CN115943957B

CN115943957B - Tbfc在制备防治细菌性病害的药物中的应用

Info

Publication number: CN115943957B
Application number: CN202210839547.5A
Authority: CN
Inventors: 黄迎春
Original assignee: Beijing Jingji Zhihui Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Jingji Zhihui Technology Co ltd
Priority date: 2022-07-18
Filing date: 2022-07-18
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2042-07-18
Also published as: CN115943957A

Abstract

本发明提供TBFC作为防治细菌性病害的药物的应用，可抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌引起的植物性病害，如土壤杆菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、韧皮部杆菌属、链丝菌属，嗜酸菌属、根杆菌属、根单胞菌属、嗜木质菌属、泛生菌属、木质部小菌属、棒形杆菌属、节杆菌属、短小杆菌属、红球菌属、芽孢杆菌属或布克氏菌属细菌。本发明提供的TBFC不仅仅对多种细菌性病害有效，而且使用剂量低，属于新型的绿色农药。

Description

TBFC在制备防治细菌性病害的药物中的应用

技术领域

本发明涉及农药领域，涉及一种农业杀菌剂的应用，具体涉及TBFC在制备防治细菌性病害的药物中的应用。

背景技术

植物细菌性病害是指细菌侵入植株的体内之后大量繁殖，导致植株感病。细菌引起的植物病害，影响范围较广，严重威胁着世界范围内农作物的产量和质量，已成为农业生产中急需解决的重要问题之一。常见的细菌性病害主要有水稻白叶枯病、细菌性叶斑病、烟草青枯病、柑橘溃疡病、柑橘黄龙病、蔬菜软腐病。水稻白叶枯病可能发生在水稻生长的任何时期，会导致水稻大幅减产，最高可达80％；水稻细菌性条斑病又称细条病或者条斑病，最开始的时候出现暗绿色水浸状小斑，很快在叶脉间扩展为黄褐色的细条斑，病斑两端呈浸润型绿色，一般会导致水稻减产15～25％，严重时可达60％；烟草青枯病是通过土传病原菌获得的，会出现典型的烟叶黄化、萎蔫现象，是烟叶种植过程中的巨大阻碍；柑橘细菌性溃疡病是一种极其持久的疾病，可对柑橘树的叶、茎和果实造成损害，从而导致柑橘大量减产；柑橘黄龙病对柑桔质量和产量造成极大危害，甚至造成柑橘树枯死，已经给我国柑桔产业造成死树毁园的致命打击。由欧氏杆菌属细菌引起的蔬寀软腐病，可使植物的组织或器官发生腐烂。主要危害植物多汁肥厚的器官，如块根、块茎、果实、茎基等。发病不限于田间，运输途中和贮藏期间也有发生，且为害更重。危害的作物种类很多：甘蓝类、白菜类、胡萝卜、马铃薯、番茄、辣椒、大葱、洋葱、芹菜、莴苣等蔬菜。病害病部潮湿腐烂且有恶臭味。

在过去十年中，抗生素疗法在农业中取得了显著的成果，但农业生产仍然被细菌性病害所阻碍。并且因为长期使用传统抗生素，越来越多的细菌出现了多药耐药的现象，有证据表明，一旦出现耐药的菌种，短时间内就会发生耐药性的大规模爆发，因此提出绿色农药的开发。绿色农药的开发可以促进农药的绿色化发展，可以提升农药的利用率，从而减少农药的利用率，确保我国粮食安全与食品安全。

因此，筛选出能够有效抑制植物细菌性病害又不会造成耐药的药物成为亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供TBFC作为防治细菌性病害中的应用，该TBFC可以对多种植物细菌性病害产生有效的抑制作用，可作为植物细菌性病害的预防或治疗药剂。

为了实现上述目的，本发明提供TBFC作为防治细菌性病害中的应用。

优选地，所述细菌性病害为植物细菌性病害。

更进一步地，所述细菌性病害为革兰氏阴性菌引起的病害。

优选地，所述革兰氏阴性菌为土壤杆菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、韧皮部杆菌属、链丝菌属，嗜酸菌属、根杆菌属、根单胞菌属、嗜木质菌属、泛生菌属或木质部小菌属细菌。

