CN115944668B - 桑叶提取物的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种桑叶提取物在制备抗大口黑鲈病毒的制剂中的应用。还包括涉及一种抗大口黑鲈病毒的加州鲈饲养方法，包括给加州鲈喂食桑叶提取物，优选地，在饲料中添加桑叶提取物喂食加州鲈。以及还提供了一种抗大口黑鲈病毒的制剂，其活性物质包括桑叶提取物和其他辅料。

Description

桑叶提取物的新应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是涉及桑叶提取物的新应用。

背景技术

大口黑鲈病毒(Largemouth bass ranavirus，LMBV)属于虹彩病毒科蛙病毒属中的一个成员，是一种胞质型双链大DNA病毒，其传染性强，易导致大口黑鲈系统性疾病和爆发性死亡，是严重危害加州鲈(Micropterus salmoides) 养殖业的传染性病原，暂无商品化疫苗，其对世界范围内的给加州鲈养殖业造成严重经济损失。

桑叶为桑科植物桑(Morus albal)的叶，是一种常见的中药。最早见于《神农本草经》，味甘，性平、寒，可清肝明目聪耳，镇静神经，润肺热，止咳，通关节。千百年来，桑叶主要被用于桑蚕养殖。由于桑叶中富含多种天然活性物质，可提高机体免疫机能，有利于动物抗病和保健。近年来，对桑叶的应用展开了一系列的研究，包括抗病毒和抑菌的研究，以及对降血糖和血脂的作用等等。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供桑叶提取物的新应用。

包括以下技术方案。

本发明的第一个方面，是提供了桑叶提取物在制备抗大口黑鲈病毒的制剂中的应用。

本发明的第二个方面，是提供了一种抗大口黑鲈病毒的加州鲈饲养方法，所述方法包括给加州鲈喂食桑叶提取物，优选地，在饲料中添加桑叶提取物喂食加州鲈。

本发明的第三个方面，是提供了一种抗大口黑鲈病毒的制剂。

一种抗大口黑鲈病毒的制剂，其活性物质包括桑叶提取物和其他辅料。

在其中的一些实施例中，所述制剂为加州鲈饲料，所述其他辅料为饲料的组分。

在其中的一些实施例中，所述桑叶提取物的添加量为所述辅料的 0.2-0.8wt％，进一步0.4-0.6wt％。

在其中的一些实施例中，所述桑叶提取物为桑叶干粉的水提取物，或者乙醇提取物。

在其中的一些实施例中，所述桑叶干粉的乙醇提取物的制备方法包括：桑叶干粉中加入75-100％的乙醇回流提取，提取液减压蒸馏浓缩，经真空干燥后，可得桑叶醇提物。

在其中的一些实施例中，桑叶干粉中加入80-95％的乙醇,乙醇与桑叶干粉的重量比例为12-15：1，回流提取2-4小时，提取温度为60-80℃。

在其中的一些实施例中，桑叶干粉中加入85-92％的乙醇,乙醇与桑叶干粉的重量比例为13-14：1，回流提取2-4小时，提取温度为65-75℃。

在其中的一些实施例中，所述桑叶干粉的水提取物的制备方法包括：桑叶干粉中加入热水，水浴浸提后过滤，滤液减压浓缩后去除蛋白质，最后用乙醇醇析，即得到桑叶水提物。

在其中的一些实施例中，提取温度为60℃-85℃，更优选为70℃-85℃，水浴浸提时间为75min-105min，优选为85min-95min。

在其中的一些实施例中，水与桑叶干粉的重量比例为20-30：1，优选为22-28： 1。

在其中的一些实施例中，用12％-15％三氯乙酸去除蛋白质。

在其中的一些实施例中，以浓度为80％-90％的乙醇醇析。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的发明人通过体外和体内试验证明了桑叶提物对LMBV具有抑制作用，在对试验鱼进行LMBV腹腔注射中实验，可发现饲料中添桑叶提取物，特别是桑叶水提物，可以提高攻毒加州鲈的存活率。肠道和脾脏组织病理学分析显示，饲料中添加桑叶水提物或醇提物后，可以明显减轻攻毒后两个器官的症状。本发明的发明人在研究中发现，对加州鲈饲料中添加桑叶提取物，可以有效提高加州鲈生长性能，提高加州鲈抗LMBV能力，从而将桑叶提取物制成各种制剂，用于防治大口黑鲈病毒。

