CN115927088A - 一种人参根瘤菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人参根瘤菌及其应用。本发明从人参的根部微环境中分离到一种新的豌豆根瘤菌，命名为R‑le‑pg，所述豌豆根瘤菌具有提高人参皂苷通路上基因表达和/或人参皂苷含量的功能，制备获得的人参具有更好的调节和治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种人参根瘤菌及其在提高人参皂苷含量中的应用。
背景技术
人参来源于五加科植物人参属，作为中药材中的“百草之王”，因其“大补元气，补五脏，安精神，轻身延年”等功效，被中医认为是“滋阴补生，扶正固本”之极品。在西方，人参被命名为PANAX C.A.MEYER GINSENG，其中“PANAX”来源于希腊语，意思是“包治百病”。人参含有多种化学成分，其中最主要的功效成分为人参皂苷(人参的化学成分和药理研究进展.杨武韬.中国医药指南.2014.3:33-34.)。目前，已报道多种单体皂苷成分可以调节代谢系统、免疫系统和内分泌系统等生物过程，并用于治疗及预防心血管疾病和神经系统疾病等(Advance in saponins of aerial parts of Panax species.Bai M,Mao Q et al.Chinajournal of Chinese materia medica.2014.39:412-422.)。根据文献报道，人参植物中人参皂苷合成的途径主要包括：甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway，MVA)及2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸途径(2-C-methyl-D-erythrito-4-phosphate，MEP)(Yang DC.Biosynthesis and biotechnological production of ginsenosides.Kim Y J,ZhangD et al.Biotechnology Advances.2015.33:717-735)，人参皂苷合成通路中的基因上调表达可以显著提高人参皂苷含量。
人参按其来源可分为野山参和栽培参。由于人参生长周期长，并且经过历代开发，传统的野山参在我国已濒临绝迹，目前市场上出售的主要为栽培参。栽培参按照人参的种植地，主要分为在阔叶林或针阔混交林下种植的林下参(Mountain Cultivated Ginseng，MCG)和栽培于园地的园参(Garden Cultivate Ginseng，GCG)。林下参与园参在形态特征和活性物质含量等方面均存在较大区别，园参形态大，质地较疏松，其皂苷成分的含量比林下参低，导致园参的经济价值远低于林下参。因此，如何提高人参中皂苷含量成为人参栽培研究中的主要方向。
林下参和园参生长于不同生境的土壤中，土壤中的微生物与植物之间存在重要的调控关系。已有报道指出，根系微生物可以调控植物的生长发育和胁迫响应等多种生物过程，而人参根系微生物对其皂苷合成的研究较少。人参根系微生物的改良将是人参栽培技术革新的重要一环。
根瘤菌(Rhizobium)主要指与豆类作物根部共生形成根瘤并能固氮的细菌，一般指根瘤菌科和慢生根瘤菌科；它们都属于根瘤菌目，而慢生根瘤菌科包括豌豆根瘤菌属等。根瘤菌侵入寄主根内，刺激根部皮层和中柱鞘的某些细胞，引起这些细胞的强烈生长，使根的局部膨大形成根瘤；根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。但尚未有报道在人参根系中是否存在根瘤菌，以及该根瘤菌的作用。
发明内容
为克服上述缺陷，本发明提供一种能高产人参皂苷的人参根瘤菌及其应用，具体的：
本发明第一方面，提供一种人参根瘤菌，所述人参根瘤菌属于豌豆根瘤菌种的亚种，分离自人参根系微环境。
优选的，所述微环境包括人参根部和人参根部周围的土壤，更优选的，所述人参为林下参或者园参。进一步优选的，所述人参根瘤菌分离自林下参根部。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参皂苷通路基因的表达，更优选的，所述基因包括HMGR和UGT中的一种或者多种。进一步优选的，所述基因包括HMGR中的Pg_S0913.16、Pg_S0126.10、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7和/或Pg_S6083.2等等、UGT中的Pg_S4157.4和/或Pg_S2390.5等等。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参中人参皂苷单体的含量，更优选的，所述人参皂苷单体包括Rb1、Ra1、Ra2、CK中的一种或者多种，进一步优选的，所述人参皂苷还包括Re、Rg1、Rf、Rb2、Rh2、Ro、Rg3、Rb3中的一种或者多种。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参中总人参皂苷的含量。
