CN115948432A - 一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因psy-e2克隆转化的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY‑E2克隆转化的方法及其应用。在对小麦‑长穗偃麦草(7D/7el2)易位系的材料表型分析发现，易位系材料小麦精面粉色泽为黄色，通过对长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)全基因组测序，酵母文库筛选，发现长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶PSY‑E2基因可能参与调控小麦胚乳叶黄素的形成。根据长穗偃麦草基因组设计特异性引物，最终克隆得到PSY‑E2基因。通过转基因技术将长穗偃麦草PSY‑E2基因转入普通小麦品种Fielder中，发现转入PSY‑E2后的转基因小麦面粉显著变黄，叶黄素含量显著上升。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种领域，具体涉及的是一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2克隆转化的方法及其应用。
背景技术
由于在长期的自然选择压力下，作物的野生近缘种，往往具备普通栽培种所不具备的环境适应性以及独特品质，因此通过远缘杂交将野生近缘种的优异基因转入栽培种中，是实现品种选育与改良的重要手段。长穗偃麦草作为小麦的一个重要野生近缘种具有栽培小麦不具有的抗病(Wang et al 2020)、抗旱(Kumar et al 2017)、优质(Ge et al2021；Tanaka et al 2017)等多种优异性状，是小麦育种改良的一个重要种质资源(Xu etal 2020)，长穗偃麦草多个基因已经成功转入到栽培小麦中，如抗赤霉病基因Fhb7(Wanget al 2020)、抗秆锈病基因Sr61(Zhang et al 2021)和耐盐基因TtLEA2(Yang et al2022)等。
叶黄素是人体所需的一种重要的微量营养元素，也是构成人体视网膜黄斑的一个重要色素，适当的增加叶黄素的摄入，能够改善人体视觉功能和减轻老年黄斑病变的风险，同时叶黄素作为抗氧化物质和生物活性物质，对清除体内氧自由基和对抗衰老具有重要作用。研究显示，一个成年人的叶黄素日常摄入量应达到10mg来满足健康需求(Group*2013)，然而，全世界人们的日常摄入量基本都无法达到这一标准。美国成年人的日常叶黄素摄入量仅为1～2毫克(Mares-Perlman et al 2002)，西班牙成年人的叶黄素日常摄入量约为3.5mg，而德国的相对较多，为5.33mg/天(Eisenhauer et al 2017)，叶黄素营养元素短缺已经成为全世界面临的一个普遍问题。
小麦(Triticum aestivum L.)作为世界上最重要的粮食作物之一，为全世界人类提供了约20％的能量和蛋白质，对稳定世界粮食安全具有重要作用(Shiferaw et al2013)。其物美价廉、风味独特，被世界人们所喜爱。培育富含叶黄素的营养专用型小麦，对提高人类叶黄素摄入量，改善叶黄素营养短缺现状具有重要意义。
小麦面粉黄度是多基因控制的数量性状(Zhai et al 2018)。连锁分析发现，硬粒小麦(2n＝4X＝28，包括A基因组和B基因组)第7同源群(7A和7B)长臂QTL对面粉黄度的贡献率达到60％(Colasuonno et al 2019)，同时，长穗偃麦草7el1染色体同样具有调控面粉黄度的基因(Zhang and Dubcovsky 2008)，而八氢番茄红素合成酶PSY作为叶黄素合成的关键酶正位于该两个区段，因此推断PSY可能调控小麦叶黄素的形成影响面粉黄度。但是没有更加直接的证据表明八氢番茄红素合成酶PSY是否参与小麦面粉叶黄素的形成，因此至今没有形成定论。
发明内容
本发明要解决的关键问题在于长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶PSY-E2基因的克隆及其在促进小麦胚乳叶黄素形成中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本实验室一直致力于通过远缘杂交将长穗偃麦草的优异基因转移到栽培小麦中进行育种利用。
1.在对小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料的农艺性状调查的过程中，发现易位系材料面粉普遍较黄，通过对易位系面粉的叶黄素含量进行检测发现，易位系小麦面粉中的叶黄素含量显著提高。通过长穗偃麦草基因组序列和连锁分析发现，长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因(PSY-E2)位于该区间。
