CN115927656A - 检测木瓜秀粉蚧pod基因表达特性的引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的引物及方法，引物序列如SEQ ID NO.1‑2所示，本发明建立了木瓜秀粉蚧取食木瓜和土豆两种不同寄主后POD基因表达量检测的荧光定量PCR方法，并进行了转录组的测序，对POD基因荧光定量的表达量趋势与转录组的表达量趋势做了比较，为研究木瓜秀粉蚧因寄主转换影响而产生的防御机制及POD基因表达特性奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的引物及方法，属于生物技术领域。
背景技术
木瓜秀粉蚧隶属于半翅目，蚧总科，粉蚧科秀粉蚧属。其寄主范围广泛，是一种扩散性强、生命力强、繁殖力强的重要潜在经济害虫。该虫一般被认为原产于墨西哥或中美洲地区，1955年在墨西哥采集到木瓜秀粉蚧第一批标本。木瓜秀粉蚧喜生活在叶片的叶脉处、茎叶的生长点、花叶凹凸或重合处、果实表面的凹陷或沟缝等隐蔽的部位。主要以若虫和雌成虫刺吸寄主植物的茎干、叶、花和果实等器官组织的汁液，导致叶片卷缩畸形、玫瑰花结、失绿黄化、枯萎脱落等；亦会导致枝条干枯、植株矮小或滞育、果实弱小或畸形、落花落果，危害严重时甚至导致整棵植株死亡。自1995年在圣马丁报道木瓜秀粉蚧危害之后，现已扩散至中美洲、北美洲、太平洋、非洲、亚洲等地区至少40个国家或地区，给番木瓜产业造成严重损失。木瓜秀粉蚧现也已侵入中国境内，给我国的番木瓜和花卉业带来巨大的潜在威胁。
关于木瓜秀粉蚧的研究，主要侧重于对其形态特征、生化机理及药剂防治等。陈青等(2018)测定了在不同温度培育条件下木瓜秀粉蚧体内酶的活性差异，结果发现高温和低温均能诱导木瓜秀粉蚧保护酶活性的提高。王亚茹等(2018)发现取食木薯的木瓜秀粉蚧体内的保护酶的活性显著降低，取食能力也降低。陈谦等（2020）研究发现木瓜秀粉蚧取食一些木薯品种后能够抑制体内抗氧化酶活性。关于不同寄主饲养的木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的研究，国内外未见报道。
细胞色素P450是由多个基因家族组成的基因超家族，几乎存在于所有生物体内(Werck-Reichhart，2000)。目前，已报道昆虫的P450基因家族多达60余个，其中包括CYP4，CYP6，CYP9基因家族等(Fogleman，2000)。P450基因功能广泛且丰富多样，参与昆虫的生长发育过程，包括蜕皮激素和保幼激素等内源物质的生物合成，以及植物次生物质和杀虫剂等外源物质的代谢(David，2003；Baldwin，2009)。POD 还参与活性氧代谢、抗病虫、耐干旱胁迫等生理过程，是昆虫响应逆境胁迫的关键酶之一。已有研究表明，CYP6家族与外源物质的代谢相关，细胞色素P450基因CYP681参与了呋喃香豆素在黑腹果蝇体内代谢(Cohen，1992)；CYP6BGl在小菜蛾苄氯菊酯抗性品系中过量表达（Bautista，2009）。申忠健等（2016）发现棉铃虫POD基因不仅受各种逆境的影响而且对抵御核型多角体病毒有一定的作用。Park等（2014）克隆了10条甜菜夜蛾POD基因，发现可调节细胞免疫反应。
关于木瓜秀粉蚧POD基因的表达等研究国内外未见报道，因此采用实时荧光定量PCR研究不同寄主处理下木瓜秀粉蚧POD基因的表达特性，结果表明，不同的寄主，POD基因的表达量也不同，并与转录组表达量的变化趋势一致，说明寄主转换可以影响POD基因的表达调控。若将一些目标基因作为害虫控制的靶标，可以开辟害虫分子调控的新领域，为农业害虫的防治提供新的方法和思路。
发明内容
本发明的目的是提供检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的引物及方法，为全面了解木瓜秀粉蚧POD基因的表达特性而设计的不同寄主处理。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
将取食木瓜和土豆两种不同寄主的木瓜秀粉蚧分别采20只到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共6组样品。
设计一对检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的引物，包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：
POD-F：5`- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3`，
POD-R：5`- GGCGATCAACTTGACATTTC-3`；
以及内参基因Tubulin的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3`，
Tubulin-R: 5`-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3`。
本发明所述检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的荧光定量PCR方法，按如下步骤进行：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）对下述引物进行常规PCR检测：
木瓜秀粉蚧POD基因的荧光定量上下游引物：
POD-F：5`- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3`，
POD-R：5`- GGCGATCAACTTGACATTTC-3`；
内参基因Tubulin的上下游引物：
Tubulin-F: 5`-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3`，
Tubulin-R: 5`-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3`；
常规PCR扩增体系总体积为20µL：2X Taq Plus Master Mix 10µL，上游引物0.8µL(5uM)，下游引物0.8µL (5uM)，100ng/µL cDNA模板1.0µL，水7.4µL；
常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后95℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；