优选的，所述人参根瘤菌为豌豆根瘤菌种的亚种。
优选的，所述人参根瘤菌的16S rDNA与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少96％以上的同一性，例如至少96.5％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％，更优选的，所述人参根瘤菌的16S rDNA不是NCBI ID NR_118339.1、NCBI ID NR_114989.1、NCBI ID NR_044774.1所示的序列，进一步优选的，所述人参根瘤菌的16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。
优选的，所述人参根瘤菌的全基因组序列与已知豌豆根瘤菌具有最高96.1％的同一性，例如与豌豆根瘤菌菌株GCA_002953715.1具有96.1％的同一性。
优选的，所述人参根瘤菌的全基因组序列与豌豆根瘤菌菌株GCA_014205785.1具有86％的同一性。
优选的，相对于豌豆根瘤菌标准菌株(R-le，Rhizobium leguminosarum，CGMCC1.87)，所述人参根瘤菌与所述豌豆根瘤菌标准菌株(R-le)的核苷酸相似性(ANI)小于等于94％，更优选的，所述人参根瘤菌在大约基因组第20910-22698的区间与R-le基因组的同源性为92.56％。所述人参根瘤菌的在大约基因组第144691-145727的区间与R-le基因组的同源性为92.28％。
优选的，所述人参根瘤菌呈小短杆状，菌体大小为0.5～0.9×1.2～3.0μm，在不同培养基生长的菌体形态不同。一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适pH 6.0～7.0。菌落呈圆形，边缘整齐，凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇无机盐琼脂培养基平板上生长3-6天后直径2～4mm。在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。
更优选的，所述人参根瘤菌为R-le-pg，保藏号为CGMCC23685或者与保藏号为CGMCC23685的ANI具有至少99％。
本发明第二方面，提供一种人参根瘤菌的培养方法，所述培养方法包括：S1)利用适合豌豆根瘤菌的培养基对人参根瘤菌进行培养。
优选的，所述培养基包括YMA、YEM
更优选的，所述步骤S1)包括根瘤菌于YMA培养基中复苏培养
在一个具体的实施方式中，所述步骤S1)包括根瘤菌于YMA培养基中复苏培养，复苏培养条件设置25-30℃，优选的，28℃恒温培养，分别挑取复苏菌斑于50mL离心管中(含10mL培养基液)，温度25-30℃，优选的，28℃，转速120-160rpm，优选的，140rpm，培养22-26小时，优选24小时。离心，4500-6000rpm，优选5000rpm，4℃，10min，弃除上清，控干液体。
优选的，所述的培养方法还包括S0)从人参根系微环境分离人参根瘤菌。
更优选的，所述步骤S0)包括：人参根部组织进行消毒，研磨人参根部组织直至根的组织形态被完全破坏。
进一步优选的，所述人参根部组织进行消毒步骤包括以乙醇和次氯酸钠进行消毒。
在一个具体的实施方式中，所述步骤S0)包括：剪取适当大小的人参根部组织，在人参根际中加入200μL 75％的乙醇，轻轻混匀，清洗5min，弃除乙醇。加入200μL 1％的次氯酸钠，清洗人参根际2min，弃除次氯酸钠溶液。加入200μL无菌水清洗人参根际，重复5次，弃除废液。加入200μL无菌水，用研锤研磨人参根部组织，直至根的组织形态被完全破坏。
优选的，所述的培养方法获得上述任一的人参根瘤菌。
本发明第三方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括豌豆根瘤菌或者豌豆根瘤菌的代谢产物。
优选的，所述菌剂能够促进人参中多种人参皂苷的合成。
优选的，所述菌剂中，豌豆根瘤菌的代谢产物可以是被培养的豌豆根瘤菌的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。优选的，所述菌剂还包括其它活性成分。例如，促进人参生长的其它活性成分。
优选的，所述菌剂还包括辅料。
更优选的，所述辅料包括载体，所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水。
更优选的，所述辅料还包括表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等中的一种或者多种。