2.长穗偃麦草PSY-E2基因启动子序列的克隆。以小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系DNA为模板，利用正反向引物PSY-E2-prom-F：CATGATGCCACTAACTCTGA和PSY-E2-prom-R：AGCAGTGCAGGCTCACGTGGT进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY-E2基因启动子序列，如SEQ IDNo.1所示，包含3002bp核苷酸。
3..长穗偃麦草PSY-E2基因CDS序列的克隆。以小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的cDNA为模板，利用正反向引物PSY-E2：GTGCCTCAATTCCTCTGCTCC和PSY-E2-R：GCCTAACCTGACCATCTTCATCTTG进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY-E2基因CDS序列，如SEQ IDNo.2所示，包含1293bp核苷酸。
4.长穗偃麦草PSY-E2基因原始表达载体构建。以测序正确的启动子和CDS序列作为模板，分别利用3301-E2prom-F/E2prom-R和E2prom-CDS-F/3301-E2-R两对引物，进行PCR扩增，胶回收产物通过同源重组到pCAMBIA3301载体，热激转化大肠杆菌DH5α，并测序验证。测序正确阳性克隆pCAMBIA-PSY-E2热激转化农杆菌EHA105，PCR检测为阳性的克隆进行保存，用于进一步的遗传转化。
5.长穗偃麦草PSY-E2基因克隆及转化在促进小麦胚乳叶黄素合成中的应用验证，包括：(1)小麦遗传转化，(2)转基因阳性株系检测，(3)转基因小麦总类胡萝卜素含量检测，(4)转基因小麦叶黄素含量检测。
本发明提供了长穗偃麦草PSY-E2基因克隆及转化在改变小麦精面粉黄度中的应用，所述应用通过转基因技术予以实现。将长穗偃麦草PSY-E2基因转入栽培小麦中，使该基因在普通小麦中进行表达。
有益效果：本发明进行了长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2基因克隆和转化，长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2成功导入普通栽培小麦中后，能够显著提高小麦胚乳中叶黄素含量，导致小麦胚乳显著变黄、品质改善。PSY-E2在控制小麦胚乳叶黄素合成过程中扮演重要作用，是小麦品质改良上的一个重要功能基因。
附图说明
图1：PSY同源基因在小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系灌浆期籽粒中的表达水平。
其中，JM22：背景材料济麦22；A052-2、A075-5-3、A064-12分别为小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行，**代表P＜0.01。
图2：小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系中的总类胡萝卜素。
其中，JM22：背景材料济麦22；A052-2、A075-5-3、A064-12分别为小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行，**代表P＜0.01。
图3：小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系中的叶黄素含量
其中，JM22：背景材料济麦22；A052-2、A075-5-3、A064-12分别为小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行，**代表P＜0.01。
图4：长穗偃麦草PSY-E2转基因小麦灌浆期籽粒中的PSY表达水平
其中，Fielder为非转基因对照，YE1和YE8为长穗偃麦草PSY-E2转基因植株。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行，**代表P＜0.01。
图5：转基因小麦株系精面粉中的总类胡萝卜素
其中，Fielder为非转基因对照，YE1和YE8为长穗偃麦草PSY-E2转基因植株。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行，**代表P＜0.01。
图6：转基因小麦株系精面粉中的叶黄素含量
其中，Fielder为非转基因对照，YE1和YE8为长穗偃麦草PSY-E2转基因植株。数据显示的为3个生物学重复的平均值，误差线为3次重复的SD，显著性分析用t-test进行**代表P＜0.01。
具体实施方式
为使发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方案仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
在此，还需要说明的是，本发明提供了长穗偃麦草PSY-E2基因及其在小麦品质改良中的应用；通过实验室前期获得的长穗偃麦草测序数据，得到PSY-E2基因的启动子序列和完整CDS序列。以小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的DNA为模板克隆获得PSY-E2的启动子序列，以小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的cDNA为模板克隆获得PSY-E2的CDS序列，并构建原始表达载体，遗传转化受体小麦材料Fielder进行转基因功能验证，发现在Fielder中表达长穗偃麦草PSY-E2基因能够显著提高小麦面粉中的叶黄素含量。
