CN115961102A - 基于era技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法。本发明选取对虾传染性肌肉坏死病毒基因中MCP序列作为检测靶基因，针对靶基因设计合成ERA检测专用引物和探针，建立用于对虾传染性肌肉坏死病毒的ERA检测方法。本发明方法反应温度固定、操作程序简单、扩增速度快、检测效率高，且灵敏性和特异性良好，适用于IMNV的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法。
背景技术
传染性肌肉坏死病毒(IMNV)是影响南美白对虾的传染性最强的病害之一，被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health，OIE)列为甲壳动物主要疾病。传染性肌肉坏死病毒(IMNV)于2002年在巴西的一家凡纳滨对虾养殖场被首次发现。此后，于2006年在印度尼西亚报道，2017年印度也报告了该病毒。IMNV是全病毒科的成员，是由120个衣壳蛋白组成的正二十面体结构，无囊膜包被，直径约为40纳米。IMNV基因组是一个长度为7560bp的非分节的双链RNA，包含两个开放阅读框(ORF)，其中ORF1编码结构蛋白，即主要衣壳蛋白(MCP)和两种小蛋白(SP1和SP2)和假定的RNA结合蛋白。ORF2区域编码病毒特异性RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。根据RdRp基因同源性，该病毒被归类为节肢动物病毒Totivirus家族的贾第鞭毛虫病毒进化枝。患病对虾的主要症状是肌肉白浊、坏死，腹部末端及尾部明显，体表有不规则黑斑的症状。组织学检查显示骨骼肌严重凝固性坏死，可能伴有水肿、血细胞浸润和纤维化症状。在特定的环境因素下，IMNV相关死亡率可高达70％，该病毒对全球虾产业构成严重威胁，据估计已经造成数10亿美元的经济损失。
近年来，我国的对虾进口贸易日益增长，因此对虾疫病的实验室与实地检测量和需求增加。针对IMNV感染的诊断，基于临床体征和组织学检查，无法与其他病原体感染的体征区分开来，例如南美白对虾诺达病毒(PvNV)和细菌性病毒。基于核酸的方法包括原位杂交、反转录巢式PCR和反转录RT-PCR，是目前检测IMNV感染的高度特异和灵敏的方法，但需要精密的热循环仪器和较长的时间，不适合养殖者的虾场实地检测。等温扩增技术逐渐应用于病原检测中，如环介导等温扩增技术(LAMP)等，然而LAMP靶向序列为小片段内的6个或8个区域，引物设计受到许多限制，面临易被污染的高风险。酶促恒温扩增技术(ERA)是一种改良的重组酶聚合酶扩增技术(RPA)，将来源于细菌，病毒和噬菌体的特定重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行优化组合，从而获得核心的重组等温扩增体系。在37-42℃恒温条件下，可以使之将单分子DNA/RNA的特异性区段在5-10分钟内扩增109倍。因此，进一步开发快速、灵敏高的反转录实时定量酶促恒温扩增技术(RT-ERA)的IMNV检测方法，有利于更好地实现对本病的预防和控制。
发明内容
本发明提出一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒检测方法及应用，利用实时定量酶促重组扩增技术(RT-ERA)建立了IMNV检测体系，不仅可快速实地实时检测，而且具有较高的特异性和灵敏性。
本发明采用了如下技术方案：
一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)选取对虾传染性肌肉坏死病毒基因中MCP序列作为检测靶基因，设计RT-ERA引物和探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)设计的RT-ERA引物和探针，进行恒温RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，检测其荧光信号强度，根据扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果。
优选的，所述探针为：
CGACGCTGCTAACCATACAAAACCTTTTGC/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/TGAAGGAGGAAGACT/iSpC3/；其中，所述i6FAMdT为修饰6FAM荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸，idSp为四氢呋喃THF残基，iBHQ1dT为修饰了BHQ1荧光淬灭集团的胸腺嘧啶核苷酸，iSpC3为阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
优选的，恒温RT-ERA扩增的温度为37℃-42℃。
更优选的，恒温RT-ERA扩增的温度为41℃。
优选的，步骤(2)中，若在RT-ERA扩增的15min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明检测结果为阳性；若RT-ERA扩增产物不满足上述条件，则表明检测结果显示为阴性。
优选的，以扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值。