优选的，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或喷雾剂等等。
优选的，所述豌豆根瘤菌为任意来源的豌豆根瘤菌，包括来源于豆科植物根系，例如来源于花生、大豆、豌豆、蚕豆、绿豆及苜蓿、沙打旺等等，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le，或者，所述豌豆根瘤菌来源于人参根系，更优选的，所述豌豆根瘤菌为上述任一的人参根瘤菌，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le-pg。
本发明第四方面，提供一种豌豆根瘤菌或其代谢产物在提高人参皂苷中的用途。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参皂苷通路基因的表达，更优选的，所述基因包括HMGR和UGT中的一种或者多种。进一步优选的，所述基因包括HMGR中的Pg_S0913.16、Pg_S0126.10、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7和/或Pg_S6083.2等等、UGT中的Pg_S4157.4和/或Pg_S2390.5等等。
优选的，所述豌豆根瘤菌或其代谢产物提高人参皂苷的含量，更优选的，所述人参皂苷包括Rb1、Ra1、Ra2、CK中的一种或者多种，进一步优选的，所述人参皂苷还包括Re、Rg1、Rf、Rb2、Rh2、Ro、Rg3、Rb3中的一种或者多种。
优选的，所述豌豆根瘤菌或其代谢产物提高人参中总人参皂苷的含量。
优选的，所述豌豆根瘤菌为任意来源的豌豆根瘤菌，包括来源于豆科植物根系，例如来源于花生、大豆、豌豆、蚕豆、绿豆及苜蓿、沙打旺等等，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le，或者，所述豌豆根瘤菌来源于人参根系，更优选的，所述豌豆根瘤菌为上述任一的人参根瘤菌，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le-pg等等。
本发明的第五方面，提供一种人参的培育方法，所述培育方法包括在人参培育中外源施加上述菌剂，促进人参皂苷合成。
优选的，所述豌豆根瘤菌的代谢产物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
优选的，所述菌剂还包括其它活性成分。例如，促进人参生长的其它活性成分。
优选的，所述菌剂还包括辅料。
更优选的，所述辅料包括载体，所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水。
更优选的，所述辅料包括表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等中的一种或者多种。
优选的，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或喷雾剂等等。
优选的，所述豌豆根瘤菌为任意来源的豌豆根瘤菌，包括来源于豆科植物根系，例如来源于花生、大豆、豌豆、蚕豆、绿豆及苜蓿、沙打旺等等，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le，或者，所述豌豆根瘤菌来源于人参根系，更优选的，所述豌豆根瘤菌为上述任一的人参根瘤菌，在一个具体的实施方式中，所述豌豆根瘤菌为R-le-pg。
优选的，所述培育方法获得的人参相对于未接种豌豆根瘤菌的人参，具有高含量人参皂苷，更优选的，所述人参皂苷包括总人参皂苷或者人参皂苷单体，进一步优选的，所述人参皂苷单体包括Rb1、Ra1、Ra2、CK中的一种或者多种，进一步优选的，所述人参皂苷还包括Re、Rg1、Rf、Rb2、Rh2、Ro、Rg3、Rb3中的一种或者多种。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参皂苷通路基因的表达，更优选的，所述基因包括HMGR和UGT中的一种或者多种。进一步优选的，所述基因包括HMGR中的Pg_S0913.16、Pg_S0126.10、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7和/或Pg_S6083.2等等、UGT中的Pg_S4157.4和/或Pg_S2390.5等等。
本发明的第六方面，提供一种人参，所述人参具有高含量人参皂苷。
优选的，所述人参皂苷高含量是指所述总人参皂苷含量或者人参皂苷单体高于未接种豌豆根瘤菌的人参。
优选的，所述人参皂苷单体包括Rb1、Ra1、Ra2、CK中的一种或者多种，进一步优选的，所述人参皂苷还包括Re、Rg1、Rf、Rb2、Rh2、Ro、Rg3、Rb3中的一种或者多种。