为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
实施例1
该实施例提供筛选叶黄素合成候选基因长穗偃麦草PSY-E2基因的方法：
本发明中小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料，精面粉色泽表现为黄色(见图2)，即胚乳发黄，通过对次生代谢产物分析发现，小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料面粉中叶黄素含量显著提高(图3)。通过连锁分析和对长穗偃麦草基因组测序发现，长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶PSY基因位于该区段，可能参与调控小麦面粉叶黄素的合成。进一步对小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料灌浆期的籽粒进行表达分析发现，小麦-长穗偃麦草(7D/7el2)易位系材料灌浆期的籽粒PSY表达显著升高(图1)，因此长穗偃麦草PSY基因极有可能参与了小麦胚乳叶黄素的合成。我们将该基因命名为PSY-E2(长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因)。
实施例2
该实施例提供长穗偃麦草PSY-E2基因及其克隆方法，具体包括如下步骤：
(1)引物设计
根据长穗偃麦草测序获得的7el2染色体拼接序列设计引物，分别克隆长穗偃麦草PSY-E2的启动子序列和CDS序列。
PSY-E2启动子克隆引物序列：
PSY-E2-prom-F：CATGATGCCACTAACTCTGA (SEQ ID No.3)
PSY-E2-prom-R：AGCAGTGCAGGCTCACGTGGT (SEQ ID No.4)
PSY-E2的cDNA克隆引物序列
PSY-E2：GTGCCTCAATTCCTCTGCTCC (SEQ ID No.5)
PSY-E2-R：GCCTAACCTGACCATCTTCATCTTG (SEQ ID No.6)
另外设计了PSY同源基因保守区段的定量引物，引物序列如下：
qPSY-F：GAGGGCCTATGTTGGGAAGG (SEQ ID No.7)
qPSY-R：GTAAGAGCAGCGATCTCCCG (SEQ ID No.8)
(2)DNA抽提
1.取300mg左右的小麦叶片放入含有2mm钢珠的2ml离心管中(低温保存)。
2.用液氮充分浸泡待提取材料后，利用样品粉碎仪研磨样品。
3.研磨样品前，打开水浴锅(65℃)水浴CTAB溶液，样品研磨完成后，迅速向样品中加入700μl(±50μl)已预热到65℃的CTAB溶液，盖好盖子上下颠倒混匀。
4.将样品放入65℃水浴锅中水浴45min，每隔10-15min上下颠倒几次，使细胞充分裂解。
5.水浴完成后将样品取出冷却至室温(可置于4℃冰箱加速冷却)。
6.向样品中加入与CTAB等体积的三混(DNA提取酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)溶液，上下剧烈摇晃，于4℃冰箱静置10-30min。
7.于4℃离心机12000rpm离心20min。
8.吸取500～700μl(视上清体积而定)上清液，转入新的1.5ml离心管中，并加入与上清液等体积的凉异丙醇(-20℃)，上清液1/10体积的醋酸钠(4℃)轻轻混匀，于-20℃放置30min以上。
9.于4℃离心机12000rpm离心20min。
10.弃上清。
11.洗涤DNA，加入500μl70％的凉乙醇(-20℃)，上下轻轻颠倒，至白色沉淀漂浮。
12.于4℃离心机12000rpm离心20min。
13.弃上清。(70％的凉乙醇洗涤2次)
14.加入100μl超纯水，充分溶解DNA沉淀。
15.取所得的DNA溶液3μl进行琼脂糖凝胶(1％琼脂糖胶)电泳，检测DNA质量和浓度，质量合格的用于后续基因启动子的克隆。
(3)RNA的抽提
去大田种植条件下灌浆期的小麦籽粒，在液氮中研磨成粉末，利用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的总RNA提取试剂盒(RNApure)进行抽提，具体方法如下：
准备试剂：氯仿、异丙醇、RNase-free ddH2O、75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)。
1.取0.1-0.2g研磨好的籽粒样品加入1ml的RNApure，混匀。
2.将均浆样品室温静置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3.加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温静置13分钟.
