CN115944594A - 可载免疫抑制剂的透明质酸明胶复合微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可载免疫抑制剂的透明质酸明胶复合微球的制备方法，包括初级交联透明质酸并将交联度控制在3％‑15％范围内，纯化后得到初级交联透明质酸，在非均相体系中将初级交联透明质酸和明胶进行次级交联得到次级交联微球，将次级交联微球在均相体系中进行终级交联。本发明通过三级交联技术制得具有互锁结构的透明质酸/明胶复合微球，大大延长降解时间、增强机械性能、快速高效装载单抗免疫抑制剂的药物，可用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等领域。

Description

可载免疫抑制剂的透明质酸明胶复合微球的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用高分子材料技术领域，具体涉及一种可装载单抗免疫抑制剂的透明质酸/明胶互锁结构复合微球的制备方法。

背景技术

生物可降解微球作为一种尺寸可调控、生物可降解、化学性能可修饰的新型材料，在生物医药和组织工程等领域得到了广泛关注，如肿瘤介入治疗用栓塞剂、软组织填充、组织缺损修补和药物载体等。这些应用需要微球具有较长的降解时间，良好的机械性能，并能装载多种类型药物以适应不同的治疗进程。

透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一种以N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡糖醛酸为组成单位的线性多糖，具有良好的生物相容性、生物降解性、无免疫原性、无毒等优点。但是由于体内广泛存在的酶可使HA快速降解吸收，且单独使用HA机械性能较差。单纯交联HA可以一定程度上改善HA的降解稳定性和机械性能，如医美填充材料，但仍存在降解较快的缺点。

明胶是由动物的皮、骨、腱与韧带中胶原蛋白不完全酸水解、碱水解或酶降解后纯化得到的制品，或为上述不同明胶制品的混合物，具有良好的生物相容性和生物降解性，但是机械性能差、体内易降解。单纯交联明胶同样可以一定程度改善体内稳定性，但是作用甚微。市售交联后的明胶类止血剂、栓塞剂在体内也只能维持不到一周的时间。

以复合材料为基质的微球，可以调控出多种空间结构的微球。CN103816573A公开了一种多孔明胶/透明质酸复合微球的制备方法，该方法将透明质酸和明胶混合制成水相，在油相中乳化交联后的微球经冻干得到表面多孔的微球。该方法制得的微球，仅在油相中加入交联剂进行乳化交联，该方法对明胶有一定的交联作用，对HA交联效率较低，又由于是多孔结构，在体内各种酶迅速渗入为求内部，HA快速降解，微球内外部结构和机械强度快速瓦解。CN103181902A公开了一种双层胶原/透明质酸复合微球的制备方法，该方法先制备辐射交联胶原微球，再将该胶原微球加入一次交联的HA凝胶中，进行二次交联形成双层凝胶，破碎后得到双层胶原/透明质酸复合微球。该方法制得的微球双层结构导致微球内外机械性能不均一，不适用于对机械性能要求较高的填充和栓塞等应用领域，且外层为单纯的交联HA，体内降解较快。此外，以上复合材料微球未涉及载药功能。

免疫检查点抑制剂已成为恶性肿瘤非常重要的治疗手段，但是免疫疗法也对人体大部分器官系统产生炎症毒性，并且其内分泌系统不良反应也逐渐显现。目前PD-1单抗和PD-L1单抗均为全身给药，如果能实现局部靶向给药，将大大降低全身毒副作用。目前尚未有可以装载PD-1单抗和PD-L1单抗的栓塞微球报道。

发明内容

针对上述复合微球降解快、机械强度有限、不能载单抗药物等技术问题，本发明提供了一种可装载单抗免疫抑制剂的透明质酸/明胶互锁结构复合微球的制备方法，通过三级交联的制备方法，构建了一种透明质酸/明胶互锁结构的复合微球，在每一级交联质量可控的同时，大大延长微球降解时间、增加机械性能，并且可以装载单抗药物，可以用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等领域。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种可载免疫抑制剂的透明质酸明胶复合微球的制备方法，该方法包括初级交联透明质酸并将交联度控制在3％-5％范围内，纯化后得到初级交联透明质酸，在非均相体系中将初级交联透明质酸和明胶进行次级交联得到次级交联微球，将次级交联微球在均相体系中进行终级交联。

