CN115960836A - 一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用，属于生物医用材料与细胞分子治疗技术领域。本发明通过多轮筛选得到一段与丝素蛋白具有较强亲和性的丝素亲和肽，将丝素亲和肽在外泌体膜蛋白中融合表达有利于增强外泌体与亲和蛋白的结合性能，同时外泌体的膜蛋白通过融合表达MS2结构域，可高效捕捉大量特异性miRNA，从而发挥特定的功能作用。丝素蛋白结合丝素亲和性工程化外泌体后，提高了外泌体的稳定性及其在受体细胞中的内化效应，为生物分子活性材料在组织修复与再生医学领域的应用提供了研究基础，同时为临床中组织损伤修复的高效精准治疗提供了理论和技术支撑。

Description

一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用

技术领域

本发明属于生物医用材料与细胞分子治疗技术领域，具体涉及一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和功能应用。

背景技术

随着细胞分子治疗技术的快速发展，外泌体治疗成为生物医疗领域研究的热点，并受到广泛的关注。外泌体是细胞外分泌囊泡中的一员，它可以作为运输载体，装载细胞内特定的蛋白和RNA等成分，通过融合到靶细胞膜或者靶细胞胞吞作用摄入，将活性因子直接递送到靶细胞内部，对受体细胞组织发挥有效调控作用。相比于干细胞治疗，干细胞来源的外泌体，不仅含有干细胞分泌的多种有效成分，而且可以避免异种来源细胞表面抗原带来的一过性排异反应，在临床治疗应用上更加安全。目前，以工程化修饰的外泌体为载体装载特定基因和活性药物等有效成分从而获得具备特异调控作用的功能性外泌体，成为外泌体治疗的应用热点与发展方向。然而，功能性外泌体需要有效的缓释保存模式来发挥持续性调控作用。

在临床治疗过程中，给药方式与治疗效果直接相关，如果药物无法有效地持续作用机体，那么治疗效果往往大打折扣。外泌体的半衰期很短，活性保持困难，而生物材料作为活性分子载体，可为外泌体治疗模式开启无限可能。功能性外泌体与生物材料相结合用于靶向调控分子的持续输送，有望为各类创伤修复的精准治疗带来新的希望。外泌体结合生物活性材料已经开始应用于皮肤、心血管以及骨与软骨等组织的损伤修复治疗。在组织修复与再生生物材料中，丝素蛋白作为天然的蛋白成分具有抗菌性，可防止病原体的侵袭和增殖，从而降低感染的风险，加之良好的生物相容性、可降解性及优良的机械性能，使其成为组织修复与再生应用中新的生物材料研究方向。值得注意的是，丝素蛋白材料对外泌体的加载能力可能与外泌体在生物材料上的结合效率密切相关。如何增强外泌体与丝素蛋白的高效结合与持续释放是构建丝素亲和性工程化外泌体的关键技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法，使构建的丝素亲和性工程化外泌体在丝素蛋白中具有高效结合和持续释放特性。

本发明的目的还在于提供一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，具有持续内化作用，具有良好的保存稳定性和体内稳定性，从而能有效提高外泌体活性成分的疗效。

本发明提供了一种丝素亲和性工程化外泌体，所述外泌体的膜蛋白为融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白Lactadherin；

所述丝素蛋白结合肽插入膜蛋白Lactadherin中SP和C1C2结构域之间；

所述丝素蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的，所述外泌体装载miR146a；所述外泌体的膜蛋白还为融合表达MS2结构域；

所述MS2结构域在膜蛋白Lactadherin中C1C2结构域的C端表达；

所述MS2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种所述丝素亲和性工程化外泌体的构建方法，包括以下步骤：