更进一步地，所述细菌性病害为革兰氏阳性菌引起的病害。

优选地，所述革兰氏阳性菌为棒形杆菌属、节杆菌属、短小杆菌属、红球菌属、芽孢杆菌属、布克氏菌属细菌。

更进一步地，当溶剂采取丙酮时，所述TBFC的作用浓度为2-5mg/ml，当溶剂采取H₂O时，所述TBFC的作用浓度为12.5-50mg/ml。

本发明所提供的TBFC通过抑制DapE的活性来阻断细菌的琥珀酰化酶途径，从而破坏细菌的正常生长和繁殖，达到抑制细菌性病害的目的，由于琥珀酰化酶途径不存在于哺乳动物中，因此不会对人产生毒害作用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供TBFC作为防治细菌性病害的药物的应用，该TBFC对于多种细菌性病害具有良好的抑制效果，因而可以作为细菌性植物病害的预防与治疗药物，符合绿色农药的理念。

附图说明

图1为m-DAP/赖氨酸合成途径示意图。

图2为不同琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶的序列比较图。

图3为重组质粒spET24-6H-flg-XoDapE的质粒图谱。

图4为XoDapE的SDS-PAGE结果图。

图5为TBFC与XoDapE相互作用的SPR稳态拟合图。

图6A为1号培养皿中TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制作用结果图。

图6B为2号培养皿中TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制作用结果图。

图6C为3号培养皿中TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制作用结果图。

图7为TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制作用的统计图。

图8A为1号培养皿中TBFC对青枯雷尔氏菌的抑制作用结果图。

图8B为2号培养皿中TBFC对青枯雷尔氏菌的抑制作用结果图。

图8C为3号培养皿中TBFC对青枯雷尔氏菌的抑制作用结果图。

图9为TBFC对青枯雷尔氏菌的抑制作用的统计图。

图10A为1号培养皿中TBFC对水稻白叶枯菌的抑制作用结果图。

图10B为2号培养皿中TBFC对水稻白叶枯菌的抑制作用结果图。

图10C为3号培养皿中TBFC对水稻白叶枯菌的抑制作用结果图。

图11为TBFC对水稻白叶枯菌的抑制作用的统计图。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

内消旋二氨基庚二酸(m-DAP)是革兰氏阴性菌中细菌肽聚糖细胞壁的重要成分同时也是植物和微生物合成L-赖氨酸的底物。大多数细菌和植物是从天冬氨酸开始连续合成，在产生L-四氢二吡啶甲酸(L-tetrahyd-rodipicolinate)后分为乙酰基转移酶途径、琥珀酰化酶途径、氨基转移酶或者脱氢酶途径四种途径合成m-DAP和赖氨酸，被称为二氨基庚二酸(DAP)途径，即m-DAP/赖氨酸合成途径，如图1所示。其中，A表示脱氢酶途径；B表示琥珀酸酶途径；C表示乙酰酶途径；D表示氨基转移酶途径。上述途径对于细菌的生长和存活至关重要。

四种赖氨酸合成途径中最常见的是琥珀酰化酶途径，琥珀酰化酶途径被所有革兰氏阴性菌和大多数革兰氏阳性菌使用；脱氢酶途径和乙酰化酶途径存在于少数芽孢杆菌属细菌的合成途径，并且有单一途径或多种途径；植物和衣原体利用氨基转移酶直接合成L,L-二氨基庚二酸，再生成m-DAP，并以此为原料合成赖氨酸。而哺乳动物缺乏赖氨酸合成途径。因此，合成m-DAP及赖氨酸代谢途径的酶被看作是发现高效低毒抑(杀)细菌剂的靶点。

在琥珀酰化酶途径中，N-琥珀酰-L,L-二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶(琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶，DapE)是赖氨酸生物合成和构建细胞壁肽聚糖所必需，催化水解N-琥珀酰-L，L-二氨基丙酸(SDAP)为L,L-二氨基丙酸(L,L-diaminopimelic acid)和琥珀酸(Succinic acid)如式(I)所示。