上述初级交联透明质酸步骤如下：将透明质酸或其盐、碱、交联剂A和水混合分散均匀得到混合溶液，在温度28-50℃下反应1-5h进行初级交联，调节pH6.0-8.0、纯化，洗涤，干燥，得初级交联的透明质酸。该步骤中采用的先初级交联透明质酸的方式，可将交联度控制在一定范围内。

优选地，透明质酸或其盐在混合溶液中的浓度为3.0wt％-10.0wt％。

优选地，交联剂A为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜中的一种或几种，进一步优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；所述的交联剂A在混合溶液中浓度0.3wt％-1.0wt％。

本发明采用先初级交联透明质酸的方式，通过控制交联反应的浓度、温度和时间，控制透明质酸的交联度，防止交联度过高，否则容易导致后续不能和明胶均匀共混制备水相；若交联度过低，易导致最终微球降解过快。

优选地，所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠中的一种或多种；

优选地，所述的碱浓度为0.3wt％-2.0wt％，所述的碱和交联剂A质量比为1：1-2：1。

所述的纯化步骤包括：将pH稳定的反应液用有机溶剂进行沉淀，静置后过滤，将沉淀用有机溶剂或有机溶液与水混合溶液反复清洗，如采用95％乙醇、无水乙醇等。

所述的后处理洗涤干燥可以采用现有技术中报道的一些方式，例如真空干燥、冷冻干燥或加热干燥，粉碎等。

本发明在上述步骤制得的初级交联透明质酸，可将交联度控制在一定范围内，保留透明质酸的全部羧基不被占用，预留部分在初级交联时未交联的羟基，作为后续与交联明胶结构互锁的反应基团。此外，不在球体中实现透明质酸的初级交联，而是在成球前进行初级交联及纯化，防止成球后再对透明质酸进行交联，导致透明质酸的初级交联剂不易除净，有利于控制交联度和杂质残留，实现微球的质量可控、提高生物安全性。

上述次级交联是由上述的初级交联透明质酸，作为一种载药材料，和明胶基质混合，制备一种可载药的微球。具体步骤如下：将初级交联的透明质酸、明胶和水混合分散均匀，得到水相；将水相加入含有乳化剂的油相中，充分乳化得到非均相体系，再加入交联剂B，在50-80℃温度下反应1-3h进行次级交联，交联后去除油相，洗涤干燥得到次级交联微球。

优选地，所述的乳化剂为司盘类或司盘类与吐温类的混合物中的一种或几种，优选为司盘80。

优选地，所述的乳化剂用量为油相：乳化剂的体积比为400:1-200:1。

优选地，水相和油相混合的重量比例是1：6-1：3。

优选地，所述的初级交联透明质酸与明胶质量比为2：5-3：2，初级交联透明质酸和明胶混配得到的混合胶在水相中浓度为6wt％-13wt％。

优选地，所述的交联剂B为戊二醛、京尼平、碳二亚胺类交联剂中的一种或几种，进一步优选为戊二醛；所述的交联剂B在非均相体系的浓度为0.3wt％-1.2wt％。本发明采用在非均相体系中次级交联微球的方式，通过控制交联剂B与初级交联透明质酸、明胶比例、反应温度和时间，对初级交联透明质酸和明胶进行交联形成弱的互锁网络，塑形球体结构。

在上述次级交联步骤中，可以根据微球粒径需要，选择乳化剂种类、比例、剪切乳化速率，去除油相可以采用离心、洗涤、干燥等常规方法。在上述次级交联步骤的处方和工艺参数范围下制得的次级交联微球，交联剂B能与明胶的氨基以及初级交联透明质酸剩余羟基反应，形成稳定的互锁结构，稳定球体形态、显著增加微球的机械性能和延长降解时间。

上述终级交联步骤是将次级交联微球在含有交联剂C的均相体系中进行终级交联，除去交联剂C，洗涤干燥得到终级交联微球；其中，上述进行终级交联中，次级交联微球在均相体系中浓度为1.0wt％-5.0wt％。

优选地，所述的交联剂C为戊二醛、京尼平、碳二亚胺类交联剂中的一种或几种，进一步优选为戊二醛。

1.优选地，所述的均相体系为甲醇、乙醇、异丙醇、水中的一种或几种混合的均一体系；所述的交联剂C在均相体系的比例为1.0wt％-8.0wt％；反应温度30-60℃；反应时间1-3天。