1)构建含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒；

2)将步骤1)中所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒；

3)将步骤2)中所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。

优选的，步骤1)中所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

优选的，步骤2)中所述转染的方法为将制剂1和制剂2混合，加至无血清培养基孵育的细胞中，4～6h后更换为有血清培养基，继续培养48～72h；

所述制剂1为含Lipo2000的Opti-MEM培养基；所述Opti-MEM和Lipo2000的体积比为250:10；

所述制剂2为含miR146a质粒和MS2质粒的Opti-MEM培养基；所述Opti-MEM、miR146a质粒和MS2质粒的质量比为250:2:2。

优选的，融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

当外泌体装载miR146a时，所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞。

本发明提供了一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，为所述丝素亲和性工程化外泌体或所述构建方法得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体；

所述丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白的质量比约为1:10。

本发明提供了所述丝素亲和性工程化外泌体或所述结合丝素蛋白的功能性外泌体在组织修复与再生中的应用。

优选的，所述组织修复与再生包括以下一种或几种组织损伤修复：皮肤组织损伤修复与再生、心血管组织修复与再生、骨组织修复与再生和软骨组织修复与再生。

本发明提供了一种丝素亲和性工程化外泌体(SGM-Exo)，本发明通过多次筛选得到一段与丝素蛋白具有较强亲和性的丝素亲和肽，根据丝素亲和肽设计得到丝素蛋白结合肽，将丝素蛋白结合肽在外泌体膜蛋白中融合表达，从而增强外泌体与丝素蛋白的结合效率和持续释放，为制备以外泌体作为活性分子载体的功能性药物提供了研究基础。

进一步，本发明外泌体的膜蛋白的C端还融合表达MS2结构域，MS2结构域可通过miR146a两端的pac位点高效捕捉大量miR146a，miR146a作为药物活性成分，发挥抑制炎症反应的作用。

本发明提供了一种结合丝素蛋白的功能性外泌体(SGM-Exo@SFP)，为所述丝素亲和性工程化外泌体或所述构建方法得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体。本发明实验将结合功能性外泌体的丝素蛋白贴片浸提液作用于HaCat细胞，结果表明功能性外泌体可以持续内化作用于受体细胞。同时从体外保存、体内应用以及miRNA三方面评估了SGM-Exo@SFP的稳定性，结果表明无论在室温还是低温保存，SGM-Exo@SFP的存储稳定性都得到显现提升；体内应用实验表明，丝素亲和性工程化外泌体结合丝素蛋白后的持续释放和活力稳定性得到提升；同时丝素亲和性工程化外泌体中所含的基础miR146a表达量更加稳定，从而提高了功能性外泌体的应用效果。

附图说明

图1为丝素蛋白亲和性工程化外泌体构建示意图；

图2为丝素蛋白亲和性外泌体与丝素蛋白的结合率内化和稳定性结果；

图3为丝素亲和性工程化外泌体从SFP释放后内化至HaCaT细胞的结果；

图4为本发明制备的SGM-Exo@SFP的稳定性评估结果，A为SFP增强了SGM-Exos在37℃下的稳定性；B为SFP增强了SGM-Exos在4℃下的稳定性；C为与单纯的SGM-Exo组相比，SFP加载的SGM-Exo在体内的保留时间更长。信号活度以光子/s/cm2/steradian(sr)表示；数据代表6个不同实验的均值±标准差(**p<0.01，***p<0.001)；

图5为SGM-Exo@SFP中miR146a表达量的变化。

具体实施方式

本发明提供了一种丝素亲和性工程化外泌体，所述外泌体的膜蛋白为融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白Lactadherin；所述丝素亲和肽插入膜蛋白Lactadherin的SP和C1C2结构域之间，所述丝素蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(LSLSPGHFSFVDLSLSPGHFSFVDLSLSPGHFSFVD)所示。

在本发明中，所述丝素蛋白结合肽是在丝素亲和肽的基础上经过三次重复串联方式得到。所述丝素亲和肽优选通过12肽库噬菌体的筛选和ELISA的验证获得。所述丝素亲和肽的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:11。所述丝素亲和肽较其他筛选得到的丝素亲和肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示)具有显著的与丝素蛋白结合活性。所述融合表达有丝素亲和肽的膜蛋白的氨基酸序列优选如SEQ ID NO:3(PRPRLLAALCGALLCAPSLLVALSLSPGHFSFVDLSLS PGHFSFVDLSLSPGHFSFVDTKCVEPLGLENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWVPELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKLAYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTLRFELLGCELNGCANPLGLKNNSIPDKQITASSSYKTWGLHLFSWNPSYARLDKQGNFNAWVAGSYGNDQWLQVDLGSSKEVTGIITQGAPNFGSVQFVASYKVAYSNDSANWTEYQDPRTGSSKIFPGNWDNHSHKKNLFETPILARYVRILPVAWHNRIALRLELLGC)所示。

