CN115948345A - 草鱼CD3e杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用，该杂交瘤细胞株已于2022年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2022215；该草鱼CD3e单克隆抗体由杂交瘤细胞株分泌得到，该草鱼CD3e单克隆抗体在制备检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒中得以应用；利用该单克隆抗体可以通过酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹法、免疫荧光测定免疫组织化学和流式细胞术等免疫学方法简便、快速、准确地检测出草鱼CD3e蛋白的表达水平。另外，该草鱼CD3e单克隆抗体特异性好，灵敏度高，可为鱼类免疫学基础研究提供工具，具有很好的应用前景。

Description

草鱼CD3e杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株和其分泌的CD3e单克隆抗体，以及草鱼CD3e单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体以及产生细胞因子等，在抵御疾病感染、肿瘤的形成中发挥重要作用。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，在机体的免疫反应中具有重要地位。CD3e分子也称为CD3E，是一种T细胞表面单程I型膜糖蛋白。CD3e分子包含1个Ig样(免疫球蛋白样)结构域和1个ITAM结构域。CD3e分子与CD3-γ、CD3-δ和CD3-ζ以及T细胞受体α/β和γ/δ杂二聚体一起形成T细胞受体-CD3复合物。这种复合物在抗原识别与多种细胞内信号转导途径耦合方面发挥着重要作用。

草鱼是我国最重要的淡水养殖品种之一，由于其肉质鲜美，价格低廉，备受消费者喜爱。近年来，由于养殖密度不断增加，过量投饵及水质严重恶化等因素，养殖草鱼的病害也越来越多，造成了大量死亡，严重阻碍了草鱼养殖业的可持续发展。而免疫系统在鱼类的疾病防控及免疫调节中发挥重要作用。其中CD3是T淋巴细胞最重要的细胞表面标志物之一，在抗原识别过程中具有重要的信号传递功能。草鱼CD3e单克隆抗体的制备，可以为鱼类免疫系统的研究提供工具，在加深对草鱼免疫系统研究的同时也可以加深对鱼类抗病机理的认识。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

第一方面，本发明提供了一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株，该草鱼CD3e杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C2022215，该杂交瘤细胞株是采用草鱼CD3e蛋白作为抗原免疫小鼠得到的，将其命名为杂交瘤细胞株GC9-CD3e，已于2022年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉市武汉大学。

第二方面，本发明提供了一种草鱼CD3e单克隆抗体，该草鱼CD3e单克隆抗体由上述的草鱼CD3e杂交瘤细胞株分泌得到。

作为本发明的一种优选实施例，草鱼CD3e单克隆抗体的制备方法包括：取上述的杂交瘤细胞株的培养上清液和/或将上述的杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔，抽取腹水并离心，纯化，得到草鱼CD3e单克隆抗体。

第三方面，本发明提供了一种草鱼CD3e单克隆抗体的应用，该草鱼CD3e单克隆抗体在制备检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒，其包括上述的草鱼CD3e单克隆抗体。

作为本发明的一种优选实施例，试剂盒选自酶联免疫吸附剂测定试剂盒、蛋白质印迹法试剂盒、免疫荧光测定、免疫组织化学试剂盒和流式细胞术试剂盒中的一种以上。

第五方面，本发明提供了一种草鱼CD3e单克隆抗体的应用，草鱼CD3e单克隆抗体在酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blot)、免疫荧光测定(IFA)、免疫组织化学(IHC)和流式细胞术检测(FCM)中的应用，即草鱼CD3e单克隆抗体可使用ELISA特异性检测草鱼血清中CD3e的蛋白浓度；也可通过Western blot检测草鱼组织或细胞中CD3e蛋白的表达；通过冷冻组织切片技术，利用激光共聚焦检测草鱼组织中CD3e的表达情况；也可通过流式细胞术检测草鱼细胞中CD3e的表达分布情况。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明针对草鱼CD3e单克隆抗体缺失的问题，提供了分泌草鱼CD3e单克隆抗体的杂交瘤细胞株GC9-CD3e，具有良好的传代能力，并能大量扩增，且纯化的草鱼CD3e单克隆抗体，纯度较高(＞90％)，亲和常数分别为2.08E+08和2.98E+09。利用该单克隆抗体可以通过IHC、WB、ELISA、FCM等免疫学方法简便、快速、准确地检测出草鱼CD3e蛋白的表达水平，而不与草鱼其它蛋白发生交叉反应。可为鱼类免疫学基础研究提供工具，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的实施例2中动物免疫后抗体效价检测结果图。