优选的，步骤(2)中，RT-ERA扩增步骤包括：取溶解剂20μL，上下游引物各2μL，探针0.6μL、模板2μL、ddH20 21.4μL，加入至含ERA反应试剂的RT-ERA反应管中，充分震荡混匀，最后在反应管盖上加入2μL的激活剂，离心混匀后将反应管置于荧光扩增检测仪器中，37℃-42℃下开始恒温RT-ERA扩增反应。
与现有技术相比，本发明的有益成果在于：
由于目前没有有效的治疗方法来预防或减少虾类养殖业中IMNV的传播，因此需要开发简便和快速的IMNV检测技术。本发明选取MCP序列作为检测靶基因，设计并筛选RT-ERA引物组和RT-ERA荧光型探针，构建了基于酶促恒温扩增技术(ERA)技术的对虾传染性肌肉坏死病病原的检测方法。RT-ERA非常适合现场条件、护理点和其他资源匮乏的环境。RT-ERA与PCR扩增一样具有特异性，与AHPND、WSSV、EHP、IHHNV等病原的核酸产生没有交叉反应，同时检出限大大降低，检出限为101copies/μL。本发明开发的检测方法能够在20分钟内完成扩增，其反应过程在样品与试剂接触后立即开始，无需熔化双链DNA靶标，因此不需要昂贵的热循环仪和昂贵的试剂。RT-ERA对工作温度非常宽容，在37–42℃左右的温度下进行最佳工作，该温度低于其他等温方法。此外，RT-ERA可以检测复杂样本中的DNA或cDNA，无需事先进行核酸纯化。在许多情况下，一个受过有限专业培训的人能够在半小时内取样、准备、运行检测并获得结果。这种人性化的方法的应用可以帮助控制IMNV疾病的传播，避免大规模的IMNV爆发，从而对虾产业的健康发展发挥重要作用。
附图说明
图1为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-ERA检测体系筛选引物结果图；其中，A-C为在105copies/μL标准质粒模板下25组引物进行ERA扩增的琼脂糖凝胶电泳图，(M:DNA 2000Marker，1-25分别表示F1R1～F1R5，F2R1～F2R5，F3R1～F3R5；F4R1～F4R5；F5R1～F5R5；D为在104copies/μL标准质粒模板下筛选出的7组引物进行ERA扩增的琼脂糖凝胶电泳图，1表示F1R1，2表示F1/R4，3表示F2/R2，4表示F4/R4，5表示F4/R5，6表示F5/R4；7表示F5/R5；
图2为本发明实施例筛选出的4组引物进行RT-ERA的扩增曲线图，实验在三个独立运行的重复中进行测试；
图3为本发明实施例使用不同引物组的扩增阈值时间柱状图；
图4为本发明实施例不同温度下的对虾传染性肌肉坏死病RT-ERA扩增曲线图；
图5为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-ERA扩增系统的特异性检测图；
图6为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病巢式PCR扩增电泳图(模板为标准质粒)，其中，A、B分别为巢式第一步反应程序和巢式第二步反应程序的扩增情况，泳道1-9样品浓度：108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL，泳道10：阴性对照；
图7为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-PCR扩增曲线图(模板为10倍梯度稀释的标准质粒)；
图8为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-PCR测定的阈值时间分析图(模板为10倍梯度稀释的标准质粒)；
图9为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-ERA扩增曲线图(模板为10倍梯度稀释的标准质粒)；
图10为本发明实施例对虾传染性肌肉坏死病RT-ERA测定的阈值时间分析图(模板为10倍梯度稀释的标准质粒)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的说明。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的ERA荧光型核酸扩增试剂盒是苏州先达基因科技有限公司的产品，产品货号为KS103。
实施例1-对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测引物和探针的设计及合成
在NCBI网页Genbank数据库下载对虾传染性肌肉坏死病致病质粒的全基因序列(AY570982)，进行序列比对分析，选取种内保守、种间特异的MCP序列作为检测靶基因，设计对虾传染性肌肉坏死的RT-ERA检测引物和探针，见表1。
表1RT-ERA引物及探针
将上述前引物和后引物排列组合进行ERA扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，筛选出较优引物；随后，将筛选出的四对引物再与设计的探针进行RT-ERA扩增，根据是否有明显的指数期与平台期、达到阈值的时间快慢和荧光值大小筛选出最优引物对与探针。
结果如图1，其中如图1(A-C)所示，在105copies/μL标准质粒模板下25组引物进行ERA扩增的琼脂糖凝胶电泳图中可以看出，在105copies/μL标准质粒模板下F1/R1，F1/R4，F2/R2，F4/R4，F4/R5，F5/R4和F5/R5扩增效果较好；
如图1(D)所示，在104copies/μL标准质粒模板下筛选出的7组引物进行ERA扩增的琼脂糖凝胶电泳图中可以看出，以上6对引物在104copies/μL标准质粒模板下，F1/R1，F4/R4，F4/R5和F5/R4扩增效果较好。