在本发明中，所述外泌体包含miR146a。所述外泌体的膜蛋白还融合表达MS2结构域。所述MS2结构域在膜蛋白Lactadherin的C1C2结构域的C端表达。所述MS2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2(ASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGVAEWISSNSRSQAYKVTCSV RQSSAQKRKYTIKVEVPKVATQTVGGVELPVAAWRSYLNMELTIPIFATNS DCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIY)所示。噬菌体MS2衣壳蛋白与膜蛋白融合表达使其在工程化外泌体膜表面表达，由于特定的miRNA(miR146a)的上下游有两个pac位点，MS2结构域可通过识别pac位点，高效连接捕捉miR146a，从而使表达的外泌体包裹大量miR146a，使工程化外泌体具有特异的抗炎调控功能。

在本发明中，为了检测后续构建的工程化外泌体的表达和细胞内化情况，在融合表达膜蛋白时，优选还融合表达报告基因。在本发明实施例中，所述报告基因优选为Gaussia luciferase(Gluc)荧光素酶。

本发明提供了一种所述丝素亲和性工程化外泌体的构建方法，包括以下步骤：

1)构建含融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒；

2)将步骤1)中所述含融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒；

3)将步骤2)中所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。

本发明构建含融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒。

在本发明中，所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4(ATGCCGCGCCCCCGCCTGCTGGCCGCGC TGTGCGGCGCGCTGCTCTGCGCCCCCAGCCTCCTCGTCGCCCTGAGCCTGAGCCCTGGCCACTTCAGCTTTGTGGACCTGTCTCTGAGCCCCGGACACTTTTCCTTCGTGGACCTGAGCCTGAGCCCAGGCCACTTTTCCTTCGT GGACACGAAATGTGTCGAGCCACTGGGCCTGGAGAATGGGAACATTGCCAACTCACAGATCGCCGCCTCGTCTGTGCGTGTGACCTTCTTGGGTTTGCAGCATTGGGTCCCGGAGCTGGCCCGCCTGAACCGCGCAGGCATGGTCAATGCCTGGACACCCAGCAGCAATGACGATAACCCCTGGATCCAGGTGAACCTGCTGCGGAGGATGTGGGTAACAGGTGTGGTGACGCAGGGTGCCAGCCGCTTGGCCAGTCATGAGTACCTGAAGGCCTTCAAGCTGGCCTACAGCCTTAATGGACACGAATTCGATTTCATCCATGATGTTAATAAAAAACACAAGGAGTTTGTGGGTAACTGGAACAAAAACGCGGTGCATGTCAACCTGTTTGAGACCCCTGTGGAGGCTCAGTACGTGAGATTGTACCCCACGAGCTGCCACACGGCCTGCACTCTGCGCTTTGAGCTACTGGGCTGTGAGCTGAACGGATGCGCCAATCCCCTGGGCCTGAAGAATAACAGCATCCCTGACAAGCAGATCACGGCCTCCAGCAGCTACAAGACCTGGGGCTTGCATCTCTTCAGCTGGAACCCCTCCTATGCACGGCTGGACAAGCAGGGCAACTTCAACGCCTGGGTTGCGGGGAGCTACGGTAACGATCAGTGGCTGCAGGTGGACCTGGGCTCCTCGAAGGAGGTGACAGGCATCATCACCCAGGGGGCCCCTAACTTTGGCTCTGTCCAGTTTGTGGCATCCTACAAGGTTGCCTACAGTAATGACAGTGCGAACTGGACTGAGTACCAGGACCCCAGGACTGGCAGCAGTAAGATCTTCCCTGGCAACTGGGACAACCACTCCCACAAGAAGAACTTGTTTGAGACGCCCATCCTGGCTCGCTATGTGCGCATCCTGCCTGTAGCCTGGCACAACCGCATCGCCCTGCGCCTGGAGCTGCTGGGCTGTTAG⁾所示。其中丝素蛋白结合肽的编码序列为CTGAGCCTGA GCCCTGGCCACTTCAGCTTTGTGGACCTGTCTCTGAGCCCCGGACACT TTTCCTTCGTGGACCTGAGCCTGAGCCCAGGCCACTTTTCCTTCGTGG AC(SEQ ID NO:18)。