有研究已经在大量致病性革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中鉴定出DapE基因，包括所有的ESKAPE病原体。研究发现幽门螺杆菌dapE突变体在补充外源性二氨基庚二酸(DAP)后能够存活，而加入赖氨酸则不能正常生长，说明幽门螺杆菌生长或存活需要DAP，且只能通过琥珀酰酶途径合成m-DAP/赖氨酸，从而说明DapE是细菌生长的关键酶，敲除DapE基因阻断赖氨酸合成途径可能阻止大多数细菌细胞合成所需的m-DAP/赖氨酸，破坏细菌的正常生长和繁殖，且由于哺乳动物自身没有琥珀酰酶途径来合成赖氨酸，DapE酶抑制剂提供对细菌的选择性毒性，对人类影响微乎其微。因此，DapE是一个潜在的细菌抑(杀)菌剂的靶点。

材料：

NB液体培养基的配方为：牛肉浸膏0.3g，蛋白胨0.5g，酵母粉0.1g，蔗糖1g，加入100ml纯水溶解后121℃，20min高压蒸汽灭菌后使用，若要配更大容量的培养基，则按以上比例放大。

NA固体培养基的配方为：牛肉浸膏0.3g，蛋白胨0.5g，酵母粉0.1g，蔗糖1g，琼脂粉2g，加入100ml纯水溶解后121℃，20min高压蒸汽灭菌后倒平板使用，若要配更大容量的培养基，则按以上比例放大。

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，用NaOH调节pH达到7.4，121℃，20min高压蒸汽灭菌后使用。

TB培养基购买自青岛高科园海博生物科技有限公司，产品编号为HBDC004。

TBFC购买自昊睿化学(上海)有限公司，CAS编号：56671-28-4。

实施例1TBFC的筛选和制备

采用计算机辅助药物设计的方法，虚拟筛选得到了化合物，其结构如式(II)所示：

经比化合物对为4-氧代-4,5,6,7-四氢-1-苯并呋喃-3-羧酸(TBFC)。

由于TBFC为商业化产品，可直接购买，由于纯化方式不同产品呈白色或淡黄色粉末状，本申请中所用TBFC购买自昊睿化学(上海)有限公司，产品为白色粉末状。

采用两种溶解方式：

(1)100mg的TBFC加入1ml丙酮中配成100mg/ml的丙酮溶液，然后将100mg/ml的丙酮溶液用丙酮依次稀释为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml，在超净工作台用灭菌过的0.22um的微孔滤膜过滤灭菌备用。

(2)配制1M的TBFC溶液：将2M的NaOH 65℃加热10-20min溶解0.18g的TBFC白色粉末。

由于TBFC的水溶解度低，因此先加NaOH变成TBFC的钠盐，再进一步进行后续稀释。

将TBFC溶液在超净台上过灭菌的0.22um的微孔滤膜后保存于灭菌的1.5mlEP管中，用无菌水将TBFC溶液(1M)依次稀释为12.5mg/ml、25mg/ml、50mg/ml的TBFC抑制剂溶液。

实施例2DapE的制备

从NCBI数据库检索具有代表性的植物病原菌的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(DapE)的氨基酸序列以及大肠杆菌DapE(E.coliDapE)的氨基酸序列，与流感嗜血杆菌DapE(HiDapE)的氨基酸序列的进行同源性比对。

其中，植物病原菌选择柑橘溃疡病菌、水稻白叶枯病菌、柑橘黄龙病菌亚洲种、胡萝卜软腐坚固杆菌。

柑橘溃疡病菌的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(DapE)命名为XccDapE，水稻白叶枯病菌的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶命名为XoDAPE、柑橘黄龙病菌亚洲种的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶命名为ClasDapE、胡萝卜软腐坚固杆菌的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶命名为PCDapE。

经过序列比较上述植物病原菌的DapE、大肠杆菌DapE、流感嗜血杆菌DapE的氨基酸序列，结果如图2所示。从图2可以看出，上述植物病原菌的DapE、大肠杆菌DapE、流感嗜血杆菌DapE的活性中心的氨基酸和维持蛋白质三维结构的氨基酸在不同物种中高度保守。