附图说明

图1是生长性能指标的结果示意图；其中，FCR:饵料系数；WGR：增重率；SGR：特定生长率。

水提物组为饲料中添加桑叶水提物腹腔注射LMBV；醇提物组为饲料中添加桑叶醇提物腹腔注射LMBV；对照组为投喂基础饲料腹腔注射LMBV；*表示P<0.05,** 表示P<0.01。

图2是存活率曲线的结果示意图，其中，水提物组为饲料中添加桑叶水提物腹腔注射LMBV。

醇提物组为饲料中添加桑叶醇提物腹腔注射LMBV；对照组为投喂基础饲料腹腔注射LMBV。

图3是LMBV攻毒后解剖学症状的结果示意图，其中(A)：LMBV攻毒后，试验组和对照组体色发黑，空白组体色正常；(B)：攻毒后肝脏变白(矩形)，脾脏肿大(圆圈)，肠道发炎(箭头)；(C)：肠道发炎(箭头)，性腺出血(粗箭头)；水提物组为饲料中添加桑叶水提物腹腔注射LMBV；醇提物组为饲料中添加桑叶醇提物腹腔注射LMBV；对照组为投喂基础饲料腹腔注射LMBV。

图4肠道病毒拷贝数结果示意图，其中，单位：copies/ng，**表示极显著 (P<0.01)，*表示显著(P<0.05)，水提物组为饲料中添加桑叶水提物腹腔注射LMBV；醇提物组为饲料中添加桑叶醇提物腹腔注射LMBV；对照组为投喂基础饲料腹腔注射LMBV。

图5肝脏、肾脏、脾脏中病毒含量的结果示意图，其中，水提物组为饲料中添加桑叶水提物腹腔注射LMBV；醇提物组为饲料中添加桑叶醇提物腹腔注射LMBV；对照组为投喂基础饲料腹腔注射LMBV。

图6 LMBV对大口黑鲈前肠组织病理影响，其中，A、B、C、D为放大40倍，标尺：100μm，E、F、G、H为放大400倍，标尺：20μm；投喂基础饲料注射PBS 的空白组(D、H)：正常肠道绒毛形态和肠上皮细胞，肠上皮细胞微绒毛形态正常且丰富；投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组(A、E)：(A)肠绒毛断裂，消失(箭头)，(E)上皮细胞受损严重(箭头)，黏膜和黏膜下层炎细胞严重浸润(圆圈)；饲料中添加桑叶醇提物LMBV攻毒的醇提物组(B、F)：(B)前肠没有明显组织病理变化，但绒毛褶皱减少；饲料中添加桑叶水提物LMBV攻毒的水提物组(C、G)：前肠没有明显组织病理变化，但前肠绒毛稍缩短(C)。

图7 LMBV对大口黑鲈中肠组织病理影响，A、B、C、D为放大40倍，标尺：100 μm，E、F、G、H为放大400倍，标尺：20μm；投喂基础饲料注射PBS的空白组 (D、H)：正常肠道绒毛形态和肠上皮细胞，肠上皮细胞微绒毛形态正常且丰富。投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组(A、E)：(A)肠绒毛断裂，消失，(E) 上皮细胞受损严重(箭头)，黏膜和黏膜下层炎症细胞严重浸润(圆圈)；饲料中添加桑叶醇提物LMBV攻毒的醇提物组(B、F)：(B)绒毛褶皱变少，(F) 上皮细胞部分脱落(箭头)；饲料中添加桑叶水提物LMBV攻毒的水提物组(C、 G)：(C)中肠绒毛破碎断裂(箭头),(G)上皮细胞脱落(箭头)，黏膜下层炎症细胞浸润(圆圈)。

