CN115948563A - 蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述蛋白标志物选自：载脂蛋白C‑I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4‑α‑甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素‑1、Ras相关蛋白Ral‑A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶[羧化]、N‑乙酰半乳糖胺‑6‑硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶3。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学技术领域，具体涉及一种蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。
背景技术
近年来，原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）发病率在逐年升高，2022年中国国家癌症中心数据显示，HCC年新发病例数38.9万，占恶性肿瘤第4位，死亡33.6万，占第2位。因多数病例起病隐匿、病情进展快；在就诊时约2/3的患者为中晚期，治疗效果差，这导致HCC病死率高，严重威胁我国人民的生活质量和生命财产安全。
在我国，慢性乙型肝炎高发，且是HCC最重要的病因之一，约60%的HCC是乙肝病毒（Hepatitis B，HBV）感染相关。慢性乙型肝炎患者会出现肝炎后肝硬化及HBV相关HCC，发生风险逐年累积，且HCC也可独立于肝硬化发生。因此，能明确将HBV相关HCC与慢性乙型肝炎相鉴别的生物标志物对慢性乙型肝炎的治疗和HCC患者的诊断具有重大意义。
对HCC早诊断、早治疗能有效改善预后、提高生存率。在HCC诊断方面，病理诊断是金标准，但其操作具有侵入性，会对患者造成一定的损伤；且穿刺组织较少，存在诊断质量不稳定；另外，肿瘤会造成针道转移等问题，导致在临床上较难被广泛使用。甲胎蛋白（AFP）一直被作为HCC的血清学诊断指标。但该指标在早期HCC筛查应用中存在一定的缺陷，例如约40%～60%的确诊HCC患者AFP并未有明显升高，而在一些非HCC患者中也有AFP升高。近年来，有学者应用血液中查找7种microRNA来联合诊断，增加了诊断的敏感性和特异性，但需要取血、且费用相对高昂限制了其推广。因此亟需更多创伤小、操作简便、容易重复的检查来用于HCC的筛查、诊断及长期监测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，通过检测该蛋白标志物的表达水平可以诊断受试者是否患有肝癌。
为此，本发明的第一方面提供了蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其中，所述蛋白标志物包括选自下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3。
在一些实施方式中，所述蛋白标志物包括选自下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、GTP环水解酶1、烟酸核苷酸焦磷酸化酶[羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Ras相关蛋白Ral-A、谷胱甘肽过氧化物酶3、羧肽酶N亚基2。
在一些实施方式中，所述蛋白标志物包括生长/分化因子15、载脂蛋白C-I和胆碱转运蛋白样蛋白4的组合。
在一些实施方式中，所述样本来自受试者的体液；例如尿液、血液、血清、血浆、唾液、淋巴液、脑脊髓液、腹水、粪便、胆汁、组织液等。
在一些实施方式中，所述样本为受试者的尿液。
在一些实施方式中，所述肝癌为原发性肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为乙肝相关肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述检测试剂包括选自下组的一种或两种以上的组合：质谱鉴定试剂、抗体、探针、引物。
在一些实施方式中，所述抗体为全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、双链Fv片段或单链Fv片段。
在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述产品为试剂盒或者芯片。
在一些实施方式中，所述检测试剂所检测的样本来自受试者，所述受试者为哺乳动物。
在一些实施方式中，所述受试者为人。
在一些实施方式中，所述检测试剂检测所述蛋白标志物的表达水平；所述表达水平为蛋白质表达水平或核酸表达水平。
在一些实施方式中，相较于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平上升指示所述受试者患有肝癌：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2；所述对照为健康个体，或者为患有乙型肝炎且未患有肝细胞肝癌的个体。
在一些实施方式中，相对于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平下降指示所述受试者患有肝癌：纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3；所述对照为健康个体，或者为患有乙型肝炎且未患有肝细胞肝癌的个体。