在本发明中，当外泌体膜蛋白还融合表达MS2时，优选构建含融合表达有丝素蛋白结合肽(SFBP)和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒。融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5(ATGCCGCGCCCCCGCCTGCTGGCCGCGC TGTGCGGCGCGCTGCTCTGCGCCCCCAGCCTCCTCGTCGCCCTGAGCCTGAGCCCTGGCCACTTCAGCTTTGTGGACCTGTCTCTGAGCCCCGGACACTTTTCCTTCGTGGACCTGAGCCTGAGCCCAGGCCACTTTTCCTTCGTGGACACGAAATGTGTCGAGCCACTGGGCCTGGAGAATGGGAACATTGCCAACTCACAGATCGCCGCCTCGTCTGTGCGTGTGACCTTCTTGGGTTTGCAGCATTGGGTCCCGGAGCTGGCCCGCCTGAACCGCGCAGGCATGGTCAATGCCTGGACACCCAGCAGCAATGACGATAACCCCTGGATCCAGGTGAACCTGCTGCGGAGGATGTGGGTAACAGGTGTGGTGACGCAGGGTGCCAGCCGCTTGGCCAGTCATGAGTACCTGAAGGCCTTCAAGCTGGCCTACAGCCTTAATGGACACGAATTCGATTTCATCCATGATGTTAATAAAAA ACACAAGGAGTTTGTGGGTAACTGGAACAAAAACGCGGTGCATGTCAACCTGTTTGAGACCCCTGTGGAGGCTCAGTACGTGAGATTGTACCCCACGAGCTGCCACACGGCCTGCACTCTGCGCTTTGAGCTACTGGGCTGTGAGCTGAACGGATGCGCCAATCCCCTGGGCCTGAAGAATAACAGCATCCCTGACAAGCAGATCACGGCCTCCAGCAGCTACAAGACCTGGGGCTTGCATCTCTTCAGCTGGAACCCCTCCTATGCACGGCTGGACAAGCAGGGCAACTTCAACGCCTGGGTTGCGGGGAGCTACGGTAACGATCAGTGGCTGCAGGTGGACCTGGGCTCCTCGAAGGAGGTGACAGGCATCATCACCCAGGGGGCCCCTAACTTTGGCTCTGTCCAGTTTGTGGCATCCTACAAGGTTGCCTACAGTAATGACAGTGCGAACTGGACTGAGTACCAGGACCCCAGGACTGGCAGCAGTAAGATCTTCCCTGGCAACTGGGACAACCACTCCCACAAGAAGAACTTGTTTGAGACGCCCATCCTGGCTCGCTATGTGCGCATCCTGCCTGTAGCCTGGCACAACCGCATCGCCCTGCGCCTGGAGCTGCTGGGCTGTGCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCGACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGATCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTCGTCAGAGCTCTGCGCAGAAACGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTGCCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCCGCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTACGAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAAAGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTACTAG)所示。MS2结构域的编码序列为