图8 LMBV对大口黑鲈后肠组织病理影响，其中，A、B、C、D为放大40倍，标尺：100μm，E、F、G、H为放大400倍，标尺：20μm；投喂基础饲料注射PBS 的空白组(D、H)：正常肠道绒毛形态和肠上皮细胞，肠上皮细胞微绒毛形态正常且丰富。投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组(A、E)：(A)肠绒毛断裂，消失，(E)上皮细胞受损严重(箭头)；饲料中添加桑叶醇提物LMBV攻毒的醇提物组(B、F)：(B)绒毛断裂(箭头)，绒毛变短。饲料中添加桑叶水提物 LMBV攻毒的水提物组(C、G)：(C)中肠绒毛缩短,(G)黏膜下层炎症细胞浸润(箭头)。

图9 LMBV对大口黑鲈脾脏组织病理影响的结果示意图，其中，A、B、C、D为放大40倍，标尺：100μm，E、F、G、H为放大400倍，标尺：20μm。投喂基础饲料腹腔注射PBS的空白组(D、H)：脾脏组织没有明显的病理变化。投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组(A、E)：(A)脾脏被膜脱落(箭头)，组织中出现空洞(圆圈)，脾脏出血严重(矩形)；饲料中添加桑叶水提物攻毒的水提物组(B、F)：(B)脾脏破裂(圆圈)，被膜脱落(箭头)；饲料中添加桑叶水提物攻毒的水提物组(C、G)：(C)脾脏被膜脱落(箭头)，组织中出现空洞(圆圈)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明通过体外和体内试验比较了桑叶粗提物、水提物和醇提物抗LMBV效果。细胞水平试验结果显示，桑叶水提物在细胞水平的2-5天的安全浓度是1-5 mg/ml，而桑叶醇提物的安全浓度为50μg/ml。细胞水平测定水提物对LMBV抑制作用，测定EC₅₀(concentration for 50％of maximal effect)为444.7μg/ml。将桑叶水提物和醇提物按照0.5％添加至加州鲈饲料组方，饲喂加州鲈(初始平均体重12±2g)15天后腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV。结果表明，饲料中添加桑叶水提物组饵料系数(FCR)显著低于饲料中添加桑叶醇提物组(P<0.01)和投喂基础饲料的对照组(P<0.05)，水提物组的增重率和特定生长率高于对照组，且这种差异具有极显著性(P<0.01)。醇提物组在生长性能改变方面不明显。对饲喂14天的各组试验鱼进行剂量为2×10⁵TCID₅₀的LMBV腹腔注射，观察14天发现，饲料中添加0.5％桑叶提取物，可以提高攻毒加州鲈的存活率，其中添加桑叶水提物组与对照组相比，存活率提高具有显著性(P<0.05)，水提物组的相对保护率(RPS)为72.77％，醇提物组的相对保护率为38.6％。对攻毒第三天加州鲈进行病毒含量检测，发现前肠、中肠、后肠、肝脏和脾脏中，饲喂基础饲料的对照组病毒含量显著高于饲料中添加桑叶水提物或者醇提物的试验组(P<0.05或P<0.01)，其中，后肠中对照组的病毒含量是醇提物组的32 万倍，肝脏中病毒含量对照组是醇提物组的12780倍。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中所用的桑叶提取物的制备方法如下。

桑叶干粉制备方法：桑叶采自广东省佛山市，自然晾干8小时后，于45℃热空气干热消毒箱内彻底烘干，烘干后的桑叶粉碎，过80目筛备用。

桑叶醇提物制备方法：提取步骤为：桑叶干粉加入乙醇回流提取，提取液减压蒸馏浓缩，经真空干燥后，可得桑叶醇提物。

优化后具体工艺为：溶剂为90％的乙醇，溶剂/原料＝13.7，提取温度为70℃，提取时间为3h。

桑叶水提物制备方法：提取步骤为：桑叶粉经热水提取后过滤，滤液减压浓缩后经体积浓度为10％三氯乙酸去除蛋白质，最后用乙醇醇析，即得到桑叶水提物。

优化后具体工艺为：溶剂为双蒸水，溶剂/原料＝25，提取温度为75℃，水浴浸提时间为90min，醇析乙醇浓度为85％。

实施例1

1.病毒滴度测定(TCID₅₀)