本发明的第二方面，提供一种用于诊断受试者肝癌的试剂盒或芯片，其包括针对样本中蛋白标志物的检测试剂；其中，所述蛋白标志物包括选自下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3。
在一些实施方式中，所述检测试剂包括选自下组的一种或两种以上的组合：质谱鉴定试剂、抗体、探针、引物。
在一些实施方式中，所述抗体为全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、双链Fv片段或单链Fv片段。
在一些实施方式中，所述抗体为单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述检测试剂检测所述蛋白标志物的表达水平；所述表达水平为蛋白质表达水平或核酸表达水平。在某具体实施方案中，所述表达水平为蛋白质表达水平。
在一些实施方式中，所述肝癌为原发性肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为乙肝相关肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。
在一些实施方式中，所述受试者为人。
本发明的第三方面，提供一种用于诊断受试者是否患有肝癌的方法，其包括：获得来自所述受试者和对照的样本；检测所述样本中的蛋白标志物的表达水平；将所述受试者的样本中的所述蛋白标志物表达水平与所述对照的样本中的所述蛋白标志物表达水平进行比较；确定所述受试者是否患有肝癌；
所述蛋白标志物包括下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3。
在一些实施方式中，相较于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平上升指示所述受试者患有肝癌：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2；所述对照为健康个体，或者为患有乙型肝炎且未患有肝细胞肝癌的个体。
在一些实施方式中，相对于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平下降指示所述受试者患有肝癌：纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3；所述对照为健康个体，或者为患有乙型肝炎且未患有肝细胞肝癌的个体。
在一些实施方式中，所述样本来自所述受试者的体液；例如尿液、血液、血清、血浆、唾液、淋巴液、脑脊髓液、腹水、粪便、胆汁、组织液等。
在一些实施方式中，所述样本为所述受试者的尿液。
在一些实施方式中，所述肝癌为原发性肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述肝癌为乙肝相关肝细胞肝癌。
在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。
在一些实施方式中，所述受试者为人。
在一些实施方式中，所述表达水平为蛋白质表达水平或核酸表达水平。在某具体实施方案中，所述表达水平为蛋白质表达水平。
在一些实施方式中，采用质谱方法、ELISA方法、或Western方法检测所述蛋白标志物的表达水平。
在一些实施方式中，采用质谱方法检测所述蛋白标志物的表达水平；在获得所述样本后，还包括以下步骤：对所述样本进行蛋白酶消化处理。在具体的实施方案中，用所述蛋白酶使所述样本中的蛋白质片段化。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
本发明通过研究确定了用于诊断肝癌的蛋白标志物，本发明提供了针对样本中该蛋白标志物的检测试剂在制备用于诊断受试者肝癌的产品中的应用。其优点主要在于：取样操作不具有侵入性，对患者不会造成任何损伤；操作简便、容易重复、费用低廉，易于在临床上开展应用，可用于对肝癌的筛查、诊断及长期检测。通过应用本发明的技术方案，有利于对肝癌进行早诊断、早治疗，从而有利于改善预后、提高生存率。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1：用载脂蛋白C-I的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性肝炎的ROC图；
图2：用胆碱转运蛋白样蛋白4的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC分析结果；