因此，选择其中一种DapE为代表来验证与TBFC的体外相互作用，这里以水稻白叶枯病菌的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶(XoDAPE)为代表。XoDAPE的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示：atgaacgatg tgctggatct gacctgcgat ctgatcgcac gcgcctcggt gactcccgaggatgctggct gccaggcact gcttgcaggg cgcttgactg ccgcgggctt cgcctgcgaa cacctgcgcctgggcgaggt cgacaatctg tgggcaacgc atggcagcgg cgcgccggtg ctggtgttgc tggggcataccgatgtggta ccgcctggcc cgcgcgaggc ttgggccagc gatccgttcg atccgcagat ccgcgacggcgtgctgtacg gtcgtggcgt ggctgacatg aaaggcagcg tcgccgcgtt cgtcgtcgcc gcggagcagttcgtcgccgc gcatcgagcg catgccggca cgctggcagt gttgctgact tcggacgagg agggcgatgccatcgatggc gtgcgccggg tcgccaacct ctttcgcgaa cgcggacagg cgatcgattg gtgcattaccggcgagccat cgtccaccga gcgcttgggc gatctgttgc gcgttggacg tcgcggcagc ttgtccggcacgctcaccgt caagggggtg caggggcatg tggcgtaccc acacaaggcg cgcaacccga tccatctggcagcgcctgcg ctggccgaac tggtcgcgcg gcaatgggac gatggcttcg aaagcttccc gccgaccagtctgcaagtct ccaatatcca tgccggcact ggcgccaata acgtgattcc cggcgagctg caggtggccttcaatctgcg ctatacgccg cactgggacg cgccgcgcct ggagacggaa atcaccgcgc tgctcgatcggcatgcgctg gactacgcgc tgcgctggca ccgcagcggc gagccgttct acaccccgga agggcgcttgcgtagcgtcg cgcgtgaggt gttgggcgcg tttgccggtg cgccaccgga agagagcacc ggcggcggcacctccgacgc gcgcttcatc gcgccattgg gcgcgcagtg catcgaagtc ggcccggtca acgccagcattcatcaggtc gacgagcatg tgcgcgttgc cgatctgcaa gcactgccag cgctgtatcg cacactgatcgagcgcttgc tggtcgag。

氨基酸序列如Seq ID No.2所示：MNDVLDLTCD LIARASVTPE DAGCQALLAGRLTAAGFACE HLRLGEVDNL WATHGSGAP VLVLLGHTDVV PPGPREAWTS DPFDPQIRDG VLYGRGVADMKGSVAAFVVA AEQFVAAHRA HAGTLAVLLT SDEEGDAIDG VRRVANLFRE RGQAIDWCIT GEPSSTERLGDLLRVGRRGS LSGTLTVKGV QGHVAYPHKA RNPIHLAAPA LAELVARQWD DGFESFPPTS LQVSNIHAGTGANNVIPGEL QVAFNLRYTP HWDAPRLETE ITALLDRHAL DYALRWHRSG EPFYTPEGRL RSVAREVLGAFAGAPPEEST GGGTSDARFI APLGAQCIEV GPVNASIHQV DEHVRVADLQ ALPALYRTLI ERLLVE。

委托北京义翘神州科技股份有限公司将XoDAPE的核苷酸序列插入spET24-6H-flg质粒的NdeI和XhoI之间，制备重组质粒spET24-6H-flg-XoDapE，重组质粒图谱如图3所示。然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在37℃，200rpm的条件下，TB培养基培养至OD₆₀₀达到1.5～3之间，加入终浓度为0.1mM的IPTG，在12℃，48h条件下诱导目的蛋白表达，常规方法进行目的蛋白提取，并进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示，其中，M为Marker；1为Marker；2为上清；3为沉淀；4为流穿液；5为洗杂液；6-7为目的蛋白。从图3可以看出，目的蛋白在上清中表达，且蛋白溶液未发生沉淀。

利用TB培养基培养出约45g大肠杆菌菌体，用Mag-Baeds His-Tag蛋白纯化磁珠(上海生工)按照产品说明书将2g菌体破碎提取并浓缩得到2.4mL的浓度为8.32mg/mL的纯度较高无杂蛋白的蛋白XoDAPE。

实施例3TBFC与DapE的体外相互作用

1.采用表面等离子共振技术(SPR)研究TBFC与XoDapE的亲和力

XoDapE蛋白为实施例1中原核表达并纯化、鉴定得到。

由于TBFC与XoDapE蛋白作用需要在水溶液环境中进行反应，并且TBFC还需要进行稀释，因此，TBFC抑制剂溶液选用实施例1配制的浓度最低的12.5mg/ml的水溶液作为母液进行稀释。