病毒滴度检测按照实验室常规方法进行，LMBV细胞悬液(用LMBV病毒按1:10 接种至细胞汇合度达80％的SCB3细胞中，每天观察细胞病变，至细胞病变达90％以上收取细胞，放-80℃冰箱，反复冻融三次，即得LMBV病毒细胞悬液)反复冻融3次后，10倍梯度稀释。SCB3(鳜脑细胞系SCB)细胞用胰酶消化后，按照1 ×10⁵/孔加入96孔板，25℃培养12h，而后加入100μL梯度稀释的LMBV细胞悬液，每个稀释梯度8个重复，并以正常细胞为阴性对照，连续观察5d。根据病变情况，按照寇氏法计算TCID₅₀(半数组织培养感染剂量)。

2.桑叶提取物安全浓度测定

最大安全浓度测定使用CCK8(Cell counting Kit-8)试剂盒进行，具体步骤按照说明书进行。

3.桑叶提取物对LMBV抑制作用测定

本实验用24孔细胞培养板进行，分药物孔和对照孔、空白孔和背景孔。药物孔和对照孔中的SCB3细胞长成单层后，吸弃培养基，每孔加入500μL病毒悬液(终浓度为100TCID₅₀)，25℃吸附1.5h，弃去病毒液，再向药物孔中每孔加入500μL 2倍最大安全浓度的桑叶提取物溶液，空白孔中只有单层细胞，背景孔中只加入病毒，每组做3孔重复，25℃培养，倒置显微镜下观察并记录每孔病变情况，并于48h收集每孔中的全部样品，对样品进行核酸提取，核酸提取后，用Q-PCR绝对定量的方法，测定每孔中的病毒拷贝数，并按照以下公式计算抑制率：

4.实验饲料

供试加州鲈基础饲料配方由广东省农业科学院动物科学研究所提供，该饲料以鱼粉、豆粕和菜籽粕为蛋白质源，高筋面粉为糖源，豆油和磷脂油为脂肪源。对照组和空白组饲喂基础饲料，试验组在基础饲料中添加终浓度为0.5％的桑叶水提物和桑叶醇提物。饲料原料经粉碎后过80目筛，微量成分采取逐级扩大法添加，桑叶黄酮先溶于水，然后混入各组饲料中。用混合机混合，混合均匀后，加适量水在搅拌机中搅拌均匀，用SLX-80型双螺杆挤压机(华南理工大学科技实业总厂生产)、G-500型造粒机(华南理工大学科技实业总厂生产)制成粒径为1.5和2.5mm两种颗粒饲料，55℃烘干，自然冷却后放入密封袋中，置于-20℃冰箱中保存备用。

5.实验鱼及饲养管理

大口黑鲈购买自罗非鱼良种场。驯养2周，每天分别在08:30和17:30饱饲投喂基础饲料2次。饲养试验在广东省农业科学院动物卫生研究所水产病害研究室室内循环水养殖系统中进行。系统由24个玻璃纤维桶和2个过滤池等部分组成，纤维桶容积为500L(直径1.2m，高1m，水体容积400L)，进水速率为2L/min，过滤池中铺有珊瑚石和活性炭。养殖水源为经砂滤、消毒后的自来水，水温27-30℃。养殖过程中不间断充氧曝气，溶解氧>7.0mg/L、PH 7.5-8.0，氨氮浓度<0.10mg/L，亚硝酸盐浓度<0.01mg/L。饲养总时间为29天。

6.试验设计

试验开始时，选取健康状况良好，初始平均体重为12±2g的大口黑鲈600 尾，随机分为4组，每组3个重复，每个重复50尾鱼，两个试验组分别为投喂添加质量浓度0.5％桑叶水提物的水提物组，和投喂添加质量浓度0.5％桑叶醇提物的醇提物组，对照组和空白组投喂加州鲈基础饲料。在试验的第15天，进行存活率统计，生长性能指标采集和测量，并对试验组和对照组LMBV攻毒，攻毒方式为腹腔注射，攻毒剂量为2×10⁵TCID₅₀(100μL)，空白组腹腔注射100μL PBS，所有组的鱼当天禁食。第16天恢复投喂，并观察记录死亡率，于攻毒后第3天，即试验第18天进行组织病理学和病毒含量测定样品采集。