优选的，所述人参根瘤菌提高人参皂苷通路基因的表达，更优选的，所述基因包括HMGR和UGT中的一种或者多种。进一步优选的，所述基因包括HMGR中的Pg_S0913.16、Pg_S0126.10、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7和/或Pg_S6083.2等等、UGT中的Pg_S4157.4和/或Pg_S2390.5等等。所述高表达是指相对于未接种豌豆根瘤菌的人参而言，经豌豆根瘤菌培育的人参中皂苷通路基因表达更高。
优选的，所述人参由上述培育方法获得。
本发明的第七方面，提供一种上述人参在制备人参皂苷中的应用。
本发明的第八方面，提供一种人参皂苷的制备方法，所述制备方法包括从上述人参中提取人参皂苷。
优选的，所述提取步骤包括：(1)清洗人参样本；(2)研磨粉粹样本；(3)溶解样本；(4)离心提取上清液。
本发明的第九方面，提供一种上述人参或其提取物在制备组合物中的用途。
本发明的第十方面，提供一种组合物，所述药物组合物包括上述人参或其提取物。
优选的，所述人参为整体或者切片人参。
优选的，所述组合物为食品、保健品或者药物。
优选的，所述组合物可用于调节或者治疗免疫系统、神经系统，心血管系统、血液系统、内分泌系统、消化系统、生殖系统、呼吸系统、消化系统、肌肉骨骼系统的不适或者疾病等等。
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料，具体地，上述药学上可接受的辅料可选自：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂等中的一种或多种。
优选的，所述药物组合物选自任意中药或者西药剂型，例如汤、酒、茶、露、丸、散、膏、丹、片、锭、胶、曲，以及条剂、线剂等多种内服、外敷剂型等中药剂型。或者液体剂型(例如注射剂、混悬剂)、固体剂型(如粉末剂，冷冻制剂)、半固体剂型(如凝胶剂、膜剂)、气体剂型(如气雾剂、喷雾剂)等西药剂型。
本发明的有益效果：
1)本发明首次从人参根系微环境中分离出一种新的豌豆根瘤菌的亚种，该菌株和其它豌豆根瘤菌具有相似的性状和基因，可以提高人参皂苷的功能；
2)本发明首次发现利用豌豆根瘤菌，具有提高人参皂苷通路上基因表达的功能，尤其是可以提高HMGR，下游UGT表达，同时可以增加人参皂苷的含量，无论是单体物质，还是总人参皂苷都具有显著的提高；
3)在优选的实施方案中，人参根瘤菌可以进一步提高人参皂苷通路上基因表达的功能，尤其是可以提高HMGR和UGT；同时可以增加人参皂苷的含量，无论是单体物质，还是总人参皂苷都具有更为显著的提高；
4)本发明的人参根瘤菌制备和培养步骤简单，易于操作，但却可以显著的提高人参皂苷的含量，提高了人参的经济和药用价值。
5)本发明的药物组合物具有高含量人参皂苷，对于机体各个系统的不适和疾病具有更好的调节和治疗作用。
保藏说明
菌种名称：豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum
菌株编号：R-le-pg
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2021年10月28日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23685。
附图说明
图1所示为园参(GCG)和林下参(MCG)根(Root)和土壤(Soil)中细菌种类分析，其中图1A为生长2年和5年的园参和林下参根及土壤中细菌门分类的分布；图1B为变形菌门中豌豆根瘤菌种(Rhizobium leguminosarum)分别在林下参和园参的根部和土壤中的分布。
图2所示为人参分离的根瘤菌序列相似性比对分析。
图3所示为R-le-pg与R-le在第20910-22698的区间序列比对图。
图4所示为R-le-pg与R-le在第144691-145727的区间序列比对图。
图5所示为人参接种菌株后叶绿素和类胡萝卜素含量测定，其中图5A为接种一个月后人参叶绿素a(Chlorophyll a)、叶绿素b(Chlorophyll b)和类胡萝卜素(Carotenoids)的含量；图5B为接种一个月后人参叶绿素a/b的比值。
图6所示为接种菌株一个月后人参中皂苷含量分析，其中图6A为通过LC/MS液质联用，鉴定及分析人参皂苷类型及含量，不同类型的人参皂苷在谱图中用箭头标出；图6B为人参总皂苷的相对含量(设定Mock组的含量为1)；6C为单体皂苷在不同样品中的含量分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：根瘤菌的获取和鉴定
一、不同人参根系微环境的细菌分析
我们对MCG和GCG的根及根部周围土壤进行了基因组DNA提取。
MCG和GCG的根及根部周围土壤使用天根生化科技公司的基因组提取试剂盒(DP336)，根据说明书提示进行基因组DNA提取，由上海美吉生物医药科技有限公司进行了16S扩增子测序。
表1：门分类水平下2年生人参根系微环境中的细菌种类及相对丰度分析(％)
表2：门分类水平下5年生人参根系微环境中的细菌种类及相对丰度分析(％)