实时荧光定量PCR扩增体系为：2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10µL，上游引物0.8µL (5uM)，下游引物0.8µL (5uM)，50 X ROX Reference Dye 2 0.4µL，100 ng/µL cDNA 2.0µL，补足水至20µL；
实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30s，72℃延伸40 s，40个循环。
本发明更加详细的试验方法如下：
木瓜秀粉蚧POD基因的实时荧光定量PCR检测方法可通过以下步骤实现：
（1）引物设计：根据转录组测序结果得到的木瓜秀粉蚧POD基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
POD-F：5`- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3`，
POD-R：5`- GGCGATCAACTTGACATTTC-3`。
同时，根据转录组测序结果得到的木瓜秀粉蚧tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3`，
Tubulin-R: 5`-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3`。
（2）木瓜秀粉蚧处理试验：在人工气候箱里分别培育木瓜苗和土豆苗，用于饲养木瓜秀粉蚧，各采20只木瓜秀粉蚧到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共6组样品。虫样处理后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
（3）cDNA第一链合成：参照全式金公司的
TransZol TM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，按照诺唯赞公司的 HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)试剂盒说明书，合成cDNA第一链。
（4）实时荧光定量PCR反应：实时荧光定量PCR采用南京诺唯赞生物科技有限公司的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (2X)试剂盒进行。以上述合成的cDNA第一链为模板，上述POD-F、POD-R和Tubulin-F、Tubulin-R为特异性引物，进行荧光定量PCR程序，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
实时荧光定量PCR扩增体系为：2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10µL，上游引物0.8µL (5uM)，下游引物0.8µL (5uM)，50 X ROX Reference Dye 2 0.4µL，100 ng/µL cDNA 2.0µL，补足水至20µL；
实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30s，72℃延伸40 s，40个循环。
（5）木瓜秀粉蚧POD基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
（6）图3为木瓜秀粉蚧取食不同寄主后POD基因的差异表达。结果表明，因寄主不同，POD基因的表达量也不同，并与转录组的表达量变化趋势一致，这为我们深入开展木瓜秀粉蚧POD基因的研究提供了重要的基础数据。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）本发明中的不同寄主处理措施，对昆虫绝大部分POD基因都适用，这对全面深入研究基因表达特性具有重要的意义。
（2）本发明所述高效快捷的荧光定量PCR法，包括荧光定量PCR程序等，实际用时50min，相对于现有技术大大缩短了反应时间，具有高效快捷的特性。
（3）本发明所述的荧光定量PCR法，提供常规PCR电泳结果图，可以直观快捷的反映出引物的特异性。
附图说明
附图为木瓜秀粉蚧POD基因转录水平的荧光定量PCR检测结果。
图1：木瓜秀粉蚧POD基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为268bp，
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
图2：木瓜秀粉蚧tubulin基因荧光定量引物常规PCR产物电泳结果：产物长度为202 bp，
Marker条带从上到下依次为：2000、1000、750、500、250、100bp。
图3：木瓜秀粉蚧取食不同寄主后POD基因的差异表达，柱形和左边坐标轴为荧光定量的表达量，散点和右边坐标轴为转录组的表达量，MF6表示取食木瓜的木瓜秀粉蚧，TF6表示取食土豆的木瓜秀粉蚧。
具体实施方案
以下结合具体实施例及附图说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制发明，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
试验材料的处理
在人工气候箱里分别培育木瓜苗和土豆苗，用于饲养木瓜秀粉蚧，不同寄主各采20只木瓜秀粉蚧到Eppendorf管中，分为3个生物学重复，共6组样品。虫样收集后迅速放入液氮中固定，于-80℃保存备用。
实施例2
引物的设计
（1）引物设计：根据转录组测序得到的木瓜秀粉蚧POD基因的序列，使用DNAMAN软件设计适合荧光定量PCR检测的特异性引物，引物序列如下：
POD-F：5`- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3`，
POD-R：5`- GGCGATCAACTTGACATTTC-3`。
木瓜秀粉蚧POD基因荧光定量PCR产物长度为268 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
（2）同时，根据转录组测序得到的木瓜秀粉蚧tubulin基因的序列，设计用于荧光定量PCR内对照物的引物，引物序列如下：
Tubulin-F: 5`-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3`
Tubulin-R: 5`-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3`