7.样品采集

每组随机取5尾加州鲈，置于丁香酚中麻醉，测定体长、全长与体重，用解剖剪刀从肛门剪至腹部，取出内脏团迅速剥离肝脏、脾脏、肠道、头肾和性腺，称量内脏团重，肝脏重、脾脏重，肠道长度后，用PBS将组织冲洗干净，在肠道转弯处将肠道分为前肠、中肠和后肠。用于制作光镜切片的样品保存于4％的多聚甲醛中，用于核酸提取的组织放入-80℃冰箱备用。生长相关指标具体计算公式如下：

特定生长率(specific growth rate,SGR，％d)＝(ln末重(g)-ln初重 (g))/养殖天数(d)；

增重率(weight gain ratio,WGR,％)＝100×[终末平均体重(g)-初始平均体重(g)]/初始平均体重(g)；

饲料系数(feed conversion ratio，FCR,％)＝投饲总量(g)/[终末体重(g) -初始体重(g)]。

8.光镜切片的制作

将固定液中的组织块取出，用乙醇进行脱水，用二甲苯作为透明剂透明10 min，将已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织作为支持介质，将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织块便被蜡包埋，用切片机切片，厚度5-6μm。石蜡切片用二甲苯脱蜡处理2次后浸入各级酒精，逐步接近水。蒸馏水略洗，苏木素溶液染色约5-15min，自来水洗去多余染料。然后放入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无色为合适。分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色，然后用蒸馏水洗去碱性水分。用70％酒精和80％酒精各浸洗5min。伊红染液染色2min。以95％酒精对伊红分色，至胞浆和结缔组织等呈桃红色。再将染色后的切片经各级酒精逐步置换，最后用二甲苯透明化处理两次。取出切片，将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。

9.病毒含量测定

细胞破碎采取反复冻融方法进行，组织样品利用宁波新芝Scientz-48高通量组织研磨器匀浆，破碎后的细胞悬液和组织匀浆上清用核酸提取试剂盒和天隆全自动核酸提取仪进行核酸提取；使用Thermo Scientific^TMNanoDrop Lite分光光度计对所提取核酸进行核酸定量，以该核酸为模板，使用Bio-Rad CFX Connect荧光定量PCR仪及/>Universal SYBR qPCR Master Mix进行 qPCR绝对定量分析，引物为MRV63F 5’-TTGACAAAGCGCTGTACGGTGGA-3’(SEQ IN NO.1)，MRV213R 5’-TGAGCACATAGTCGCCCGACCTG-3’(SEQ IN NO.2)，将ct 值代入标准曲线中进行拷贝数计算，拷贝数单位为copies/ng(拷贝数/核酸质量)。

10.数据处理

数据分析采用SPSS 23统计软件进行，首先对试验数据进行方差齐性检验，若满足方差齐性，则分析方法为单因素方差分析(one-way ANOVA)，若不满足方差齐性，则采用Dunnett-T3检验法进行多重比较。试验数据以平均值±标准误的形式表示，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有极显著性差异。实验结果与分析：

1.饲料配方

表1饲料配方组成(干物质基础，％)

2.LMBV TCID50

通过试验测得LMBV滴度为10⁵TCID₅₀/ml。

3.两种桑叶提取物对SCB细胞的安全浓度

通过CCK8测得桑叶醇提取物对SCB3细胞的安全浓度都为50μg/ml，桑叶水提取物对SCB3细胞的安全浓度为1mg/ml。

4.生长性能指标

生长性能相关指标计算结果如图1所示。结果显示，在为期14天的加州鲈饲养期内，饲料中添加桑叶水提物组的饵料系数显著低于饲料中添加桑叶醇提物组(P<0.01)和投喂基础饲料的对照组(P<0.05)。饲料中添加桑叶水提物组的增重率和特定生长率也显著高于对照组(P<0.01)，但是，与饲料中添加桑叶醇提物组物显著性差异。醇提物组与对照组也无显著性差异。