图2为本发明的实施例2中SDS-PAGE检测草鱼CD3e单抗的纯度图。

图3为本发明的实施例2中ELISA检测草鱼CD3e单克隆抗体的亲和常数结果图。

图4为本发明的实施例2中Western blot检测草鱼CD3e单克隆抗体特异性的结果图。

图5为本发明的实施例3中免疫荧光检测草鱼CD3e的细胞定位图。

杂交瘤细胞株GC9-CD3e在2022年8月17日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：C2022215。

具体实施方式

本发明提供了一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株及单克隆抗体和应用。

下面结合附图和本发明中的具体实施例详实描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

本发明所用试剂及其来源：大肠杆菌(Escherichia coli)BL21感受态细胞(本实验室保存)、SPF BALB/c雌性小鼠(Mus muscμLus)(北京华大蛋白质研发中心有限公司)、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0Cell)(北京华大蛋白质研发中心有限公司)、HEK293细胞(人胚胎肾细胞293)(本实验室保存)、ExTaq Mix和Prime star购于TaKaRa；琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购于OMEGA；蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、琼脂糖、氯化钠、甘油、Triton X-100、10×TBS漂洗液购于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性内切酶购于Thermo Fisher公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、Tris-HCl、DTT、EDTA购于VWR公司；氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、盐酸胍购于Amresco公司；高糖DMEM基础培养液、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素、磷酸缓冲盐溶液(PBS)购于gibco公司；LipofectamineTM3000购于ThermoFisher公司。

实施例1：草鱼CD3e抗原的制备

(1)草鱼CD3e全基因组的克隆及原核表达质粒的构建

根据草鱼基因组数据库(http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/)，利用LocalBlast技术，通过与其他脊椎动物的同义基因序列进行比对，获得草鱼CD3e部分CDS序列，并对其进行验证。接下来利用5′RACE和3′RACE技术，获得草鱼CD3e的5′和3′末端序列。并根据测序结果对其进行拼接，从而获得全长序列。通过高保真酶PrimeSTAR进行全长序列的扩增并测序验证。

根据选择的NcoI和HindIII酶切位点，设计带有保护性碱基和酶切位点的引物克隆CD3e的DNA序列。

其中，草鱼CD3e基因碱基序列(SEQ ID NO.1)：

ATGATTCTCACGGGCTTCGTGTTTCTGATGCTCACGGCGGCGCTGAGTCCAGCTGAGGGTCAAGAAATCAAAGAAATCACAGCAAATAGTGTCATTCTGACCTGCTCTGGAGGTGAATCTGACAAGTGGTATAAAAATAAAGAGACAAATGTGATGAGTAGCACCTATGAAGTTCAAGCGGAAAATGGAATAGTTGAAGGAGTGTACCACTGTGAATATACAGAAAATTTAAAAACCATCAAACACATGTTCTACCTCAATGTAAAGGTGTGTGAGAACTGCTATGAGTTGAGCGGGTTCTTGGCGTGGGGCGTCATATTCGGTGACTTACTGGTTACAGGAGCAGTTATTCTCATCGTCTACATGTGTGTGCCGAAAAACACTGGCAGCACACAGCAGAAAGCATCAAAATCACGAACAGCAGGCGCTCCTCCACCTCCAAACCCAGATTATGAGAGACTGAATCATAACACGCGCAGCGCTGATTTGTACGCAGGCCTTCACAAATAG(其中下划线分别为启动密码子和终止密码子)。

其草鱼CD3e氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下所示：

MILTGFVFLMLTAALSPAEGQEIKEITANSVILTCSGGESDKWYKNKETNVMSSTYEVQAENGIVEGVYHCEYTENLKTIKHMFYLNVKVCENCYELSGFLAWGVIFGDLLVTGAVILIVYMCVPKNTGSTQQKASKSRTAGAPPPPNPDYERLNHNTRSADLYAGLHK。

将pEHISTEVb载体和克隆的草鱼CD3e基因片段分别用NcoI和HindIII进行双酶切，酶切后用胶回收试剂盒对载体酶切产物和目的片段酶切产物进行胶回收。在T4DNA连接酶的作用下将草鱼CD3eDNA片段连接到pEHISTEVb载体上。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性单克隆送至上海金唯智公司进行测序确认。

(2)重组草鱼CD3e原核蛋白的诱导表达

1)取出大肠杆菌BL21感受态细胞，放在冰上融化，将构建的CD3e原核表达质粒加入大肠杆菌BL21感受态细胞中，冰浴30min；

2)将冰浴好的感受态细胞放至42℃水浴锅中热激90S，立即放至冰上冷却；

3)加入400μL无抗的LB液体培养基，放在摇床上培养1h后，取100μL涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基中，放在37℃培养箱中过夜培养；