GCTTCTAACTTTACTCAGTTCGTTCTCGTCGACAATGGCGGAACTGGCG

ACGTGACTGTCGCCCCAAGCAACTTCGCTAACGGGGTCGCTGAATGGA

TCAGCTCTAACTCGCGTTCACAGGCTTACAAAGTAACCTGTAGCGTTC

GTCAGAGCTCTGCGCAGAAACGCAAATACACCATCAAAGTCGAGGTG

CCTAAAGTGGCAACCCAGACTGTTGGTGGTGTAGAGCTTCCTGTAGCC

GCATGGCGTTCGTACTTAAATATGGAACTAACCATTCCAATTTTCGCTAC

GAATTCCGACTGCGAGCTTATTGTTAAGGCAATGCAAGGTCTCCTAAA

AGATGGAAACCCGATTCCCTCAGCAATCGCAGCAAACTCCGGCATCTAC(SEQ ID NO:19)。

在本发明中，所述含融合表达有丝素蛋白结合肽(SFBP)和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒的构建方法，优选包括以下步骤：根据目的SFBP和MS2编码序列，构建含有外源基因的重组载体；测序验证正确的重组质粒，进一步提取和纯化高质量的不含内毒素的SFBP和MS2重组质粒。得到含融合表达有丝素亲和肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒后，本发明将所述含融合表达有丝素亲和肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒。

得到融合表达有丝素亲和肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒后，本发明将所述含融合表达有丝素亲和肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒。

本发明对所述转染的细胞和转染方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞和常规的慢病毒转染方法即可。在本发明实施例中，所述细胞为293T细胞。

在本发明中，当外泌体装载大量miR146a时，优选构建含miR146a前体序列的慢病毒质粒。所述含miR146a前体序列的慢病毒质粒的构建方法，优选为根据目的基因序列(pre-miRNA146a序列)，构建含有pre-miRNA146a的重组载体；测序验证正确的重组质粒，进一步提取和纯化高质量的不含内毒素的pre-miR146a重组质粒。

本发明优选将所述含融合表达有丝素亲和肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒。

本发明对所述转染的细胞和转染方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的细胞和常规的慢病毒转染方法即可。在本发明实施例中，所述细胞为293T细胞。

得到包装的慢病毒颗粒后，本发明将所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。

在本发明中，所述细胞优选为人胎盘源间充质干细胞(PMSCs)。感染后，筛选感染后的人胎盘源间充质干细胞。所述筛选PMSCs的方法优选为慢病毒颗粒感染6h后，更换新鲜培养基，48h后加入更换含有最有浓度puromycin的培养基。所述PMSCs购自北京汉氏联合生物技术股份有限公司。

在本发明中，所述筛选用培养基优选为含有1μg/mL puromycin(购自Sigma,MO,USA)的培养基维持筛选14天，中间每隔一天更换一次抗性培养基。以存活的细胞为阳性细胞用于后续培养。所述阳性细胞进行培养的条件优选：将筛选的工程化PMSCs阳性细胞消化后传至新的培养皿，以含有1μg/mL puromycin的培养基继续培养，在37℃，5％CO₂下培养并传代。

在本发明中，所述收集上清液的方法优选为离心。所述离心的转速优选为1000rpm。所述离心的时间优选为5min。所述分离丝素亲和性工程化外泌体的方法优选为利用超高速离心机在10万rpm转速下，离心3次，每次30min，最终用少量PBS混匀，得到丝素亲和性工程化外泌体溶液。

在本发明中，验证制备的丝素亲和性工程化外泌体与丝素蛋白的结合与释放性能，结果表明，本发明制备的丝素亲和性工程化外泌体与SFP的结合率是对照组(G-Exos)的3倍，可见，SFBP提高了SGM-Exos与SFP的结合速率和效率。

本发明提供了一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，为所述丝素亲和性工程化外泌体或所述构建方法得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体。

在本发明中，所述结合丝素蛋白的功能性外泌体的构建方法，优选将含有100μg外泌体的100μL外泌体溶液，加载到直径10mm的丝素蛋白贴片上，形成结合丝素蛋白的功能性外泌体。

本发明提供了所述结合丝素蛋白的功能性外泌体在制备组织修复与再生的药物中的应用。

在本发明中，所述组织修复与再生优选包括以下一种或几种组织损伤修复：皮肤损伤修复与再生、心血管修复与再生、骨组织修复与再生和软骨组织修复与再生。

下面结合实施例对本发明提供的一种丝素亲和性工程化外泌体及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种与丝素蛋白高亲和性的丝素亲和肽的筛选方法与验证方法