5.攻毒保护实验

攻毒后存活率曲线如图2所示。攻毒后观察期为14天，到攻毒第14天，投喂基础饲料腹腔注射PBS的空白组，存活率为100％，投喂基础饲料腹腔注射 2×10⁵TCID₅₀ LMBV的对照组存活率为48.91％，投喂添加桑叶醇提取物饲料的醇提物组腹腔注射LMBV的存活率为68.63％，投喂添加桑叶水提取物饲料的水提物组腹腔注射LMBV的存活率为86.09％。利用GraphPad Prism对数据进行统计学分析，Logrank test for trend检验方法显示，水提物组跟对照组的存活率具有显著性(P<0.05)。水提物组的相对保护率(RPS)为72.77％，醇提物组的相对保护率为38.6％。

6.攻毒后的解剖学症状

大口黑鲈腹腔注射LMBV后，发病症状大多在攻毒后的第3天开始出现。发病时大口黑鲈体表没有肉眼可见的明显病状，但是可见体色发黑，腹部膨胀，部分鱼出现神经性症状，如失去平衡、打转。解剖后可见腹水，肝脏苍白，脾脏颜色亮红，有时可见脾脏肿大，肠道炎症明显，性腺出血。

7.病毒含量测定

7.1.前肠

前肠空白组样品中未检测到LMBV。前肠组织LMBV病毒含量如图3所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组前肠病毒拷贝数为5.03 ×10³copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，前肠病毒拷贝数为77.64copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，前肠病毒拷贝数为1.89×10³copies/ng。前肠中病毒含量对照组是醇提物组的65倍，是水提物组的2.66倍，对照组和两个试验组病毒拷贝数差异具有极显著性 (P<0.01)，水提物组和醇提物组之间的差异具有显著性(P<0.05)。

7.2.中肠

中肠空白组样品中未检测到LMBV。中肠组织LMBV病毒含量如图3所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组中肠病毒拷贝数为3.67 ×10⁴copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，中肠病毒拷贝数为46.45copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，中肠病毒拷贝数为1.31×10³copies/ng。中肠中病毒含量对照组是醇提物组的789.81 倍，是水提物组的28.1倍，水提物组和对照组以及醇提物组之间病毒拷贝数差异具有极显著性(P<0.01)。

7.3.后肠

后肠空白组样品中未检测到LMBV。后肠组织LMBV病毒含量如图3所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组后肠病毒拷贝数为1.07 ×10⁷copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，后肠病毒拷贝数为32.66copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，后肠病毒拷贝数为3.4×10³copies/ng。后肠中病毒含量对照组是醇提物组的32万倍，是水提物组的3157倍，对照组和醇提物组病毒拷贝数差异具有极显著性 (P<0.01)。

7.4.肝脏

肝脏空白组样品中未检测到LMBV。肝脏组织LMBV病毒含量如图4所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组肝脏病毒拷贝数为4.69 ×10⁴copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，肝脏病毒拷贝数为3.67copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，肝脏病毒拷贝数为1.05×10³copies/ng。肝脏中病毒含量对照组是醇提物组的12780倍，是水提物组的45倍，对照组和两个试验组病毒拷贝数差异具有显著性(P<0.05)。

7.5.肾脏

肾脏空白组样品中未检测到LMBV。肾脏组织LMBV病毒含量如图5所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组肾脏病毒拷贝数为4.44 ×10⁴copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，肾脏病毒拷贝数为4.96×10³copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，肾脏病毒拷贝数为5.73×10²copies/ng。肾脏中病毒含量对照组是醇提物组的9倍，是水提物组的77倍。

7.6.脾脏

脾脏空白组样品中未检测到LMBV。脾脏组织LMBV病毒含量如图5所示。投喂基础饲料腹腔注射2×10⁵TCID₅₀ LMBV第3天的对照组脾脏病毒拷贝数为4.2 ×10³copies/ng，饲料中添加桑叶醇提取物组腹腔注射LMBV后，脾脏病毒拷贝数为23copies/ng，饲料中添加桑叶水提取物组腹腔注射LMBV后，脾脏病毒拷贝数为868copies/ng。脾脏中病毒含量对照组是醇提物组的183倍，是水提物组的5倍，对照组和两个试验组病毒拷贝数差异具有极显著性(P<0.01)，水提物组和醇提物组之间的差异也具有极显著性(P<0.01)。