4)挑取单克隆菌落，并进行阳性菌落鉴定，选择阳性克隆送至公司测序；

5)将阳性单克隆菌落转接至含卡那霉素的LB液体培养基中进行培养，培养至对数生长期后加入1mmol/L IPTG诱导剂继续培养；

6)收集菌液通过SDS-PAGE和Western blot方法进行表达鉴定。

(3)草鱼CD3e重组蛋白的纯化

1)将上述能够表达草鱼CD3e的菌液按照1：100的比例加入1L含有卡那霉素的LB液体培养基中，将菌液培养至对数生长期后加入1mL、1mmol/L IPTG，继续培养12h；

2)离心收集菌体，进行高压破碎，高速离心后收集上清和沉淀。经SDS-PAGE分析显示，蛋白在包涵体中表达；

3)提取包涵体：将包涵体重悬于20mL含有1‰DTT的洗涤缓冲液中(50mmol/L的Tris-cl pH 8.0，300mmol/L的NaCl，10mmol/L的EDTA，0.5％ Triton-100)，离心，并弃去上清液。重复上述步骤，将包涵体清洗一次。接下来用20mL含1‰DTT的重悬缓冲液(50mmol/L的Tris pH值为8.0，100mmol/L的NaCl，10mmol/L的EDTA)重悬包涵体，并离心弃上清。最后使用DTT的溶解缓冲液(6mol/L盐酸胍，10％甘油，50mmol/L的Tris-cl，pH值为8.0，100mmol/L的NaCl，10mmol/L的EDTA)溶解包涵体至最终包涵体浓度为30mg/mL，并在4℃下完全溶解，离心后，将包涵体的上清液转移至新的试管中，储存在-20℃下备用。

4)重组蛋白的复性与纯化：本实施例采用稀释复性方法，取10mL提取好的30mg/mL包涵体，加入1L预冷复性液(100mmol/L的Tris，pH值为8.0，400mmol/L的L-ArgHCl，0.5mmol/L的GSH，0.5mmol/L的GSSG)中复性36h。将复性好的蛋白加入搅拌式浓缩杯中，在0.4kPa氮气压力下，将复性好的蛋白溶液滤过10ku超滤膜进行浓缩，待浓缩至小体积后，将浓缩的蛋白置换于300mmol/L蛋白缓冲液中(300mmol/L的NaCl，20mmol/L的Tris-HCl)继续浓缩，待浓缩至小体积后转移至超滤管中继续浓缩，直至体积不大于5mL。使用AKTA pure蛋白纯化仪进行分子筛层析纯化可溶性蛋白，并进行浓缩，将浓缩好的蛋白保存至-80℃冰箱中。

实施例2：草鱼CD3e单克隆抗体的制备

主要包括：(1)免疫小鼠；(2)细胞融合；(3)挑选阳性杂交瘤细胞株；(4)培养杂交瘤细胞株，使之分泌草鱼CD3e单克隆抗体；(5)纯化获得单克隆抗体。

(1)免疫小鼠

用纯化的草鱼CD3e原核蛋白初次皮下注射免疫4只SPF级BALB/c雌性小鼠，60μg/只，编号分别为CD3e-1、CD3e-2、CD3e-3和CD3e-4。此后分别进行四次加强免疫，每次皮下免疫注射小鼠，每只30μg蛋白，每次免疫间隔时间为两周。最后一次加强免疫小鼠10d后进行眼眶取血。

(2)ELISA测血清效价

用2μg/mL的草鱼CD3e蛋白，4℃包被过夜；2％牛奶，37℃封闭2h；血清从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照(blank)为PBS，阴性对照(negative)为阴性血清200倍稀释。将稀释好的血清加入到蛋白包被的孔中，37℃孵育1h，洗涤液洗涤3次，加入PBS稀释20000倍的二抗，37℃孵育1h；取出后用洗液洗涤3次；每孔加入100μL显色液显色5min；加入50μL终止液终止显色，用酶标仪测双波长(450，630)处的吸光值，结果如图1所示。

(3)细胞融合

取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养，具体步骤如下：

1)将状态良好的sp2/0细胞轻柔地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50mL离心管中；

2)小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min；

3)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rpm，5min；

4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15mL离心管中，再加入2mL的HAT，2mL的HT放在孵箱中备用；

5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rpm，5min)；

6)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1min内缓慢加入1mL的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2mL的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8mL无血清的IMDM。离心1000rpm，5min；

7)倒掉上清，加入10mL的血清，小心地将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25mL灭过菌的半固体培养基，充分混匀，然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