1生物淘选

(1)将10mg/mL丝素蛋白溶液作为抗原(Ag)，加入到平板中，置于在60℃无菌环境下风干成膜。

(2)在板中加入1×10¹¹PDU的12肽库噬菌体(NEB商业化肽库：Ph.D.-12TM PhageDisplay Peptide Library Kit)，37℃孵育1.5h。

(3)0.05％PBST冲洗4次，PBS冲洗2次，洗掉未结合的噬菌体。

(4)用甘氨酸-盐酸(Glycine-HCl)(pH至2.2)洗脱结合抗原的噬菌体，然后用三氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH值9.2)中和直至pH 7.0。

2检测洗脱噬菌体的滴度

(1)培养大肠杆菌TG1直到log期。

(2)稀释洗脱下来的噬菌体，将10μL稀释液与大肠杆菌TG1180μL混合。

(3)37℃培养15分钟，然后倒入2个YT-IPTG/Xgal平板中，将平板倒置在37℃过夜。

3扩增洗脱的噬菌体

(1)添加100μL大肠杆菌。大肠杆菌TG1至40mL 2YT，37℃摇至OD₆₀₀＝0.6。

(2)加入洗脱产物，37℃摇匀5h。

(3)离心上清，转移至无菌管。上清加入1/5(v/v)PEG/NaCl。混合后，将混合物放在冰上2小时。

(4)用1ml PBS悬浮液离心沉淀，离心后将上清转移到无菌管中，得到的是扩增的噬菌体，用于下一次生物筛选。按步骤2所示进行滴度检测。

表1每轮的筛选条件

表2生物淘选结果

经过3轮生物淘选后，利用噬菌体上清进行噬菌体多克隆ELISA检测。

4多克隆噬菌体ELISA

用2mg/mL抗原包被板，60℃孵育成膜。

稀释后的抗M13-HRP抗体(1:5000，购自abcam公司)每孔加入100μL，37℃孵育1小时。

室温下，每孔加100μL TMB，然后每孔加100μL 2M HCl溶液。利用酶标仪在450nm设置上读取孔板数值。

表3多克隆噬菌体ELISA结果

根据结果，第二轮具有淘选轮数较少，富集度较低，淘选轮数太多，富集度高但噬菌体多样性降低的特点。选择第二轮输出噬菌体进行单克隆筛选。

5单克隆噬菌体ELISA

(1)从第二轮洗脱噬菌体稀释铺板的平板中选择96个克隆体，在37℃，220rpm摇动培养6小时。

(2)离心后取上清液用于ELISA检测。

表4抗原组R2P1输出噬菌体的ELISA检测结果

表5ELISA背景值检测

表6单克隆噬菌体(第二轮洗脱噬菌体)ELISA检测结果(去背景值后)

选择去背景值后ELISA值大于0.3的克隆进行测序，并进行噬菌体ELISA二次验证。测序后，得到了8条不同的正确序列，并对这些克隆进行了重新扩增和二次验证。

6阳性噬菌体克隆二次验证。

10mg/mL抗原包被板(试验组)置于60℃孵育成膜。

然后用ELISA法再次检测阳性克隆。

7对优选的噬菌体克隆进行序列分析。

表7阳性克隆ELISA二次验证结果

表8ELISA背景值检测

表9阳性噬菌体ELISA二次验证结果(去背景值后)

6个阳性克隆的氨基酸序列与核苷酸序列如下表10所示。

表106个阳性克隆的序列信息

根据抗原结合情况，在6个阳性克隆中，20000063F-R2P1-G8去掉背景值后第二次验证仍然显示了阳性结果(即正值)。选择20000063F-R2P1-G8作为优选的丝素亲和肽段。

实施例2

一种具有丝素亲和性的工程化外泌体构建方法，包括如下步骤：

一、利用筛选的丝素亲和肽段(LSLSPGHFSFVD)设计合成丝素蛋白结合肽(silkfibroinbinding peptide,SFBP)融合蛋白，从而构建一种丝素蛋白亲和性外泌体。