4.4℃12000rpm离心10分钟，样品会分为三层：有机相、中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，将水相(约0.5ml)转移到新的离心管中。
5.加入0.5倍体积的无水乙醇和100μl结合液N，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中，吸附柱套在收集管内。
6.12000rpm离心30秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管内。
7.加入500μl漂洗液RW，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
8.重复步骤7。
9.将吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10.取出吸附柱，放入一个新的RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加60-100μl的RNase-free ddH2O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，得到RNA溶液。样品可保存于-80℃超低温冰箱以备长期使用。
11.将所得的RNA溶液取3μl进行琼脂糖凝胶(1％琼脂糖胶)电泳，检测RNA质量和浓度，质量合格的用于后续反转录cDNA制备实验。
(4)cDNA的制备
1.基因组DNA的去除。在RNase-free的200μl八连管中配置如下混合液:
表1DNA去除反应体系Table 1Reaction mixture of DNA wiper
移液器轻轻吹打混匀，42℃条件下反应2min。
2.反转录体系配置。向第一步的反应混合液中加入4μL 5×HiScript II qRTSuperMix II，用移液器轻轻吹打混匀。
3.反转录反应程序。50℃(如果模版具有复杂二级结构或高GC区域，可将反应温度提高至55℃，有助于产量的提高)，15min；85℃，5s。反转产物可用于后续qRT-PCR，转录本序列克隆等实验。活在-20℃条件下保存半年，长期存放应置于-70℃条件下。cDNA建议分装使用，避免反复冻融。
(5)PCR反应和克隆载体构建
分别以上述得到的小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的DNA(用于PSY-E2的启动子克隆)和小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的cDNA(用于PSY-E2的CDS序列克隆)为模板，使用已合成好的扩增引物序列，配制如表2所示的PCR反应体系(2×PhantaRTurbo Master Mix，Vayzme)，克隆PSY-E2的启动子序列(3002bp)和CDS序列(1430bp)。反应程序为：95℃，30秒；95℃，15秒；55℃，30秒；72℃，1～4分钟；34个循环(2-4步)；72℃，10分钟；4℃保存。
表2Phanta高保真酶的PCR反应体系Table 2Reaction mixture of PCR with 2×PhantaR Turbo Master Mix
PCR扩增得到的产物(启动子PSY-E2-prom和转录本PSY-E2-transcript)利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，然后分别切胶回收目的片段。琼脂糖凝胶回收使用小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Omega，D2500-02)，操作步骤按说明书进行，最后用30μL无菌ddH2O洗脱，得到启动子PSY-E2-prom和转录本PSY-E2-transcript产物。取2μL产物对质量和浓度进行琼脂糖凝胶电泳检测。
将胶回收的目标片段分别连接至pCE2 TA/Blunt-Zero载体(喏维赞，C601-01)上，得到克隆载体pCE2-PSY-E2-prom和pCE2-PSY-E2-transcript，然后分别转化至大肠杆菌DH5α。待转化子长出后，挑取单克隆37℃200rpm培养4～5小时后，用M13通用引物进行PCR检测，挑取3个阳性克隆送测序公司(上海生工生物有限公司)进行测序，选取无突变克隆，摇菌，提取质粒(Omega，D6943-02)，操作步骤按说明书进行。
实施例3
该实施例是将实施例2中得到的克隆载体进行叶黄素合成广泛性的验证，具体验证步骤如下：
(1)引物设计
3301-E2prom-F：agctatgaccatgattacgaattcCATGATGCCACTAACTCTGA(SEQIDNo.9)
E2prom-R：GTGCTGCATGCGCGCAACAC(SEQ ID No.10)
E2prom-CDS-F：gtgttgcgcgcatgcagcacATGGCCACCACCGCCACGC(SEQ ID No.11)