如图2所示的筛选出的4组引物进行RT-ERA的扩增曲线结果和图3所示的使用不同引物组的扩增阈值时间柱状图中可以看出，将以上筛选的4对引物与探针配合进行RT-ERA扩增，F1/R1引物组有明显的指数期与平台期，达到阈值时间最短，荧光值最高，筛选其为最优引物对，实验在三个独立运行的重复中进行测试。
筛选出最优引物对与探针如下：
F1:TACCAACAGGATCATATATTAAGCAGAGAG(序列SEQ ID NO:1)
R1:TGCCGGTTTTGAAAGCCTTTGTTTCCTCTG(序列SEQ ID NO:2)
根据上述探针设计要求，设计的RT-ERA探针如下：
CGACGCTGCTAACCATACAAAACCTTTTGC/i6FAMdT/(序列SEQ ID NO:3)
/idSp//iBHQ1dT/TGAAGGAGGAAGACT(序列SEQ ID NO:4)/iSpC3/
上述探针中，序列SEQ ID NO:3自5’端起最后一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰6FAM荧光报告基团胸腺嘧啶核苷酸(6FAMdT)，序列SEQ ID NO:3自5’端起第一位胸腺嘧啶核苷酸为修饰了BHQ1荧光淬灭集团的胸腺嘧啶核苷酸(BHQ1dT)；dSpacer(THF四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点；SpC3：序列SEQ ID NO:4的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端外切酶和聚合酶发挥作用。
上述引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例2对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测方法
以待测样品的基因组DNA为模板，采用上述设计的RT-ERA引物组和RT-ERA探针进行RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，并检测荧光信号强度，具体步骤如下：
每个RT-ERA反应管的体系如下：溶解剂20μL，上下游引物各2μL(10μM)，ERA探针0.6μL(10μM)、模板2μL、ddH20 21.4μL。将以上反应物加入含ERA反应试剂的RT-ERA反应管中，充分震荡混匀，最后在每个反应管盖上加入2μL的激活剂乙酸镁(280nM)，离心混匀后迅速将反应管置于便携式荧光扩增检测仪器中，37℃-42℃下开始恒温RT-ERA扩增反应，得到RT-ERA扩增产物，并检测荧光信号。
使用荧光扩增检测仪自带的软件，对扩增结果进行分析，以扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值；
判断扩增结果：若RT-ERA扩增产物满足如下条件：若在RT-ERA扩增的15min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即，待测样品感染IMNV；若RT-ERA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果为阴性，即待测样品未感染IMNV。
实施例3-对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA反应温度的优化
为确定RT-ERA扩增反应的最适温度，本发明还进行了RT-ERA反应温度的优化实验：
将105copies/μL标准质粒作为模板，并采用上述实施例1中的IMNV的最优引物探针与RT-ERA检测方法，分别在38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，共计5个不同温度条件下进行恒温RT-ERA，实验在三个独立运行的重复中进行测试。
结果如图4所示，结果表明：RT-ERA反应体系在38-42℃的不同温度条件下均正常扩增，在相同浓度的模板下标准质粒在41℃时的达到阈值时间最短，荧光值最高，因此，以41℃为RT-ERA反应体系的最佳温度。
实施例3-对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA引物和探针的特异性实验
分别以如下四种对虾病毒：急性肝胰腺坏死病(AHPND)、白斑综合征病毒(WSSV)、肝肠胞虫(EHP)和传染性皮下炎和造血坏死病毒(IHHNV)的病毒核酸DNA或RNA以及SPF对虾核酸为模板，采用实施例1中的对虾传染性肌肉坏死病IMNV的最优引物探针与RT-ERA检测方法，检测本发明的RT-ERA引物组和RT-ERA探针的特异性。
结果如图5所示，结果表明：本发明设计的RT-ERA引物和探针均可特异性的扩增出靶基因，而与其它四种病毒(急性肝胰腺坏死病(AHPND)、白斑综合征病毒(WSSV)、肝肠胞虫(EHP)和传染性皮下炎和造血坏死病毒(IHHNV))核酸以及SPF对虾核酸均无交叉反应，说明本发明的对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA引物与探针具有良好的特异性。
实施例4-对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测的灵敏性实验
