CN115944611A

CN115944611A - 1-苯基-7-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-4-烯-3-庚酮的应用

Info

Publication number: CN115944611A
Application number: CN202310091393.0A
Authority: CN
Inventors: 曾祥周; 刘彩霞; 牛田琦; 熊军; 张小坡; 魏娜; 刘启兵; 王�华
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2023-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明涉及一种1‑苯基‑7‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑4‑烯‑3‑庚酮的应用，涉及生物医药领域。本发明提供了1‑苯基‑7‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑4‑烯‑3‑庚酮在制备破骨细胞分化抑制剂中的应用，1‑苯基‑7‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑4‑烯‑3‑庚酮的化学结构如式Ⅰ所示。1‑苯基‑7‑(4‑羟基‑3‑甲氧基苯基)‑4‑烯‑3‑庚酮(DPHB)对破骨细胞生成、破骨活性具有明显的抑制作用，使其可用于制备破骨细胞分化抑制剂，从而治疗相关骨性疾病。

Description

1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮的应用。

背景技术

在健康人体内，成骨细胞(Osteoblast,OB)和破骨细胞(Osteoclast,OC)处于一个相对平衡的状态，当破骨细胞的数量在人体内逐渐增多时，将会引起一系列骨破坏、骨损伤等相关疾病的发生。破骨细胞是一种多核巨细胞，它来源于单核-巨噬细胞系统，是人体内唯一具有骨质吸收作用的细胞，因此，破骨细胞是骨破坏疾病的标志性细胞。

破骨细胞主要负责骨吸收，并且许多都是以骨溶解为特征的病理状态的基础，近几十年来，我们对破骨细胞分化和激活在分子水平上的理解已经显著扩展。破骨细胞的分化和功能受损会导致骨和软骨的过度积累，以及破骨细胞活性的增加也会导致整体的骨丢失，这种情况在骨质疏松症中所常见。另外，骨吸收可能是具有局限性的，并且进一步破坏了正常的骨结构，比如类风湿性关节炎，骨质疏松等骨疾病。

破骨细胞靶向治疗在治疗骨过度吸收是一个关键病理过程的情况方面显示出了巨大的潜力。因此，破骨细胞靶向治疗正在用于类风湿性关节炎、牙周炎、骨肉瘤和骨巨细胞瘤的治疗。患有骨丢失相关疾病的患者发生骨折的风险更多。随着老年人口的迅速增加，因骨折住院的医疗费用已经成为了一个严重的社会问题。因此，药物抑制破骨细胞分化是减轻骨丢失相关疾病和相关骨折程度的一种治疗策略。大多数破骨细胞分化抑制剂还仍然处于发现阶段，需要其靶点分子机制进行对人体临床试验的验证，以进一步推进抗破骨细胞治疗药物的发展。

当前临床上最常用的破骨细胞抑制剂是双磷酸盐类药物，它主要用于治疗骨质疏松症、Paget’s病、多发性骨髓瘤、乳腺癌骨转移等一系列疾病。近年来，有关含氮双磷酸盐(帕米磷酸和唑来磷酸)相关性骨坏死的报道日渐增多，其对人体有一定的骨损伤以及身体产生了许多不良反应。除此之外，还有一种常见的破骨细胞抑制剂是RANKL抑制剂Denosumab(地诺单抗)，地诺单抗是一种很有前途的治疗骨骼性肿瘤的潜在药物。然而，此药物的临床使用受到与停药后反弹相关的持续安全问题的影响，特别是在儿童中。目前还无法了解地诺单抗治疗和停药对肿瘤复发的影响，并无法给通过手术治疗的患者制定长期治疗策略。所以临床上需要更多地研究一些安全有效、无并发症的破骨细胞分化抑制剂，这样不但能够促进骨损伤相关疾病的研究，也将进一步推动该类药物的临床发展，同样大大减少患者的痛苦，进而提升人们的生活质量。

发明内容

针对上述问题，本发明提供1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮在制备破骨细胞分化抑制剂中的应用，1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮(DPHB)对破骨细胞生成、破骨活性具有明显的抑制作用，使其可用于制备破骨细胞分化抑制剂，从而治疗相关骨性疾病。

为了达到上述目的，本发明提供了1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮在制备破骨细胞分化抑制剂中的应用，所述1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮的化学结构如式Ⅰ：