木瓜秀粉蚧tubulin基因荧光定量PCR产物长度为202 bp，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增后的产物长度一致，且为单一条带，说明所设计的引物具有很强的特异性，适合用于实时荧光定量PCR检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。
实施例3
总RNA的提取
参照全式金公司的
TransZol TM Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取总RNA，用液氮将虫体研磨成粉，加入1ml
TransZol TM Up，转到1.5 ml 离心管中，室温静置5 min后，加入200 μL氯仿/1 ml
TransZol TM Up，剧烈振荡30 s ，室温孵育3 min。 4℃ 10000 g 离心15min后，移上层水相（一般<80%）于新的离心管中，加入1/3体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀。将RNA离心柱套于2 ml收集管中，将上步混合物全部转入离心柱中，12000 g，30~60 s离心，弃流动相，重复使用收集管。加入500 μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相，再加入500μLCB9，室温12000 g离心30 s，弃流动相。加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相，再加入稀释的500 μLWB9，12000 g 离心30 s，弃流动相。12000 g 离心2 min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。将离心柱放入RNase-free Tube中，加50 μLRNase-free Water在离心柱的中央，室温静置1 min，12000 g离心1 min，洗脱RNA。所得的RNA置于-80℃备用。
实施例4
cDNA第一链合成：按照诺唯赞公司的HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNAwiper)试剂盒说明书步骤，以实施例3中的RNA为模板，反转录生成cDNA第一链，具体步骤如下：
（1）基因组DNA的除去反应。
（2）配制逆转录反应体系。
（3）进行逆转录反应，50℃温育15 min，85℃加热2 min，产物可放在-20℃、-80℃保存。
实施例5
进行荧光定量PCR反应。实时荧光定量PCR采用南京诺唯赞生物科技有限公司的ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (2X)试剂盒进行。以实施例4中的cDNA为模板，用实施例2中的引物进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个样品设3个平行重复，扩增后取所得平行Ct值的平均数。
（1）实时荧光定量PCR扩增体系如下：
实时荧光定量PCR扩增体系为：2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10µL，上游引物0.8µL (5uM)，下游引物0.8µL (5uM)，50 X ROX Reference Dye 2 0.4µL，100 ng/µL cDNA 2.0µL，补足水至20µL；
（2）实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30 s，72℃延伸40 s，40个循环。
（3）实时荧光定量PCR完成后，根据Ct值计算不同处理条件下相对表达量的比值2-ΔΔCt。木瓜秀粉蚧POD基因相对于tubulin基因的表达量的计算公式为：相对mRNA表达= 2-ΔΔCt×100%，其中Ct值=靶基因Ct值- tubulin Ct值。
表1：木瓜秀粉蚧取食不同寄主后POD基因的C(T)值、平均值、标准偏差、荧光定量表达量及转录组的表达量
注：MF6表示取食木瓜的木瓜秀粉蚧，TF6表示取食土豆的木瓜秀粉蚧。
（4）图3为木瓜秀粉蚧取食不同寄主后POD基因的差异表达。结果表明，因寄主不同，POD基因的表达量也不同，并与转录组的表达量的变化趋势一致。这为我们深入开展木瓜秀粉蚧POD基因的研究提供了重要的基础数据。
Claims (2)
1.一种检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括符合荧光定量PCR反应特点的上下游引物：
POD-F：5’- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3’，
POD-R：5’- GGCGATCAACTTGACATTTC-3’。
2.一种采用权利要求1所述的荧光定量PCR引物检测木瓜秀粉蚧POD基因表达特性的荧光定量PCR方法，其特征在于：按如下步骤：
（1）cDNA第一链合成：提取样本的总RNA并纯化，采用反转录试剂盒得到以提取的RNA为模板反转录得到的cDNA；
（2）以下述引物进行常规PCR检测：
木瓜秀粉蚧POD基因的荧光定量上下游引物：
POD-F：5’- TGTGCGTTACTCGGTACACA-3’，
POD-R：5’- GGCGATCAACTTGACATTTC-3’；
内参基因Tubulin的上下游引物：
Tubulin-F: 5’-CTTCACTTCTTCATGCCTGG-3’，
Tubulin-R: 5’-TTTGTTCGTCAACTTCTTTC-3’；
常规PCR扩增体系总体积为20µL：2X Taq Plus Master Mix 10µL，5uM上游引物0.8µL，5uM下游引物0.8µL，100ng/µL cDNA模板1.0µL，水7.4µL；
常规PCR反应程序为：94℃预变性5 min，然后95℃变性30 s， 50℃退火30 s， 72℃延伸1 min，此条件下35个循环，最后72℃再延伸10min；
（3）实时荧光定量PCR反应：
以步骤（1）得到的cDNA为模板，加入步骤（2）所述的引物，进行荧光定量PCR反应，每个样品设置3个重复，扩增后取平均值；
实时荧光定量PCR扩增体系为：2X ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10µL，5uM上游引物0.8µL，5uM下游引物0.8µL，50 X ROX Reference Dye 2 0.4µL，100 ng/µL cDNA2.0µL，补足水至20µL；
实时荧光定量PCR反应程序为：95℃预变性5 min，然后95℃变性5 s 、50℃退火30 s、72℃延伸40 s，40个循环。
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