图3：用生长/分化因子15的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图4：用一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图5：用异质核核糖核蛋白M的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图6：用无羊膜蛋白的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图7：用钙霉素-1的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图8：用GTP环水解酶1反馈调节蛋白的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图9：用烟酸核苷酸焦磷酸化酶[羧化]的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图10：用N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图11：用Ras相关蛋白Ral-A的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图12：用谷胱甘肽过氧化物酶3的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图13：用羧肽酶N亚基2的表达水平区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图；
图14：用生长/分化因子15、载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4的表达水平的组合区分乙肝相关肝癌与慢性乙肝的ROC图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
针对现有技术中对于肝细胞肝癌诊断方法的缺陷，本发明提供了蛋白质标志物，从而能够以尿液为检测样本进行肝细胞肝癌的诊断。
综合看目前广泛应用于临床的液体检测，多集中在血液检测，尿液检测的应用很少，其潜力未被充分挖掘。在机体患病时，血液中出现的疾病相关的异常物质，被排入尿液；另外，由于在膀胱中停留了数小时，尿液内源性蛋白酶的水解降解过程在排尿前已基本完成，收集到的尿蛋白较为稳定。因此，尿液能够提供更多样、更敏感的疾病生物标志物。同时，尿液还具有完全无创、易得、储存要求低等特性，这更加增强了尿液生物标志物检测的临床实用性和可推广性。
在本发明的研究中，对来自乙肝相关肝癌患者和慢性乙型肝炎患者的尿浆进行了蛋白质谱分析，并确定了尿液中乙肝相关肝癌的诊断生物标志物，后续针对其中与肝癌明确相关的蛋白对对应的肝癌标本进行免疫组化。
除非另外指明，本文中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
本文中，术语“肝癌”指肝脏恶性肿瘤，可分为原发性肝癌和继发性肝癌。当肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，称为原发性肝癌；当全身其他器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏，称为继发性或转移性肝癌。
本文中，术语“肝细胞肝癌”，又称“肝细胞性肝癌”（hepatocellular carcinoma，HCC），指由肝实质细胞（多角细胞）起源的肝脏恶性肿瘤，是肝癌的一种病理类型，属于原发性肝癌。
本文中，术语“乙肝相关肝细胞肝癌”指在乙型肝炎基础上发生的肝细胞肝癌。受试者患有乙肝相关肝细胞肝癌，指受试者为乙型肝炎病毒阳性或有慢性乙肝病史，并且患有肝细胞肝癌。
本文中，术语“乙肝”、“乙型肝炎”，指乙型病毒性肝炎。乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种疾病。
本文中，术语“抗体”是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的（即全长的）抗体，而且还包括其抗原结合片段（例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv）、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体）及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
本文中，“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于灵长类（例如人和非人灵长类如猴）或其他哺乳动物（例如牛、羊、猫、犬、马、兔和啮齿动物如小鼠和大鼠）。特别地，所述受试者是人。
实施例1受试者腹部CT/MRI检查
所有受试者均通过腹部CT（电子计算机断层扫描）/MRI检查，确定是否患有乙肝相关肝细胞肝癌。检查方法如下：
乙肝病毒相关原发性肝细胞肝癌的诊断前提为HBsAg阳性或有慢性乙肝病史。欲确诊是否为原发性肝细胞肝癌，则术前需要有相应的肿瘤标志物阳性、典型影像学表现（有肝硬化者且肝脏结节>1-2 cm者）或组织学检查结果（无肝硬化者、影像学表现不典型者）。本研究皆选择有术后病理确认为肝细胞肝癌的患者，其至少具有以下之一的影像学表现：
（1）CT表现
①肝脏内单发或多发结节状肿块，呈膨胀性生长。
②肿块边缘不清楚，有假包膜者则边缘清楚，占位效应明显。
③肿块多数为低密度，少数表现为等密度或高密度。
④增强扫描：在动脉期，主要为门静脉供血的肝实质还未出现明显强化，而主要由肝动脉供血的肝癌，则出现明显的斑块状、结节状早期强化；在门静脉期，门静脉和肝实质明显强化，而肿瘤没有门静脉供血则强化程度迅速下降；平衡期，肝实质继续保持较高程度强化，肿瘤强化程度则继续强化而呈现相对低密度表现。全部增强呈快进快出的现象。
⑤多伴有肝硬化征象。
⑥门静脉、肝静脉及下腔静脉侵犯或癌栓形成。
⑦胆道系统侵犯，引起胆道扩张。
⑧肝门部或腹主动脉旁、腔静脉旁淋巴结增大提示淋巴结转移。
⑨肺、肾上腺、骨骼转移。
⑩腹水。
（2）MRI表现：