BiacoreT200生物传感器(GE Healthcare)、BIACORE T200内置控制软件、蛋白偶联试剂盒、CM5传感器芯片(CM5 Sensor Chip)、pH4.0的10mmol/L醋酸钠缓冲液、HBS-EP+缓冲液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和再生试剂盒均购自GE Healthcare公司。

1)在CM5传感器芯片上偶联蛋白

将XoDAPE用pH4.0的10mmol/L醋酸钠缓冲液释到40μg/mL，采用EDC和NHS将蛋白偶联到CM5芯片上，偶联水平约6000RU。

2)结合试验

将TBFC抑制剂用1×的HBS-EP+缓冲液进行50倍、100倍、200倍、400倍、800倍和1600倍稀释，得到0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml，0.015625mg/ml，0.0078125mg/ml浓度的溶液，用50mM的NaOH或10mM的甘氨酸-盐酸(pH＝2.5)作为再生溶液进行洗脱，观察结合效果。

3)数据分析

使用BIACORE T200内置控制软件，实时分析表面等离子共振(SPR)传感图，如图5所示，其中，0.125mg/ml样品上样有两个，得到两条几乎重合的线。从图5可以看出，TBFC与XoDapE能够结合，并且TBFC浓度越高，结合能力越强，浓度为0.0078125mg/ml，0.015625mg/ml，0.03125mg/ml结合差异较小，线条间距较小，但仍然能够看出浓度越低结合力越低。由于芯片检测时间为60s，因此60s后无检测结果而回归基线。

进一步使用内置软件计算TBFC抑制剂和XoDapE蛋白质的亲和力常数K_D＝1.485×10^-3M，说明TBFC可能是细菌的潜在抑制剂。

实施例4TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌(Pectobacterium carotovorum)的抑制作用

胡萝卜软腐坚固杆菌也叫胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种(Erwinia carotovorasubsp.carotovora,Ecc)是世界十大植物病原菌之一，主要侵染十字花科的经济作物和观赏花卉，如胡罗卜软腐、马铃薯软腐、白菜软腐、黄瓜软腐、芹菜软腐等。本实施例检测TBFC对于胡萝卜软腐坚固杆菌是否具有抑制效果。

胡萝卜软腐坚固杆菌(Pectobacterium carotovorum)购买自购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号：CGMCC No.1.141。

实验步骤：

1.准备LB液体培养基100ml×2，NA固体培养基平板200ml×2，0.9％的NaCl溶液。

2.细菌活化：用接种环从固体培养基上取一胡萝卜软腐坚固杆菌加入到100mL NB液体培养基中活化，28℃，200rpm摇床培养10h。

3.吸取100μL的菌液加入到100ml的NaCl(0.9％)溶液中混匀，取100μL混合好的NaCl-细菌液体至NA固体培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀(涂布法)。

4.取灭菌牛津杯(直径0.8cm)垂直插入含菌培养基中0.2cm，每个平板等距放置4个，在4个牛津杯中分别加入100μL TBFC抑制剂丙酮溶液(1mg/ml)、100μL TBFC抑制剂丙酮溶液(2mg/mL)、100μL TBFC抑制剂丙酮溶液(3mg/mL)、100μL TBFC抑制剂丙酮溶液(4mg/mL)、100μL TBFC抑制剂丙酮溶液(5mg/mL)，同时进行三组平行试验，共设置3个培养皿(1至3号培养皿)。

5.盖好培养皿盖封口后置于28℃培养箱避光培养24h-48h，观察培养情况用直尺测定抑菌圈直径，并分别对1号培养皿、2号培养皿、3号培养皿进行拍照，结果如图6A至图6C所示。

对上述培养皿中抑菌圈进行统计，取平均值，并做柱状图，结果如表1和图7所示。

表1TBFC对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制效果

浓度(mg/ml)	抑菌圈直径(cm)
		1	0.8
2	1.03±0.02
		3	1.23±0.04
4	1.43±0.002
		5	2.13±0.06

从图6A至图6C、图7以及结合表1可以看出，TBFC在2mg/ml至5mg/ml的浓度时均产生了抑菌圈，TBFC在1mg/ml时直径与牛津杯相同，说明TBFC在1mg/ml时无抑菌效果。在有抑菌效果的2mg/ml至5mg/ml的浓度时，其中，5mg/ml的TBFC产生的抑菌圈最大。这说明在上述浓度下的TBFC都对胡萝卜软腐坚固杆菌产生抑制效果。而5mg/ml至2mg/ml的浓度的抑菌圈大小呈现逐级减小的状态，也说明TBFC浓度越大，对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制效果越好。