3301-E2-R：gatccccgggtaccgagctcGAATTCGGTCTGGTTATTTCTCAGT(SEQ IDNo.12)
(2)植物原始表达载体的构建
以3301-E2prom-F和E2prom-R为正反向引物，以上述克隆载体pCE2-PSY-E2-prom为模板，克隆得到片段1；以E2prom-CDS-F和3301-E2-R为正反向引物，以上述克隆载体pCE2-PSY-E2-transcript为模板，克隆得到片段2。PCR反应体系见表2。将片段1和片段2按照表3的体系与原始表达载体pCAMBIA3301进行多片段重组反应，利用重组酶(喏维赞，C115-01)将片段1和片段2重组到经过限制性内切酶EcoRⅠ单酶切(Thermo Fisher，FD0275)的pCAMBIA3301载体上(酶切体系见表4)。50℃孵育15分钟。将5μL重组产物加入50μL感受态细菌DH5α进行转化，次日挑取单克隆菌落进行PCR菌落检测，阳性克隆送取测序(上海生工生物有限公司)。
表3多片段重组体系Table 3Reaction components of Recombinant enzyme
表4酶切反应体系
Table 4 Reaction components of FastDigest enzymes
测序正确的目标载体命名为pCAMBIA-PSY-E2，然后该质粒热激转化至农杆菌EHA105中。具体操作如下：
①取50μL冰浴上融化的农杆菌EHA105感受态细胞，加入(1-5μL)目的基因质粒pCAMBIA-PSY-E2，冰浴10分钟。
②液氮冷激3分钟，37℃水浴3分钟。
③加入600μL YEB，28℃200rpm摇床，复苏2～4小时。
④4000rpm离心4分钟，根据实验要求，吸取不同体积已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的YEB琼脂培养基上将细胞均匀涂开。待液体被吸收后封口，倒置平板，28℃培养2-3d。
⑤挑取单菌落进行PCR菌落检测，获得阳性克隆。
(3)小麦遗传转化
小麦遗传转化工作由中国农业科学院完成。将获得的受体材料为Fielder的T0代转基因株系，种植于生长室，进行PCR阳性检测，挑选阳性株系继续繁殖。对T3代纯和材料进行表型鉴定。
(4)PSY-E2调控叶黄素合成功能验证
对T3代纯和的转基因株系的PSY同源基因进行表达检测，结果发现，与对照Fielder相比，转基因株系YE1和YE8灌浆期籽粒中PSY的表达显著升高(图4)。将2个T3代转基因株系与对照Fielder同时种植于温室，转基因株系和对照在田间农艺性状上无显著差异。分别收获转基因株系和对照材料成熟的小麦籽粒，烘干后磨成小麦全粉，利用超声波法对小麦总类胡萝卜素进行抽提，并利用液相色谱检测小麦全粉中叶黄素的含量，具体操作方法如下：
①用精确度为千分之一的分析天平分别称取不同面粉样品每份2.0克，置于50mL离心管，加入15mL色素提取液。
②使用超声波辅助色素溶于色素提取液(正己烷：丙酮：无水乙醇＝2：1：1，含0.1‰BHT)中30分钟，每隔5-10分钟拿出来摇晃一下，然后与离心机里4000g离心10分钟，将上清液转移至另一个新的50mL离心管，向沉淀中再重复加入15mL色素提取液提取两次至溶液无色。
③合并三次的上清液，将上清液用10％的NaCl水溶液在50mL的分液漏斗中反复洗三次至呈中性，弃掉下层的水层。
④冲洗完之后将上层溶液倒入25mL的容量瓶中，然后用正己烷定容至25mL。
⑤将色素溶液装入一个新的50mL离心管中，用氮吹仪浓缩至有机溶剂全干。
⑥加入4mL的MTBE(含0.1‰BHT)溶解，再加入4mL的10％KOH-甲醇溶液(称取10克的KOH，0.01克BHT，加入25mL超纯水，75mL甲醇混匀)，将离心管上部充满氮气，在避光条件下皂化10小时。
⑦将皂化后的溶液加入8mL饱和NaCl水溶液和4mL MTBE(含0.1‰BHT)使之更好的溶解并分层，洗去水层。再用5mL的饱和NaCl水溶液冲洗3次，洗至中性，弃去水层并将上层浓缩液倒入一个新的15mL离心管中。
⑧用氮吹仪吹干后用2mL MTBE(含0.1‰BHT)溶解。
注：以上色素提取，皂化等各操作均在弱光或避光条件下进行。
⑨叶黄素含量的测量与计算：将获得的浓缩液利用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography，HPLC)进行叶黄素的含量测定，HPLC洗脱条件为：
流动相A：乙腈：甲醇＝3：1(含0.01％BHT，0.05％TEA)，B：100％MTBE(含0.01％BHT)。流速为1mL/min。采用梯度洗脱：0min：A-B(95：5)；0-10min：A-B(95：5)；10-19min：A-B(86：14)；19-29min：A-B(75：25)；29-54min：A-B(50：50)；54-66min：A-B(26：74)；67min：A-B(95：5)。采用叶黄素外标法(B21485，源叶生物)进行定量。