肿块表现与CT相似。中晚期肝细胞癌在T1WI上表现为稍低或等信号，肿瘤出血或脂肪变性表现为高信号，坏死囊变则出现低信号灶。40%的肝癌可见肿瘤的假包膜，T1WI上表现环绕肿瘤周围，厚约0.5-3mm的低信号环。T2WI上肿瘤呈稍高信号，T2WI脂肪抑制序列肿块表现为更为清楚的稍高信号。若门、肝静脉扩张，其中见到软组织肿块信号，提示门、肝静脉癌栓形成。同时也可见到腹部淋巴结肿大等转移征象。
实施例2乙肝相关肝细胞肝癌的蛋白标志物分析
按照以下步骤分析得到乙肝相关肝细胞肝癌的蛋白标志物。
（一）样本收集：
收集受试者晨起第一次中段尿，尿样采集自北京协和医院的33名乙肝相关肝细胞肝癌患者、26名慢性乙型肝炎患者、30名健康者。将每个受试者的第一次晨尿收集在50 mL离心管中，并在4℃条件下以3000×g离心30分钟去除细胞碎片。将上清液转移到2 mL EP管中并储存在-80℃以供进一步分析。样本储存时间1-12个月。尿样中未添加蛋白酶抑制剂。
纳排标准如下：
1、患乙肝病毒相关肝细胞肝癌、即将接受根治性切除手术的患者，入排标准如下：
1.1.成年患者，知情同意，自愿入组；
1.2.有术前一周内的HBV-DNA定量、乙肝五项，且可确诊慢性乙型肝炎；
1.3.有住院后的术前血生化（至少包括ALT、AST、TBil/DBil、ALB）、血常规（主要关注PLT）、凝血结果，及前后一周内的AFP结果；
1.4.有留取标本当天的尿常规结果及术后1周左右的晨起中段尿；
1.5.有腹部增强CT图像，评估符合根治性部分肝切除手术指征，除外禁忌；
1.6.术后病理标本确诊原发性肝细胞肝癌；
1.7.排除酗酒、HCV、自身免疫病、肝毒性药物毒物等其他慢性肝损伤因素；
1.8.排除泌尿系统感染、血尿、大量蛋白尿、泌尿系统肿瘤等影响尿液质量因素（手术除外）；
1.9.排除急性感染性疾病及合并其他恶性肿瘤。
1.10.术后半年内随访保证该切除为根治性切除
2、慢性乙型肝炎患者，入排标准如下：
2.1.成年患者，知情同意，自愿入组；
2.2.有留取尿液标本时间点前后一周内的乙肝五项及HBV-DNA定量结果，且可确诊慢性乙型肝炎；
2.3.有留取尿液标本当天的尿常规、血生化（至少包括ALT、AST、TBil/DBil、ALB）、血常规（主要关注PLT）及凝血结果；
2.4.有留取尿液标本时间点前后一月内的肝脏超声结果；
2.5.肝硬化者应符合病理学标准或临床诊断标准；
2.6.排除酗酒、HCV、自身免疫病、肝毒性药物毒物等其他慢性肝损伤因素；
2.7.排除泌尿系统感染、血尿、大量蛋白尿、泌尿系统肿瘤等影响尿液质量因素；
2.8.排除急性感染性疾病及合并其他恶性肿瘤。
3、健康者，入排标准如下：
3.1.成年患者，知情同意，自愿入组；
3.2.有留尿前后一周内的HBV-DNA定量、乙肝五项，且可确诊慢性乙型肝炎；
3.3.有留尿前血生化（至少包括ALT、AST、TBil/DBil、ALB）、血常规（主要关注PLT）、凝血结果，及前后一周内的AFP结果；
3.4.有留取标本当天的晨尿及相应尿常规结果；
3.5.排除酗酒、HCV、自身免疫病、肝毒性药物毒物等其他慢性肝损伤因素；
3.6.排除泌尿系统感染、血尿、大量蛋白尿、泌尿系统肿瘤等影响尿液质量因素（手术除外）；
3.7.排除急性感染性疾病及合并其他恶性肿瘤；
（二）实验过程：
用150μL的70%乙醇预润湿PVDF 96孔板（MSIPS4510，Millipore，Billerica，MA），并用300μL的20 mM Tris平衡。用20 mM DTT对应2mL尿液，并用50 mM IAM中烷基化，之后用12 mL预冷丙酮提取尿蛋白。将100微克蛋白质沉淀物重新溶解在200μL的20 mM Tris中，并转移到PVDF 96孔板中。然后用200μL的20 mM Tris洗涤样品，并在37℃下用胰蛋白酶（1:50）消化2小时。所得肽用150μL 40% ACN ( v /v)/0.1% (v/v) FA洗脱两次。肽溶液在真空浓缩器中干燥，在30 μL 0.1% FA中重构，2 μg最终产物用于 LC-MS/MS 分析。
（三）蛋白检测与数据处理：
通过LC-MS/MS进行蛋白检测，具体地，Orbitrap Fusion Lumos MS（ThermoScientific，Waltham，MA，USA）与EASY-nLC 1000（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）用于数据相关采集（DDA）模式下的MS分析（开发样品制备方法）或数据独立采集（DIA）模式。
使用SIMCA 14.0软件（瑞典 Umetrics）进行模式识别分析，包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。双尾t检验用于统计比较。使用 GraphPadPrism5.0版（Intuitive Software for Science, GraphPad Software Company, San Diego, CA,USA）进行数据分析和可视化。在MetaAnalyst 3.0平台上使用“Biomarker discovery”模块和逻辑回归算法进行探索性ROC分析。进一步分析归一化数据，将不同组中的DEP定义为相对于对照组的倍数变化>1.5或<0.667的蛋白质（P值<0.05（t检验）和荧光值>150）。
（四）蛋白鉴定结果
对上述样本中的62个因子的表达情况进行了检测。将33例乙肝相关肝细胞肝癌患者的样本中的蛋白表达情况与对照（26例慢性乙型肝炎和30例健康者的样本）相比较，筛选出变化倍数在1.5倍以上且独立样本t检验p<0.05的差异蛋白作为诊断标志物。表1显示，共筛选出差异蛋白20个，11个蛋白升高，9个蛋白降低。