8.组织病理学结果

8.1.前肠

攻毒后，各试验组大口黑鲈前肠组织HE染色切片观察结果如图6所示。空白组前肠组织没有发生明显的病理损伤，肠道绒毛形态完整，肠上皮细胞排列整齐(图6中D、H)。投喂基础饲料LMBV攻毒的对照组，前肠绒毛严重断裂，脱落，几乎消失(图6中A)，上皮细胞受损严重，黏膜和黏膜下层严重浸润(图 6中E)；饲料中添加桑叶醇提物LMBV攻毒的醇提物组，前肠肠绒毛略微缩短，肠绒毛褶皱减少(图6中B、F)；饲料中添加桑叶水提物LMBV攻毒的水提物攻毒组前肠肠绒毛略微缩短(图6中C、G)。

8.2中肠

攻毒后，各试验组大口黑鲈中肠组织HE染色切片观察结果如图7所示。空白组中肠组织没有发生明显的病理损伤，肠道绒毛形态完整，肠上皮细胞排列整齐(图7中D、H)。对照组攻毒后，中肠肠绒毛严重断裂、脱落、几乎消失(图7中A)，上皮细胞受损严重，黏膜和黏膜下层炎症细胞严重浸润(图7中E)；醇提物攻毒组中肠肠绒毛略微缩短，肠绒毛褶皱减少(图7中B、F)；水提物攻毒组中肠肠绒毛略微缩短(图7中C、G)。

8.2.后肠

攻毒后，各试验组大口黑鲈后肠组织HE染色切片观察结果如图8所示。空白组中肠组织没有发生明显的病理损伤，肠道绒毛形态完整，肠上皮细胞排列整齐(图8中D、H)。投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组攻毒后，后肠肠绒毛严重断裂、脱落、几乎消失(图8中A)，上皮细胞受损严重(图8中E)；饲料中添加桑叶醇提物LMBV攻毒的醇提物组，后肠肠绒毛断裂，绒毛变短(图8中B、 F)。饲料中添加桑叶水提物LMBV攻毒的水提物组，后肠绒毛缩短，黏膜下层炎症细胞浸润(图8中C、G)。

8.3.脾脏

攻毒后，各试验组大口黑鲈脾脏组织的HE染色切片如图9所示。HE染色切片可以观察到脾脏组织中主要可见的血细胞。空白组中脾脏组织没有明显的病理变化，脾脏组织被膜完整，脾脏内细胞边缘清晰可见，排列整齐。投喂基础饲料攻毒LMBV的对照组脾脏40倍放大照片中发现脾脏被膜脱落，组织中出现明显的空洞，脾脏出血严重(图9中A)。饲料中添加桑叶水提物和醇提物后 LMBV攻毒的两组，40倍放大照片中也发现脾脏被膜脱落，组织中出现裂缝和空洞(图9中B、C)。

肠道和脾脏组织病理学分析显示，饲料中添加桑叶水提物或醇提物后，可以明显减轻攻毒后两个器官的症状。综上所述，饲料中添加桑叶提取物，可以有效提高加州鲈生长性能，提高加州鲈抗LMBV能力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.桑叶提取物在制备抗大口黑鲈病毒的制剂中的应用，所述桑叶提取物为桑叶干粉的水提取物，和/或乙醇提取物，所述制剂为添加所述桑叶提取物的加州鲈饲养饲料。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桑叶干粉的乙醇提取物的制备方法包括：在桑叶干粉中加入75-100%的乙醇回流提取，提取液减压蒸馏浓缩，经真空干燥后，可得桑叶醇提物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桑叶干粉的水提取物的制备方法包括：桑叶干粉中加入热水，水浴浸提后过滤，滤液减压浓缩后去除蛋白质，最后用乙醇醇析，即得到桑叶水提物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，水浴浸提的温度为60℃-85 ℃，水浴浸提时间为75 min -105 min；和/或水与桑叶干粉的重量比例为20-30：1。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用12%-15%三氯乙酸去除蛋白质；和/或以浓度为80%-90%的乙醇醇析。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述桑叶提取物的添加量为所述饲料的0.2-0.8wt%。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述桑叶提取物的添加量为所述饲料的0.4-0.6wt%。