表11丝素蛋白结合肽(SFBP)序列

将SFBP插入外泌体膜蛋白Lactadherin的SP和C1C2结构域之间，并在SFBP之后融合生物发光报告系统Gaussia luciferase(Gluc)荧光素酶(SEQ ID NO:20，KPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEL EANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGE AIVDIPEIPGFKDLEPLEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGDAS，编码序列为SEQ ID NO:21，AAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGCTGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCCTGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACGCTAGC)，以实时监测外泌体。将MS2结构域(SEQ ID NO:2，编码序列为SEQ ID NO:19)融合到外泌体膜蛋白Lactadherin的C端，特定miRNA(miR146a)的上下游有两个pac位点，MS2可通过pac高效连接捕捉miR146a，从而赋予外泌体特异的抗炎调控功能(见图1)。

将重组的SFBP-Gluc-MS2慢病毒质粒(SGM-pLv)和pac-pre-miR146a-pac慢病毒质粒(miR146a-pLv)转染到293T细胞中，包装后收取SGM-miR146a-Lv慢病毒颗粒。用SGM-miR46a-Lv感染PMSCs，然后用含有1μg/mLpuromycin的培养基(Sigma,MO,USA)筛选转导后的阳性细胞(SGM-miR146a-PMSCs)。通过培养SGM-miR146a-PMSCs并收集上清液，提取丝素亲和性工程化外泌体(SGM-miR146a-Exo)(图1)。

对比例1

将Gluc融合蛋白转入PMSC细胞，收集细胞上清液，并提取上清液中的外泌体，得到G-Exos。

实施例3

丝素亲和性工程化外泌体(SGM-Exo)在丝素蛋白中的结合效率。

外泌体的蛋白活性通过Gaussia荧光素酶(Gluc)活性来监测。

将不同SGM-Exo含量(1～32μg)的溶液加入到直径为10mm的丝素蛋白贴片中，在48孔板中，37℃下相互作用10分钟。洗除未结合的外泌体。再置入37℃培养箱中孵育不同时间后，将丝素材料结合的外泌体释放出来收集上清PBS，待外泌体充分释放于PBS溶液中，移至另48孔板上，通过Gluc信号进行BLI检测分析，比较了SGM-Exos和G-Exos与丝素蛋白贴片(SFP)的结合率。结果表明，随着外泌体浓度的增加，SGM-Exos与SFP的结合率增加，G-Exos与SFP的结合率也增加。在相同的外泌体浓度下，SGM-Exos与SFP的结合率是G-Exos的3倍(图2)。

实施例4

丝素亲和性工程化外泌体的内化实验

将结合丝素亲和性工程化外泌体的丝素蛋白浸提液(SGM-Exo@SFP)作用于HaCat细胞，研究外泌体在受体细胞中的内化情况。在HaCat细胞中分析G-Exos的内在化。HaCat细胞被播种在5×10⁴细胞/24-well板一天之前添加SGM-Exos(100μg/mL)和SGM-Exo@SFP培养1、3、6、9、12、18、24和36h。PBS两次，洗后的内化液由发光成像系统进行了分析。

结果证实SGM-Exo@SFP可以持续内化作用于受体细胞，为受体细胞提供SGM-Exo(图3)。

实施例5

结合有丝素蛋白的丝素亲和性工程化外泌体(SGM-Exo@SFP)的稳定性评估

1.活性存贮稳定性实验

将稳定性的两个存储温度(室温RT和4℃)，发现SGM-Exo@SFP组Gluc信号持续了很长时间的价格相比SGM-Exo组无论是在RT或4℃，这表明SFP可以提高稳定性的SGM-Exos(图4中A和B)。

2.评估SGM-Exos结合丝素材料在体内的稳定性

SFP加载100μg SGM-Exos，将SGM-Exo@SFP植入裸鼠背部皮下。对照组为100μg不加SFP的SGM-Exos。给药0、12、24、36、48、72h后，用IVIS Lumina成像系统成像。