表1. 乙肝相关肝细胞肝癌患者和对照差异表达的尿液蛋白标志物
实施例3乙肝相关肝细胞肝癌的蛋白标志物的验证
为进一步证实所筛选的蛋白标志物在乙肝相关肝细胞肝癌诊断中的灵敏度与特异性，针对表1中的蛋白，采用市售抗体，绘制了上述标志物在区分乙肝相关肝细胞肝癌患者和慢性乙型肝炎对照的ROC曲线。具体步骤如下：
对于实施例2中的33例乙肝相关肝细胞肝癌患者和26例慢性乙型肝炎患者对照受试者的尿液样本，两组性别和年龄匹配，采用盲法，测试样本中的蛋白表达水平。绘制ROC曲线并计算AUC值，结果如表2及图1~13所示。另外，选取生长/分化因子15（Growth/differentiation factor 15），载脂蛋白C-I（Apolipoprotein C-I），胆碱转运蛋白样蛋白4（Choline transporter-like protein 4）的组合，其ROC曲线如图14所示，ROC曲线下AUC值为0.97，灵敏度90.9%，特异度88.5%。
表2. 乙肝相关肝癌患者和对照差异表达的
尿液蛋白标志物AUC值、灵敏度及特异度
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述蛋白标志物包括选自下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3。
2.如权利要求1所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂所检测的样本来自受试者的尿液。
3.如权利要求1所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂包括选自下组的一种或两种以上的组合：质谱鉴定试剂、抗体、探针、引物。
4.如权利要求1所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂检测所述蛋白标志物的表达水平；所述表达水平为蛋白质表达水平或核酸表达水平。
5.如权利要求4所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，相较于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平上升指示受试者患有肝癌：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2；和/或，
相对于对照，选自下组的一种或两种以上组合的蛋白标志物表达水平下降指示受试者患有肝癌：纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶[羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3；
所述对照为健康个体，或者为患有乙型肝炎且未患有肝细胞肝癌的个体。
6.如权利要求1所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述检测试剂所检测的样本来自受试者，所述受试者为哺乳动物。
7.如权利要求1~6任一项所述的蛋白标志物的检测试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其特征在于，所述肝癌为乙肝相关肝细胞肝癌。
8.一种用于诊断受试者肝癌的试剂盒或芯片，其特征在于，包括针对样本中蛋白标志物的检测试剂；
其中，所述蛋白标志物包括选自下组中的一种或两种以上的组合：载脂蛋白C-I、胆碱转运蛋白样蛋白4、生长/分化因子15、人组织激肽释放酶结合蛋白、天冬氨酸氨基转移酶（细胞质）、蝶呤4-α-甲醇胺脱水酶、蛋白质二硫键异构酶CRELD1、粘附G蛋白偶联受体G1、一种具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶1、异质核核糖核蛋白M、无羊膜蛋白、钙霉素-1、Ras相关蛋白Ral-A、羧肽酶N亚基2、纤维蛋白原β链、转醛醇酶、GTP环水解酶1反馈调节蛋白、烟酸核苷酸焦磷酸化酶 [羧化]、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、谷胱甘肽过氧化物酶 3。
9.如权利要求8所述的用于诊断受试者肝癌的试剂盒或芯片，其特征在于，所述检测试剂包括选自下组的一种或两种以上的组合：质谱鉴定试剂、抗体、探针、引物。
10.如权利要求8所述的用于诊断受试者肝癌的试剂盒或芯片，其特征在于，所述检测试剂检测所述蛋白标志物的表达水平；所述表达水平为蛋白质表达水平或核酸表达水平。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| XIANGKUN WANG等: "Diagnostic and prognostic significance of mRNA expressions of apolipoprotein A and C family genes in hepatitis B virus‐related hepatocellular carcinoma", 《J CELL BIOCHEM.》, vol. 120, no. 10, pages 2 * |
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