璃圆筒中浸泡15分钟。15分钟后，将小鼠晾干，并放在笼子里。第一次浸泡24小时后，将小鼠放在游泳设备中6分钟，然后在昏暗的房间里用摄像机记录并测定后4分钟的不动时间。
结果显示：与正常对照组相比，抑郁症对照组、糖尿病对照组、糖尿病抑郁症组的不动时间显著增加，而与抑郁症对照组、糖尿病对照组比较，糖尿病抑郁症组的不动时间也是显著增加的。(参见图15)。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括：
对小鼠施用STZ溶液，于腹腔注射STZ溶液，注射STZ溶液5天后，隔夜禁食12h，不禁水，尾静脉取血测定小鼠的空腹血糖值；若血糖值>11.3mmol/L视为得所述小鼠模型；若血糖值<11.3mmol/L，则连续7天，每天腹腔注射LPS溶液，即得所述小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的STZ溶液注射量为一次用量150mg/kg，所述的LPS溶液注射量为0.5mg/kg。
3.根据权利要求1所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为8周龄SPF级雄性C57BL小鼠，体重质量18-25g。
4.根据权利要求1所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠模型的培养条件为温度22±2℃，湿度为55±5％，室内12h明暗切换。
5.根据权利要求1所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述STZ溶液包含柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂；所述LPS溶液包含无菌无热原的生理盐水和溶于无菌无热原的生理盐水中的LPS(No.L-2880，Sigma–Aldrich)。
6.根据权利要求5所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的制备方法包括如下步骤：
制备甲溶液：将2.1g柠檬酸溶解于100ml高压灭菌超纯水；
制备乙溶液：将2.9g柠檬酸钠溶解于100ml高压灭菌超纯水；
将甲溶液和乙溶液按照57：43的体积比混合后得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
7.根据权利要求6所述的一种糖尿病并发抑郁症的小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的STZ(No.S0130，Sigma–Aldrich)实剂的制备方法包括如下步骤：
将柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液提前灭菌并预冷到4℃；
称取适量STZ迅速溶解于预冷的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，即用即配，获得STZ的终浓度为1％；其中所述制备过程需在冰浴中避光完成，并在10min内注射完毕。
8.一种根据权利要求1-7任一所述的构建方法得到的糖尿病并发抑郁症的小鼠模型。
9.一种根据权利要求1-7任一所述的构建方法得到的小鼠模型在筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物中的应用以及在糖尿病并发抑郁症的病理生理研究或发病机制研究中的应用。
10.一种筛选或评价用于治疗和/或预防糖尿病并发抑郁症的体外药物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测试药物施用于权利要求1-7任一所述的构建方法构建得到的小鼠模型中；
(2)分析待测试药物的治疗效果并进行评价，选择能够明显改善小鼠模型糖尿病并发抑郁症病理特征的测试药物。
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