BLI数据显示，两组患者的Gluc信号均在12h以内检测。与SGM-Exo组快速下降的Gluc信号相比，SGM-Exo@SFP组的Gluc信号保持在一定水平范围达72h以上(图4中C)。

SFBP提高了SGM-Exos与SFP的结合速率，SFP可以改善丝素亲和性工程化外泌体的持续释放和活力稳定性。

3.结合有丝素蛋白的丝素亲和性工程化外泌体(SGM-Exo@SFP)中miRNA的稳定性

通过检测丝素亲和性工程化外泌体中miRNA的基础表达量，对比结合丝素蛋白前后，丝素亲和性工程化外泌体中miRNA的稳定性。从外泌体中分离miRNA，并进一步合成cDNA作为模板进行定量PCR(qPCR)检测，其中检测用引物和内参引物GAPDH分别为天根和上海生工的产品化引物(UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU，SEQ ID NO：22)，反应体系和程序参考操作说明书。在Stratagene MX3005P qPCR系统上，设置反应总体积为20μL，选择miR146a作为miRNA的代表进行PCR的测定，每个反应建立3个重复样本。使用针对GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)设计的引物(TIANGEN产品化引物)，用相同数量的模板建立3个重复反应，作为结果标准化的内控基因参考标准。对于所有的qPCR检测，通过结合每个实验中使用的所有模板的样本，通过串联稀释cDNA建立标准曲线来检测不同引物组的效率。数据采用2^-ΔΔCT法进行靶基因定量，并进行t检验分析。

结果显示，SGM-Exo@SFP组中miR146a的基础表达量高于SGM-Exo组，表明了SGM-Exo@SFP对miRNA的保护作用(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体的膜蛋白为融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白Lactadherin；

所述丝素蛋白结合肽插入膜蛋白Lactadherin中SP和C1C2结构域之间；

所述丝素蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求1所述丝素亲和性工程化外泌体，其特征在于，所述外泌体装载miR146a；所述外泌体的膜蛋白还为融合表达MS2结构域；

所述MS2结构域在膜蛋白Lactadherin中C1C2结构域的C端表达；

所述MS2结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种权利要求1～3任意一项所述丝素亲和性工程化外泌体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒；

2)将步骤1)中所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒转染细胞，收集包装的慢病毒颗粒；

3)将步骤2)中所述包装的慢病毒颗粒感染细胞，经筛选，得到的阳性细胞进行培养，收集上清液，分离丝素亲和性工程化外泌体。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤1)中所述融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤2)中所述转染的方法为将制剂1和制剂2混合，加至无血清培养基孵育的细胞中，4～6h后更换为有血清培养基，继续培养48～72h；

所述制剂1为含Lipo2000的Opti-MEM培养基；所述Opti-MEM和Lipo2000的体积比为250:10；

所述制剂2为含miR146a质粒和MS2质粒的Opti-MEM培养基；所述Opti-MEM、miR146a质粒和MS2质粒的质量比为250:2:2。

7.根据权利要求4～6任意一项所述构建方法，其特征在于，融合表达有丝素蛋白结合肽和MS2结构域的膜蛋白的编码序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；

当外泌体包含miR146a时，所述含融合表达有丝素蛋白结合肽的膜蛋白的编码序列的慢病毒质粒和含miR146a前体序列的慢病毒质粒共同转染细胞。

8.一种结合丝素蛋白的功能性外泌体，其特征在于，为权利要求1～3任意一项所述丝素亲和性工程化外泌体或权利要求4～7任意一项所述构建方法构建得到的丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白结合形成的复合体；

所述丝素亲和性工程化外泌体和丝素蛋白的质量比为1:10。

9.权利要求1～3任意一项所述丝素亲和性工程化外泌体或权利要求8所述结合丝素蛋白的功能性外泌体在制备组织修复与再生的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述组织修复与再生包括以下一种或几种组织损伤修复：皮肤组织损伤修复与再生、心血管组织修复与再生、骨组织修复与再生和软骨组织修复与再生。

Images