高良姜是姜科植物高良姜(Alpinia officinarum Hance)的干燥根茎，中医上常用于治疗散寒止痛、温中止呕等病症。高良姜中富含黄酮类、二苯基庚烷类、挥发油类等主要成分，其发挥着抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗炎镇痛等主要作用。高良姜醇提物以及高良姜素等单体化合物均有良好的抗炎效果，研究表明高良姜醇提物对2,4-二硝基苯酚、干酵母、内毒素导致的大鼠发热有解热作用，对二甲苯致小鼠耳肿胀有抑制作用。高良姜中二苯基庚烷类化合物为抗炎镇痛的主要成分，可抑制前列腺素合成酶系和磷脂酶A2活性，阻碍花生四烯酸代谢成PG，因此具有良好的抗炎作用。而1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮(DPHB)是高良姜提取物中的一种二芳基庚烷类化合物，同时也具有一定的抗炎作用。本发明人通过体外实验验证了1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮(DPHB)能够有效抑制破骨细胞的生成、分化，对于破骨细胞的骨吸收活性有抑制作用，可用于制备破骨细胞分化抑制剂。

在其中一个实施例中，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗破骨细胞性骨破坏疾病的药物。

在其中一个实施例中，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗炎症导致的骨质丢失的药物。

在其中一个实施例中，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗地诺单抗临床适应症的药物。

在其中一个实施例中，所述破骨细胞分化抑制剂为口服制剂或外用制剂。

在其中一个实施例中，所述破骨细胞分化抑制剂包括药物活性成分以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供了一种破骨细胞分化抑制剂，该破骨细胞分化抑制剂包括药物活性成分以及药学上可接受的辅料，所述药物活性成分为1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮。

在其中一个实施例中，所述辅料包括以下原料中的至少1种：赋形剂，润滑剂，抗氧剂，防腐剂，黏合剂，填充剂，或增稠剂。

在其中一个实施例中，所述药物活性成分的工作浓度为2μM-12μM。

所述工作浓度为上述药物活性成分在使用时能够达到预期效果的浓度，可以理解的，本领域技术人员在配制上述破骨细胞分化抑制剂时，可以配制浓度更高的母液或者储备液，待使用时再稀释，所述母液或者储备液及其浓度均在本发明的保护范围之内。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮在制备破骨细胞分化抑制剂中的应用，1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮(DPHB)对破骨细胞生成、破骨活性具有明显的抑制作用，使其可用于制备破骨细胞分化抑制剂，从而治疗相关骨性疾病。

附图说明

图1为实施例1中RAW264.7细胞孵育48h的细胞活率结果图；

图2为实施例1中RAW264.7细胞孵育96h的细胞活率结果图；

图3为实施例1中RAW264.7细胞孵育7d的细胞活率结果图；

图4为实施例1中BMMs细胞孵育96h的细胞活率结果图；

图5为实施例1中BMMs细胞孵育7d的细胞活率结果图；

图6为实施例2中阴性对照组(BLANK组)的TRAP染色结果图；

图7为实施例2中阳性对照组(RANKL组)的TRAP染色结果图；

图8为实施例2中药物组加入2.5μM DPHB的TRAP染色结果图；

图9为实施例2中药物组加入5μM DPHB的TRAP染色结果图；

图10为实施例2中药物组加入10μM DPHB的TRAP染色结果图；

图11为实施例2中阴性对照组、阳性对照组、分别加入2.5μM、5μM、10μM浓度DPHB的药物组的TRAP⁺多核细胞数量统计图；

图12为实施例3中阴性对照组(BLANK组)的TRAP染色结果图；

图13为实施例3中阳性对照组(RANKL组)的TRAP染色结果图；

图14为实施例3中药物组加入2.5μM DPHB的TRAP染色结果图；

图15为实施例3中药物组加入5μM DPHB的TRAP染色结果图；

图16为实施例3中药物组加入10μM DPHB的TRAP染色结果图；

图17为实施例3中阴性对照组、阳性对照组、分别加入2.5μM、5μM、10μM浓度DPHB的药物组的TRAP⁺多核细胞数量统计图；

图18为实施例4中阴性对照组(BLANK组)的光镜观察结果图；

图19为实施例4中阳性对照组(RANKL组)的光镜观察结果图；

图20为实施例4中药物组加入2.5μM DPHB的光镜观察结果图；

图21为实施例4中药物组加入5μM DPHB的光镜观察结果图；

图22为实施例4中药物组加入10μM DPHB的光镜观察结果图；

图23为实施例4中阴性对照组、阳性对照组、分别加入2.5μM、5μM、10μM浓度DPHB的药物组的骨吸收面积比统计图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

来源：

1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮(英文简称DPHB，购自四川省维克奇生物科技有限公司，CAS号为79559-60-7)。

本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规试验方法。

实施例1

DPHB对RAW264.7细胞和BMMs细胞的细胞生存作用。

一、实验操作。

取RAW264.7细胞和BMMs细胞2×10⁴或2×10³每孔种植于96孔板中，过夜后加入药物DPHB，浓度为2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM，每组3个副孔。分别孵育48h、96h、7d后，去上清，每孔加入1mg/ml的MTT 100μl，置37℃培养箱中孵育3到4h后，弃去上清液，加DMSO 150μl，振荡10分钟后，用酶标仪在490nm测定吸光度。