终级交联中采用在均相体系中终级交联微球的方式，交联剂C的种类、反应的浓度、温度、时间，对弱的互锁结构的微球进行强互锁交联，进一步加固球体结构。

在终级交联的处方和工艺中，除去交联剂，可以采用现有技术中报道的方式，如，氨基酸、亚硫酸(氢)盐中的一种或几种等除醛、洗涤；洗涤可以采用现有技术中报道的一些方式，如，有机溶剂、水或两者一定比例混合物反复清洗；干燥可以采用现有技术中报道的一些方式，例如真空干燥、冷冻干燥或加热干燥等。

在上述终级交联步骤的处方和工艺参数范围下制得的终级交联微球，交联剂C能够与次级交联微球中剩余明胶的氨基以及交联透明质酸剩余羟基反应，形成牢固的互锁结构，大大增加机械性能和显著延长降解时间。

上述透明质酸明胶复合微球可在介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体中应用。

本发明方法具体包括以下步骤：

(1)将透明质酸或其盐、碱、交联剂A和水混合分散均匀，在交联温度下进行初级交联，调节反应液pH、纯化，洗涤干燥得初级交联的透明质酸；

(2)将初级交联的透明质酸、明胶、水混合分散均匀，得到水相，将水相加入含有乳化剂的油相中，充分乳化，加入交联剂B，在水相、油相乳化剂组成的非均相体系中进行次级交联，交联后去除油相，洗涤干燥得到次级交联微球；

(3)将次级交联微球在含有交联剂C的均相体系中进行终级交联，除去交联剂，洗涤干燥得到终级交联微球。

本发明通过三级交联技术制得具有互锁结构的透明质酸/明胶复合微球，可以大大延长降解时间、显著提高微球的抗降解性能、增强机械性能、快速高效装载单抗免疫抑制剂的药物，可以用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等领域。

与现有技术比较本发明具有以下优势：

1.本发明采用三级交联的方式制备微球，首先进行透明质酸的初级交联，为后续互锁结构预留一定的羟基基团；其次，在非均相体系中次级交联微球的方式，对初级交联透明质酸和明胶进行次级交联形成弱的互锁网络，一定程度上增加微球的机械性能和延长降解时间；最后，以在均相体系中终级交联微球的方式，对弱互锁结构的微球进行强互锁交联，进一步加固球体结构。最终形成一种透明质酸/明胶互锁的牢固结构复合微球，大大延长微球降解时间、增加机械性能。

2.由于成球后再对球体内部的交联剂A进行清除，会导致残留量过高，生物安全性大大降低。本发明在成球前进行透明质酸的初级交联及纯化，有利于控制交联度和杂质残留，实现最终微球的质量可控、提高生物安全性。

3.本发明在上述3个步骤下制备的微球，充分保留了透明质酸的羧基，可以通过羧基与药物的氢键作用装载单抗药物，同时兼具优良的抗降解性能和机械性能，可以用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等领域。

附图说明

图1为实施例1得到的次级和终级交联微球内部交联互锁结构显微结构扫描电子显微镜照片。图中，左侧为次级交联微球，右侧为终级交联微球。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明。

实施例1

(1)将0.2g1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入20ml，2.0％氢氧化钠溶液中与2.0g的透明质酸(HA)混合溶液中，200rpm搅拌，35℃加热反应2h后，用0.1M的盐酸水溶液中和反应至pH7.0。加入5倍体积的无水乙醇沉淀去除氯化钠、未反应的小分子透明质酸和残留1,4-丁二醇二缩水甘油醚等杂质，静置20min后过滤，将固体部分持续用95％乙醇反复清洗，再用无水乙醇除去多余水分，50℃干燥6h后去除残留乙醇和结合水，得到初级交联的透明质酸。

(2)称取1.0g初级交联的透明质酸和2.5g明胶，与27ml水混合，55℃加热搅拌，溶解后制成水相；将80ml液体石蜡与0.2ml司班80混合，55℃下加热搅拌均匀，即得油相。将上述水相与油相混合，在机械搅拌速率400rpm下乳化30min，乳液在搅拌过程中冷却至室温，随后加入0.32g戊二醛，反应2h。过滤后，用30ml石油醚分3次洗去微球表面液体石蜡，再用适量无水乙醇去除残留有机溶剂和微球表面水分，得到次级交联微球。

(3)称取约1.0g次级交联微球，加入80％甲醇溶液50ml和0.5g戊二醛，在30℃下进行终级交联3天。微球用适量80％甲醇洗涤，加入80％甲醇溶液50ml和1.0g甘氨酸除醛12h，微球用适量95％甲醇洗涤除水后，真空干燥18h，即得透明质酸/明胶互锁结构复合微球。