(4)筛选阳性单克隆

挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100μL/孔)。用“CD3e”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选：用包被液稀释草鱼重组CD3e蛋白，至终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用洗液洗涤3次；2％牛奶封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2h后用洗液洗涤3次；加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照(PBS)、阳性对照(阳性血清PBS1000倍稀释)，均为100μL/孔，37℃孵箱，1h后用洗液洗涤3次；加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1h；取出后用洗液洗涤3次；显色，显色液100μL/孔，显色时间为5min左右；每孔加入50μL终止液终止后用酶标仪测OD值，共筛选得到22株阳性杂交瘤细胞株。接下来将22株阳性的细胞株，分别用“CD3e”和“标签蛋白”包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到10株阳性杂交瘤细胞株。最后对筛选出来的10株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到8株IgG类型阳性杂交瘤细胞株，结果见表1。

表1 CD3e阳性杂交瘤细胞上清抗体效价测定及亚型鉴定

(5)单克隆抗体的纯化

挑选编号为9和17杂交瘤细胞株分别在培养基中培养，将细胞稀释至3×10⁶个/mL后腹腔注射BALB/c小鼠，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。在4℃条件下12000rpm离心10min，通过0.22μm的滤膜进行过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质。然后使用HiTraprProtein A FF色谱柱进行亲和纯化，用SDS-PAGE的方法检测抗体的纯度，结果如图2所示。最后使用ELISA的方法检测抗体的亲和常数，结果如图3所示。

(6)Western blot检测抗体的特异性

将CD3e真核表达质粒转染至293T细胞，24h后收集细胞蛋白样，进行电泳，将电泳完成的蛋白凝胶通过转膜仪转印至PVDF膜上，配置5％脱脂奶粉封闭两个小时，将纯化好后的抗体稀释后孵育两个小时，TBST洗膜三次，之后使用鼠二抗孵育1h，TBST洗涤3次后通过照胶仪进行显色，结果显示两种杂交瘤细胞分泌的抗体都具有很好的特异性。结果如图4所示。

实施案例3：草鱼CD3e单克隆抗体的应用

(1)应用于ELISA

采用草鱼CD3e为待测抗原进行包被，并用草鱼重组CD3e蛋白作为标准品，用稀释液进行梯度稀释制成标准曲线，设置2μg/mL BSA作阴性对照，4℃静置过夜。接下来用脱脂奶粉封闭；洗涤后加入CD3e单克隆抗体孵育2h；洗涤后加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵育1h；洗涤三次后加入显色液显色5min；接下来加入终止液进行终止，并用酶标仪测定450nm处的OD值。

(2)应用于Western blot

制备草鱼组织或细胞蛋白样，进行电泳，将电泳完成的蛋白凝胶通过转膜仪转印至PVDF膜上，配置5％脱脂奶粉封闭两个小时，将纯化好后的抗体稀释后孵育两个小时，TBST洗膜三次，之后使用鼠二抗孵育1h，TBST洗涤3次后通过照胶仪进行显色，结果显示两种杂交瘤细胞分泌的抗体都具有很好的特异性。

(3)应用于IFA

将培养良好的293T细胞平铺放置于盖玻片的平皿中，待细胞大约长至单层后转染CD3e真核表达质粒，18h后制备样品，首先用PBS洗后，用4％多聚甲醛固定15min，用TritonX-100进行透射，接下来用PBST封闭2h，然后用FITC标记的CD3e单克隆抗体孵育2h，最后用DAPI进行核染色，然后使用激光共聚焦显微镜进行拍照。结果如图5所示。

(4)应用于IHC

该单克隆抗体可用于IHC，检测组织中的CD3e的表达。

(5)应用于FCM

该单克隆抗体可用于FCM，检测细胞中表达的CD3e。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种草鱼CD3e杂交瘤细胞株，其特征在于：所述草鱼CD3e杂交瘤细胞株的保藏编号为：CCTCC NO：C2022215。

2.一种草鱼CD3e单克隆抗体，其特征在于：所述草鱼CD3e单克隆抗体由权利要求1所述的草鱼CD3e杂交瘤细胞株分泌得到。

3.一种如权利要求2所述的草鱼CD3e单克隆抗体的应用，其特征在于：所述草鱼CD3e单克隆抗体在制备检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于：其包括权利要求2所述的草鱼CD3e单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的检测草鱼CD3e蛋白的试剂或试剂盒，其特征在于：所述试剂盒选自酶联免疫吸附剂测定试剂盒、蛋白质印迹法试剂盒、免疫荧光测定试剂盒、免疫组织化学试剂盒和流式细胞术试剂盒中的一种以上。

6.一种如权利要求2所述的草鱼CD3e单克隆抗体的应用，其特征在于：所述草鱼CD3e单克隆抗体在酶联免疫吸附剂测定、蛋白质印迹法、免疫荧光测定、免疫组织化学或流式细胞术检测中的应用。

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