二、实验结果。

结果如图1、图2、图3、图4、图5所示，体外浓度≤10μM对RAW264.7细胞和BMMs细胞生存均无明显影响。

实施例2

DPHB对破骨前体RAW264.7细胞分化成破骨细胞的影响。

一、实验操作。

选用生长状态良好的RAW264.7细胞按l×10⁴/ml的细胞密度接种于96孔板，并加入含10％FBS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基100μl每孔，于37℃、5％CO₂培养箱孵育过夜。除阴性对照组(BLANK组)外，阳性对照组(RANKL组)及药物组均加RANKL，终浓度为100ng/ml，药物组同时加入DPHB浓度2.5μM、5μM、10μM，每组3个复孔。每2天换1次液，在诱导第4d时进行TRAP染色，并在显微镜下观察拍照。按TRAP阳性大于3个核的为破骨细胞进行计数(紫红色、多个细胞融合在一起的为破骨细胞)。

二、实验结果。

结果如图6、图7、图8、图9、图10、图11所示，结合实验例1的细胞生存实验结果，选2.5μM、5μM、10μM浓度的DPHB干预，发现DPHB能够显著抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成破骨细胞。因此，DPHB体外能有效抑制破骨细胞的生成。

实施例3

对小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)分化成破骨细胞的影响。

一、实验操作。

取12周的C57小鼠，眼球放血，脱颈处死，75％酒精浸泡15min，无菌条件下分离小鼠的股骨和胫骨，并在PBS液中将骨骺及表面软组织去除干净后剪去两端关节，再置于α-MEM(含10％FBS和1％双抗)培养基中，用1ml的注射器反复冲洗股骨、胫骨骨髓腔，将骨髓冲出，直至骨髓腔发白，于37℃、5％CO₂培养箱放置30分钟后收集上清悬液，并转移至T25培养瓶，加入5ng/ml M-CSF的培养基(总量为4ml)培养24h，收集未贴壁细胞，即为小鼠骨髓干细胞。将收集的细胞离心(800r，5min)，细胞按1×10⁵/ml密度接种于96孔板，除阴性对照组(BLANK组)外，阳性对照组(RANKL组)及药物组均加RANKL，终浓度均为50ng/ml，药物组同时加DPHB浓度2.5μM、5μM、10μM，每组3个复孔。每2天换液1次，在诱导第4d进行TRAP染色，在显微镜下观察拍照，并按TRAP阳性并且大于3个核的为破骨细胞进行计数(紫红色、多个细胞融合在一起的为破骨细胞)。

二、实验结果。

结果如图12、13、14、15、16、17所示，结合实验例1的细胞生存实验结果，选2.5μM、5μM、10μM浓度的DPHB干预，发现DPHB能够显著抑制体外RANKL诱导BMMs细胞形成破骨细胞。因此，DPHB体外能有效抑制破骨细胞的生成。

实施例4

对破骨细胞破骨活性的影响。

一、实验操作。

同上述实验例3中破骨细胞生成实验方案，接种BMMs细胞于包被有人工骨片的

Osteo Assay 96孔板培养，于诱导第7天洗去细胞，在40X倒置光学显微镜光镜观察拍照，通过Image-J软件计算每孔中骨吸收面积百分比。

二、实验结果。

结果如图18、19、20、21、22、23所示，实验结果证明浓度2.5μM、5μM、10μM浓度的DPHB能显著降低破骨细胞在骨片上形成的骨凹陷面积，对于破骨细胞的骨吸收活性有抑制作用。

结合上述实施例的实验结果，从高良姜中分离得到的DPHB能够显著抑制体外RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7细胞和BMMs细胞形成破骨细胞，从而直接抑制破骨细胞的分化形成以及破骨细胞骨吸收功能。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮在制备破骨细胞分化抑制剂中的应用，所述1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮的化学结构如式Ⅰ：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗破骨细胞性骨破坏疾病的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗炎症导致的骨质丢失的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂为用于治疗地诺单抗临床适应症的药物。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂为口服制剂或外用制剂。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂包括药物活性成分以及药学上可接受的辅料。

7.一种破骨细胞分化抑制剂，其特征在于，该破骨细胞分化抑制剂包括药物活性成分以及药学上可接受的辅料，所述药物活性成分为1-苯基-7-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-4-烯-3-庚酮。

8.根据权利要求7所述的破骨细胞分化抑制剂，其特征在于，所述辅料包括以下原料中的至少1种：赋形剂，润滑剂，抗氧剂，防腐剂，黏合剂，填充剂，或增稠剂。

9.根据权利要求7所述的破骨细胞分化抑制剂，其特征在于，所述破骨细胞分化抑制剂为口服制剂或外用制剂。

10.根据权利要求7所述的破骨细胞分化抑制剂，其特征在于，所述药物活性成分的工作浓度为2μM-12μM。