实施例2

(1)将0.18g二乙烯基砜加入60ml 0.3％氢氧化钾溶液中与1.8g的透明质酸(HA)混合溶液中，120rpm搅拌，50℃加热反应1h后，用0.1M的盐酸水溶液中和反应至pH6.0。加入3倍体积的无水乙醇沉淀去除氯化钠、未反应的小分子透明质酸和残留1,4-丁二醇二缩水甘油醚等杂质，静置30min后过滤，将固体部分持续用95％乙醇反复清洗，再用无水乙醇除去多余水分，60℃干燥3h后去除残留乙醇和结合水，得到初级交联的透明质酸。

(2)称取1.0g初级交联的透明质酸和1.0g明胶，与33ml水混合，60℃加热搅拌，溶解后制成水相；将80ml液体石蜡与0.3ml司班60混合，55℃下加热搅拌均匀，即得油相。将上述水相与油相混合，在机械搅拌速率300rpm下乳化40min，乳液在搅拌过程中冷却至室温，随后加入0.9g戊二醛，反应1h。过滤后，用50ml异丙醇分3次洗去微球表面液体石蜡，再用适量无水乙醇去除残留有机溶剂和微球表面水分，得到次级交联微球。

(3)称取约0.5g次级交联微球，加入无水乙醇50ml和2.0g京尼平，在50℃下进行终级交联2天。微球用适量无水乙醇洗涤，加入80％乙醇溶液50ml和0.5g亚硫酸氢钠除醛10h，微球用适量无水乙醇洗涤除水后，真空干燥24h，即得透明质酸/明胶互锁结构复合微球。

实施例3

(1)将0.28g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入40ml 1.0％碳酸钠溶液中与2.0g的透明质酸(HA)混合溶液中，300rpm搅拌，28℃加热反应5h后，用0.1M的盐酸水溶液中和反应至pH8.0。加入4倍体积的无水乙醇沉淀去除氯化钠、未反应的小分子透明质酸和残留1,4-丁二醇二缩水甘油醚等杂质，静置40min后过滤，将固体部分持续用95％乙醇反复清洗，再用无水乙醇除去多余水分，40℃干燥12h后去除残留乙醇和结合水，得到初级交联的透明质酸。

(2)称取1.5g初级交联的透明质酸和1.0g明胶，与25ml水混合，65℃加热搅拌，溶解后制成水相；将80ml液体石蜡与0.2ml司班80和吐温80的2：1混合溶液，55℃下加热搅拌均匀，即得油相。将上述水相与油相混合，在机械搅拌速率200rpm下乳化60min，乳液在搅拌过程中冷却至室温，随后加入1.26g戊二醛，反应3h。过滤后，用60ml无水乙醇分3次洗去微球表面液体石蜡，再用适量无水乙醇去除残留有机溶剂和微球表面水分，得到次级交联微球。

(3)称取约2.5g次级交联微球，加入90％异丙醇溶液50ml4.0g碳二亚胺类交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，在60℃下进行终级交联1天。微球用适量90％异丙醇洗涤除水后，加入80％异丙醇溶液50ml和1.5g亚硫酸钠除醛24h，微球用适量95％异丙醇洗涤除水后，真空干燥24h，即得透明质酸/明胶互锁结构复合微球。

实施例4不同分级交联微球内部显微结构观察不同分级交联微球内部交联互锁结构显微观察。

次级交联微球制备：按实施例1步骤(1)(2)制备。

终级交联微球制备：按实施例1步骤(1)(2)(3)制备。

取上述次级交联微球和终级交联微球，研碎，进行扫描电子显微镜观察微球内部交联形态，见图1。结果显示，在非均相体系中交联得到的次级交联微球，交联度较低，只能形成疏松的互锁网络结构，再经均相体系中终级交联的微球，可以形成牢固致密的结构，在已有的初级交联透明质酸的网络结构中，进一步充分交联明胶氨基和初级交联透明质酸的羟基，形成牢固的互锁结构，为抗降解性能打下坚实的基础。

实施例5不同分级交联微球交联度测定

分别取实施例1步骤(1)、实施例2步骤(1)、实施例3步骤(1)、对比例1步骤(1)、对比例2步骤(1)初级交联透明质酸各5.0mg，溶于0.6ml D₂O中。将溶液转移至核磁管中，进行1D NMR光谱分析，通过来自透明质酸交联剂残基1.6ppm和双糖单位上N-乙酰基2.0ppm处的化学位移确定交联度。积分后按如下公式计算：