实施例5TBFC对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的抑制作用

青枯雷尔氏菌是一种土传植物病原细菌，引发植物青枯病。它被认为是植物上最具破坏性的病原细菌，可侵染250多个物种，包括番茄、马铃薯、烟草、香蕉、辣椒、茄子等在内的多种重要农作物，造成巨大的经济损失。本实施例检测TBFC对于青枯雷尔氏菌是否具有抑制效果。

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)买自购于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株编号为CGMCC No 1.12711。

实验步骤：

1.准备NB液体培养基100ml×2，NA固体培养基200ml×2。

2.细菌活化：用接种环从固体培养基上取一环青枯假单胞菌加入到100mL NB液体培养基中活化，28℃，150rpm摇床培养24h。

3.将灭菌后的NA固体培养基200ml冷却至55℃左右，然后按混匀法，将1‰菌液(即200μl)加入上述55℃培养基，混合均匀，倒平板，冷却至完全呈固体状态，摇晃无液态NA固体培养基流动即可。

5.盖好培养皿盖封口后置于28℃培养箱避光培养24h-48h，观察培养情况用直尺测定抑菌圈直径，并分别对1号培养皿、2号培养皿、3号培养皿进行拍照，结果如图8A至图8C所示。

对上述培养皿中抑菌圈进行统计，取平均值，并做柱状图，结果如表2和图6所示。

表2TBFC对青枯假单胞菌的抑制效果

浓度(mg/ml)	抑菌圈直径(cm)
		1	0.8
2	0.9
		3	1.1±0.007
4	1.3±0.007
		5	1.46±0.06

从图8A至图8C、图9以及结合表2可以看出，TBFC在2mg/ml至5mg/ml的浓度时均产生了抑菌圈，其中，5mg/ml的TBFC产生的抑菌圈最大。这说明在上述浓度下的TBFC都对青枯雷尔氏菌产生抑制效果。TBFC达到2mg/ml时，TBFC对青枯假单胞菌的抑菌效果(0.9cm)相比于对胡萝卜软腐坚固杆菌的抑制作用效果(1.03±0.02)稍差，但仍然对青枯假单胞菌具有一定的抑菌作用。

实施例6TBFC对水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae)的抑制作用

黄单胞菌属的绝大多数成员为植物病原菌，引起的植物病害遍及全世界，几乎所有高等植物的主要科属植物都发生一种或多种病害。主要症状是叶、茎、果实上的坏死斑(斑点、条斑、溃疡)、萎蔫、腐烂等。十字花科蔬菜黑腐病是世界性病害，水稻白叶枯病和细菌条斑病、禾谷类黑颖病、柑桔溃疡病等都是中国的重要病害。

本实施例中以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)为代表检测TBFC对黄单胞菌属病原菌的作用。

水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae)ACCC 11605，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。

实验步骤：

1.准备NB液体培养基100ml×2，NA固体培养基200ml×2。

2.细菌活化：用接种环从固体培养基上取一环水稻白叶枯菌加入到100mL NB液体培养基中活化，28℃，200rpm摇床培养10h，。

3.将灭菌后的NA固体培养基200ml冷却至55℃左右，然后按混匀法，将1‰菌液(200ul)加入上述55℃培养基，混合均匀，倒平板，冷却至完全呈固体状态，摇晃无液态NA固体培养基流动即可。

4.取灭菌牛津杯(直径0.8cm)垂直插入含菌培养基中0.2cm，每个平板等距放置4个，在4个牛津杯中分别加入100μL TBFC抑制剂溶液(12.5mg/ml)、100μL TBFC抑制剂溶液(25mg/mL)、100μL TBFC抑制剂溶液(50mg/mL)、100μL H₂O(阴性对照)，同时进行三组平行试验，共设置2个培养皿(1至2号培养皿)。