将本发明的对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测方法和巢式PCR、RT-PCR检测的灵敏度比较：
使用108copies/μL-100copies/μL的标准质粒和ddH2O(阴性对照)为模板，采用实施例1中的对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测方法，以及利用巢式PCR、RT-PCR对以10倍梯度稀释的对虾传染性肌肉坏死病的标准质粒进行扩增，引物和探针如表2所示，反应体系如表3-8所示。
表2巢式PCR与RT-PCR引物表
表3巢式PCR第一步反应组分
表4巢式PCR第一步反应程序
表5巢式PCR第二步反应组分
表6巢式PCR第二步反应程序
表7 RT-PCR反应组分
表8 RT-PCR反应程序
当模板为108copies/μL-100copies/μL的标准质粒时，三种方法的扩增结果如图6-10所示，其中，图6为巢式PCR扩增结果(A、B分别为巢式第一步反应程序和巢式第二步反应程序的扩增情况)，泳道1-9样品浓度：108copies/μL、107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/、100copies/μL，泳道10：阴性对照；图7为RT-PCR扩增曲线；图8为RT-PCR测定的阈值时间分析；图9为RT-ERA扩增曲线；图10为RT-ERA测定的阈值时间分析，基于3个数据集的平均值生成标准回归线，R2：确定系数；
由图6-10结果分析得到，IMNV RT-ERA的灵敏度为101copies/μL，稳定性良好，此时与巢式PCR灵敏性相当，与RT-PCR相比高出10倍。
本发明将筛选出的F5/R4的引物组与探针用于对虾传染性肌肉坏死病的RT-ERA检测，进行灵敏性实验时，实验结果显示RT-ERA的灵敏度为102copies/μL，其灵敏度明显低于采用F1/R1引物组与探针的配合时的RT-ERA检测。
综上实验结果表明，本发明提供了一种RT-ERA方法来扩增IMNV的MCP致病基因，从而可高效准确判断待测样品是否感染IMNV。该方法可在41℃下，20分钟内高效准确检测IMNV，同时，IMNV的RT-ERA检测体系不会与AHPND、WSSV、EHP和IHHNV病原以及SPF对虾核酸发生交叉反应。RT-ERA的检测限为101copies/μL。由于反应温度固定、操作程序简单、扩增速度快、检测效率高，RT-ERA可作为快速检测IMNV的诊断工具。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取对虾传染性肌肉坏死病毒基因中MCP序列作为检测靶基因，设计RT-ERA引物和探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；
(2)以待测样品的基因组DNA为模板，采用步骤(1)设计的RT-ERA引物和探针，进行恒温RT-ERA扩增，得到RT-ERA扩增产物，检测其荧光信号强度，根据扩增曲线的荧光信号值，判断扩增结果。
2.根据权利要求1所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，所述探针为：
CGACGCTGCTAACCATACAAAACCTTTTGC/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/TGAAGGAGG AAGACT/iSpC3/；其中，所述i6FAMdT为修饰6FAM荧光报告基团的胸腺嘧啶核苷酸，idSp为四氢呋喃THF残基，iBHQ1dT为修饰了BHQ1荧光淬灭集团的胸腺嘧啶核苷酸，iSpC3为用于阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团。
3.根据权利要求1所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，恒温RT-ERA扩增的温度为37℃-42℃。
4.根据权利要求1所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，恒温RT-ERA扩增的温度为41℃。
5.根据权利要求1所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，若在RT-ERA扩增的15min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明检测结果为阳性；若RT-ERA扩增产物不满足上述条件，则表明检测结果显示为阴性。
6.根据权利要求6所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，以扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差作为检测阈值。
7.根据权利要求1所述基于ERA技术的对虾传染性肌肉坏死病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，RT-ERA扩增步骤包括：取溶解剂20μL，上下游引物各2μL，探针0.6μL、模板2μL、ddH20 21.4μL，加入至含ERA反应试剂的RT-ERA反应管中，充分震荡混匀，最后在反应管盖上加入2μL的激活剂，离心混匀后将反应管置于荧光扩增检测仪器中，37℃-42℃下开始恒温RT-ERA扩增反应。
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