MoD(％)＝(1^δ1.6/4)/(1^δ2.0/3)×100％

结果显示，实施例1步骤(1)、实施例2步骤(1)、实施例3步骤(1)、对比例1步骤(1)、对比例2步骤(1)初级交联透明质酸的交联度分别为15％、3％、9％、1％、18％。

实施例6不同分级交联微球体外、体内降解时间测定

初级交联微球制备：按实施例1步骤(1)(2)制备，除不加戊二醛外，其余相同。

次级交联微球制备：按实施例1步骤(1)(2)制备。

终级交联微球A制备：按实施例1步骤(1)(2)(3)制备。

终级交联微球B制备：按实施例2步骤(1)(2)(3)制备。

终级交联微球C制备：按实施例3步骤(1)(2)(3)制备。

终级交联微球D制备：按对比例1步骤(1)(2)(3)制备。

体外降解时间测定：参照ISO 13781：1997的标准，制备Sorensen缓冲液，pH值为7.4±0.2。样品按浸提比例30∶1(ml∶g)与Sorensen缓冲液混合，于37℃放置数天，每日观察，记录微球完全降解时间。结果见表1。

体内降解时间测定：90只SD大鼠随机分为6组，每组15只。麻醉后，分别肌肉埋植5种不同分级交联微球。分别于术后1、2、4、7、8周任选3只实验动物处死，取埋植点组织，进行大体标本观察及组织学检查。结果见表1。

表1不同分级交联微球体外、体内降解时间

结果显示，采用分级交联的方式制备微球，与常见的单纯交联透明质酸微球、交联透明质酸加乳化交联明胶微球相比，三级交联后具有牢固互锁结构的透明质酸/明胶复合微球在体内外降解时间均大大延长，可以用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等需要较长体内停留时间的应用领域。初级交联透明质酸的交联度在3％-15％范围内的微球A、B、C，在体内外降解时间均符合上述临床应用要求，但是初级交联透明质酸的交联度为1％的微球D，体内外降解时间均过短，不适宜做上述方面的临床应用。

实施例7不同分级交联微球机械性能测定

不同分级交联微球制备方法同实施例5。

采用质构仪，分别压缩不同分级交联微球直径的30％、50％、80％，维持10s，移除感应力后，在显微镜下观察微球形状及破损情况，计算压缩破损率。

压缩破损率计算公式：压缩破损率＝破损微球个数/总测试微球个数×100％。结果见表2。

表2不同分级交联微球机械性能测定结果(n＝10)

结果显示，采用分级交联的方式制备微球，与常见的单纯交联透明质酸微球、交联透明质酸加乳化交联明胶微球相比，三级交联后具有牢固互锁结构的透明质酸/明胶复合微球的机械性能均大大提高，可以用于介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体等需要较长体内停留时间的应用领域。

实施例8微球装载单抗免疫抑制剂药物的载药量测定

分别将实施例1、2、3制备的终级交联微球分别浸泡10ml 10mg/ml PD-1单抗抑制剂重组全人源抗程序性死亡受体1单克隆抗体(信迪利单抗注射液)、1ml200mg/ml PD-L1/CTLA-4双特异性药物重组人源化PD-L1单域抗体Fc融合蛋白溶液(恩沃利单抗注射液)中，10min后吸取浸泡上清液，并清洗微球3次，合并上清液和清洗液，定容，通过紫外分光光度法在对应吸收波长下测定浸泡液中药物的浓度，根据体积和稀释倍数计算浸泡液药量。

载药量计算公式：载药量＝(总药量-浸泡液药量)/总药量×100％。

结果见表3。

表3微球装载单抗免疫抑制剂药物的载药量测定结果

结果显示，实施例1、2、3微球充分保留了透明质酸的羧基，可以通过羧基与药物较强的氢键作用装载单抗药物，载药量大，最高可达99.8％，说明本发明涉及方法制备的微球具有优良的装载单抗免疫抑制剂性能。