从图5中我们可以看到，与对照Fielder籽粒全粉抽提的总类胡萝卜素相比，由转基因株系抽提到的总类胡萝卜素的颜色明显更黄，进一步通过液相色谱检测的叶黄素含量结果可以看到，转基因株系的叶黄素含量显著高于对照(见图6)，因此，可以得出，长穗偃麦草PSY-E2基因能够促进小麦胚乳叶黄素的合成，显著提高小麦面粉中叶黄素的含量。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。
Claims (5)
1.一种长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2克隆转化的方法，包括以下步骤：
(1)材料选择；小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系，该易位系中所有单株的精面粉色泽均为黄色，即胚乳发黄；
(2)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2基因启动子序列的克隆；以小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的DNA为模板，利用正反向引物进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY-E2基因启动子序列，如SEQ ID No.1所示，包含3002bp核苷酸；
(3)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2基因CDS序列的克隆；以小麦-长穗偃麦草7D/7el2易位系A052-2的cDNA为模板，利用正反向引物进行PCR反应，获得长穗偃麦草PSY-E2基因CDS序列，如SEQ ID No.2所示，包含1293bp核苷酸；
(4)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2基因原始表达载体构建；以测序正确的启动子和CDS序列作为模板，分别利用3301-E2prom-F/E2prom-R和E2prom-CDS-F/3301-E2-R两对引物，进行PCR扩增，胶回收产物通过同源重组到pCAMBIA3301载体，热激转化大肠杆菌DH5a，并测序验证；测序正确阳性克隆pCAMBIA-PSY-E2热激转化农杆菌EHA105，PCR检测为阳性的克隆进行保存，用于进一步的遗传转化；
(5)长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2基因转化以及小麦胚乳叶黄素合成中的检测，包括：小麦遗传转化，转基因阳性株系检测，转基因小麦总类胡萝卜素含量检测，转基因小麦叶黄素含量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述正反向引物为PSY-E2启动子克隆引物序列如下：
PSY-E2-prom-F：CATGATGCCACTAACTCTGA；如SEQ ID No.3所示；
PSY-E2-prom-R：AGCAGTGCAGGCTCACGTGGT；如SEQ ID No.4所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述正反向引物为PSY-E2的cDNA克隆引物序列如下：
PSY-E2：GTGCCTCAATTCCTCTGCTCC；如SEQ ID No.5所示；
PSY-E2-R：GCCTAACCTGACCATCTTCATCTTG；如SEQ ID No.6所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)所述引物3301-E2prom-F/E2prom-R和E2prom-CDS-F/3301-E2-R分别如下：
3301-E2prom-F：agctatgaccatgattacgaattcCATGATGCCACTAACTCTGA；如SEQ ID No.9所示；
E2prom-R：GTGCTGCATGCGCGCAACAC；如SEQ ID No.10所示；
E2prom-CDS-F：gtgttgcgcgcatgcagcacATGGCCACCACCGCCACGC；如SEQ ID No.11所示；
3301-E2-R：gatccccgggtaccgagctcGAATTCGGTCTGGTTATTTCTCAGT；如SEQ ID No.12所示。
5.长穗偃麦草八氢番茄红素合成酶基因PSY-E2克隆转化的方法在提高小麦精面粉叶黄素含量中的应用，所述应用通过转基因技术予以实现，将长穗偃麦草PSY-E2基因转入栽培小麦中，使该基因在普通小麦中进行表达。
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2022
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| CN115843677B (zh) * | 2022-12-13 | 2024-02-09 | 山东农业大学 | 小麦-长穗偃麦草抗茎基腐病短片段易位系的创制方法及其应用 |
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