5.盖好培养皿盖封口后置于28℃培养箱避光培养24h-48h，观察培养情况用直尺测定抑菌圈直径，并分别对1号培养皿、2号培养皿、3号培养皿进行拍照，结果如图10A至图10C所示。

对上述培养皿中抑菌圈进行统计，取平均值，并做柱状图，结果如表3和图11所示。

表3TBFC对水稻白叶枯菌的抑制效果

浓度(mg/ml)	抑菌圈直径(cm)
		0	0.8
12.5	2.11±0.269
		25	2.94±0.199
50	3.95±0.121

从图10A至图10C、图11以及结合表3可以看出，TBFC在12.5mg/ml，25mg/ml和50mg/ml的浓度时都产生了抑菌圈，而阴性对照(H₂O)由于牛津杯的直径是0.8cm，所以直径0.8cm实际没有抑菌作用。其中，50mg/ml的TBFC产生的抑菌圈最大。这说明在上述浓度下的TBFC都对水稻白叶枯菌产生抑制效果。而50mg/ml，25mg/ml和12.5mg/ml的浓度的抑菌圈大小呈现逐级减小的状态，也说明TBFC浓度越大，对水稻白叶枯菌的抑制效果越好，TBFC浓度效果从大到小依次为50mg/ml＞25mg/ml＞12.5mg/ml。

从上述实施例可以看出，丙酮和水作为溶剂制备的TBFC抑制剂溶液对于植物细菌性病害均有抑制效果。由于TBFC在水中溶解度低，而用水作为溶剂需要先使用NaOH将TBFC转变为钠盐，虽然钠盐可以与DapE结合发挥抑菌作用，但是水携带TBFC的钠盐进入细菌细胞难度较大，这可能是造成需要更高浓度的TBFC才能产生抑菌效果的原因。而丙酮由于可以有效溶解TBFC，同时有机溶剂更容易进出细胞膜，因此可以促进TBFC进入细菌发挥抑菌作用。以水为溶剂发挥TBFC抑菌作用需要较高浓度的TBFC，而以丙酮为溶剂虽然TBFC作用浓度较低，但是溶剂丙酮成本比水更高，综合计算采用不同溶剂的生产成本相差不大。

由于不同物种在DapE活性中心的氨基酸和维持蛋白质三维结构的氨基酸在不同物种中高度保守，而TBFC可以与不同细菌的DapE结合，说明其结合得为保守区域，因此，所有琥珀酰化酶途径的细菌都可以被TBFC抑制，从而阻断琥珀酰化酶途径。

从上述实施例可以看出，本发明提供的TBFC可通过对琥珀酰化酶途径中关键酶DapE的抑制作用，实现对植物细菌性病害的防治，由于琥珀酰化酶途径存在于革兰氏阴性菌和大部分革兰氏阳性菌中，选取有代表性的植物细菌性病害可得到TBFC对其生长的抑制效果，因此可知TBFC对于多种细菌性病害具有良好的抑制效果，因而可以作为细菌性植物病害的预防与治疗药物。如革兰氏阴性菌为土壤杆菌属(Agrobacterium)、欧文氏菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、韧皮部杆菌属(Liberobacter)和链丝菌属(Streptomyces)，嗜酸菌属(Acidovorax)、根杆菌属(Rhizobzcter)、根单胞菌属(Rhizomonas)、嗜木质菌属(Xylophilus)、泛生菌属(Pantoea)或木质部小菌属(Xylella)细菌，以及革兰氏阳性菌为棒形杆菌属(Clavibacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、短小杆菌属(Curtobacter)、红球菌属(Rhodococxcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、布克氏菌属(Burkholderia)细菌。

本发明提供的TBFC不仅仅对多种细菌性病害有效，而且使用剂量低，由于琥珀酰化酶途径不存在于哺乳动物中，因此不会对人产生毒害作用，属于新型的绿色农药。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.TBFC在制备防治细菌性病害的药物中的应用，其特征在于，所述细菌性病害为革兰氏阴性菌引起的植物细菌性病害；所述革兰氏阴性菌为胡萝卜软腐坚固杆菌（Pectobacterium carotovorum）、青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）或水稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae）；

当溶剂采取丙酮时，所述TBFC的作用浓度为2-5mg/ml；当溶剂采取H₂O时，所述TBFC的作用浓度为12.5-50mg/ml。