对比例1

(1)将0.04g1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入20ml1.6％氢氧化钠溶液中与2.0g的透明质酸(HA)混合溶液中，200rpm搅拌，35℃加热反应2h后，用0.1M的盐酸水溶液中和反应至pH7.0。加入5倍体积的无水乙醇沉淀去除氯化钠、未反应的小分子透明质酸和残留1,4-丁二醇二缩水甘油醚等杂质，静置20min后过滤，将固体部分持续用95％乙醇反复清洗，再用无水乙醇除去多余水分，50℃干燥6h后去除残留乙醇和结合水，得到初级交联的透明质酸。

(2)称取1.0g初级交联的透明质酸和2.5g明胶，与27ml水混合，55℃加热搅拌，溶解后制成水相；将80ml液体石蜡与0.2ml司班80混合，55℃下加热搅拌均匀，即得油相。将上述水相与油相混合，在机械搅拌速率400rpm下乳化30min，乳液在搅拌过程中冷却至室温，随后加入0.32g戊二醛，反应2h。过滤后，用30ml石油醚分3次洗去微球表面液体石蜡，再用适量无水乙醇去除残留有机溶剂和微球表面水分，得到次级交联微球。

(3)称取约1.0g次级交联微球，加入80％甲醇溶液50ml和0.5g戊二醛，在30℃下进行终级交联3天。微球用适量80％甲醇洗涤，加入80％甲醇溶液50ml和1.0g甘氨酸除醛12h，微球用适量95％甲醇洗涤除水后，真空干燥18h，即得透明质酸/明胶互锁结构复合微球。

对比例2

(1)将0.3g1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入20ml1.6％氢氧化钠溶液中与2.0g的透明质酸(HA)混合溶液中，200rpm搅拌，50℃加热反应2h后，用0.1M的盐酸水溶液中和反应至pH7.0。加入5倍体积的无水乙醇沉淀去除氯化钠、未反应的小分子透明质酸和残留1,4-丁二醇二缩水甘油醚等杂质，静置20min后过滤，将固体部分持续用95％乙醇反复清洗，再用无水乙醇除去多余水分，50℃干燥6h后去除残留乙醇和结合水，得到初级交联的透明质酸。

(2)初级交联透明质酸不溶于水，无法制备水相。

Claims (10)

1.可载免疫抑制剂的透明质酸明胶复合微球的制备方法，其特征在于，该方法包括初级交联透明质酸并将交联度控制在3％-15％范围内，纯化后得到初级交联透明质酸，在非均相体系中将初级交联透明质酸和明胶进行次级交联得到次级交联微球，将次级交联微球在均相体系中进行终级交联。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述初级交联透明质酸步骤如下：将透明质酸或其盐、碱、交联剂A和水混合分散均匀得到混合溶液，在温度28-50℃下反应1-5h进行初级交联，调节pH6.0-8.0、纯化，洗涤，干燥，得初级交联的透明质酸。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸或其盐在混合溶液中的浓度为3.0wt％-10.0wt％。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂A为1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜中的一种或几种；所述的交联剂A在混合溶液中浓度0.3wt％-1.0wt％；所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾和碳酸钠中的一种或多种，所述的碱浓度为0.3wt％-2.0wt％，所述的碱和交联剂A质量比为1：1-2：1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的次级交联是将初级交联的透明质酸、明胶和水混合分散均匀，得到水相；将水相加入含有乳化剂的油相中，充分乳化得到非均相体系，再加入交联剂B，在50-80℃温度下，反应1-3h进行次级交联，交联后去除油相，洗涤干燥得到次级交联微球。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的初级交联透明质酸与明胶质量比为2：5-3：2，初级交联透明质酸和明胶混配得到的混合胶在水相中浓度为6wt％-13wt％。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂B为戊二醛、京尼平、碳二亚胺类交联剂中的一种或几种，优选为戊二醛；所述的交联剂B在非均相体系的浓度为0.3wt％-1.2wt％。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的终级交联步骤是将次级交联微球在含有交联剂C的均相体系中进行终级交联，除去交联剂C，洗涤干燥得到终级交联微球；其中，进行终级交联中，次级交联微球在均相体系中比例为1.0wt％-5.0wt％。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的交联剂C为戊二醛、京尼平、碳二亚胺类交联剂中的一种或几种，优选为戊二醛；所述的均相体系为甲醇、乙醇、异丙醇、水中的一种或几种混合的均一体系；所述的交联剂C在均相体系的比例为1.0wt％-8.0wt％。

10.一种利用权利要求1所述的方法制备得到的透明质酸明胶复合微球在介入栓塞、医美填充、组织缺损修补和药物载体中的应用。

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