分析结果如表1-2和图1所示：
无论是2年或5年生MCG和GCG的根部还是土壤中都显著富集变形菌门(Proteobacteria)的细菌，其次是放线菌门(Actinobacteria)的细菌，而在MCG的根部或者土壤中的变形菌门的细菌都高于GCG的根或者土壤中的变形菌门的细菌(参见图1A和表1-2)。
进一步分析发现，无论是MCG还是GCG的根部微环境中都能分离到一类豌豆根瘤菌，但在MCG的根部中都显著富集该类豌豆根瘤菌，该菌群在MCG根部的丰度与该菌群在MCG的周围土壤、GMC的根部或周围土壤都有显著性的差异(参见图1B和表3)。
表3：人参根系微环境中的豌豆根瘤菌相对丰度分析(％)
| MCG根部 | GCG根部 | MCG土壤 | GCG土壤 | |
| 相对丰度 | 9.83±3.17 | 1.33±1.00 | 0.19±0.17 | 0.06±0.06 |
二、分离、培养、鉴定豌豆根瘤菌
为了分离、鉴定上述豌豆根瘤菌，本申请按照下述方法进行了人参根瘤菌的分离。
S0：分离培养人参根瘤菌
1)人参根际加入200μL 75％的乙醇，轻轻混匀，清洗5min，弃除乙醇。
2)加入200μL 1％的次氯酸钠，清洗人参根际2min，弃除次氯酸钠溶液。
3)加入200μL无菌水清洗人参根际，重复5次，弃除废液。
4)加入200μL无菌水，用研锤研磨人参根际组织，直至根的组织形态被完全破坏。
S1.豌豆根瘤菌培养基及其分离培养步骤：5)将液体均匀点在YMA培养基，用封口膜密封，倒置，28℃，培养2天。
6)1.5mL无菌离心管加入600μLYMA液体培养基，挑选细菌单克隆分别于液体培养基中，28℃，140rpm，过夜。
表4豌豆根瘤菌培养体系
挑取单克隆细菌，使用天根生化科技公司的细菌基因组提取试剂盒(DP302)提取基因组DNA，通过细菌16S rDNA的V3-V4可变区引物799F(5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'，SEQID NO：2)和1392R(5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'，SEQ ID NO：3)进行PCR扩增，扩增得到的DNA进行核酸测序，测序结果显示与豌豆根瘤菌的相似性大于99％，确认本申请分离得到的人参根瘤菌为豌豆根瘤菌种，其16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。接下来，该豌豆根瘤菌由希望组公司进行了全基因组三代测序，测序数据与GenBank上已有的281株分离的豌豆根瘤菌菌株(Strain)基因组序列进行了比较，结果显示，人参根系分离得到的人参根瘤菌与GenBank中的豌豆根瘤菌菌株GCA_002953715.1核苷酸相似性最高(96.1％，Average NucleotideIdentity，ANI)，与豌豆根瘤菌菌株GCA_014205785.1核苷酸相似性最低(88.9％，AverageNucleotide Identity，ANI)(参见图2)，以及豌豆根瘤菌标准菌株(R-le，Rhizobiumleguminosarum，CGMCC 1.87，与R-le-pg的核苷酸相似度ANI为94％)。通常认为ANI高于等于94％时，可定义为一个新的亚种，因此，本发明获得了一个不同于豌豆根瘤菌标准菌株的新的豌豆根瘤菌亚种，该菌株命名为Rhizobium leguminosarum Panax ginseng(R-le-pg)。
进一步比较了本发明的人参根瘤菌在发育标记基因位点(第20910-22698的区间和144691-145727)与豌豆根瘤菌标准菌株R-le相应位点的结构差异，具体见图3-4。
结果显示，本发明的人参根瘤菌与豌豆根瘤菌标准菌株R-le相应位点的结构分别具有92.56％和92.28％的同一性。
可见，本发明获得的菌株与已知豌豆根瘤菌的系统发育标记基因不同，属于一种新的豌豆根瘤菌种的亚种。
林下参广泛分布在我国吉林省、辽宁省长白山山脉和黑龙江省针阔叶混交林或阔叶次生林。在从辽宁省本溪市桓仁县不同地理位置，不同时间段(春、夏、秋、冬不同季节)进行分批次，重复分离林下参根部细菌，均可获得16SrDNA相同的人参根瘤菌，这些不同样本来源的人参根瘤菌具有与上述人参根瘤菌R-le-pg基本相同的结构，例如16SrDNA相同，与R-le-pg的ANI具有至少99％，属于同一亚种。
为了使用方便，我们同时将其进行保藏，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC.23685，保藏日期为2021年10月28日，属于根瘤菌目，慢生根瘤菌科，豌豆根瘤菌属，豌豆根瘤菌种。
实施例2：根瘤菌在人参皂苷合成中的作用
一、根瘤菌对人参的培育：
为了进一步验证人参根瘤菌在人参皂苷合成中的功能，我们将R-le-pg以及豌豆根瘤菌标准菌株(R-le，Rhizobium leguminosarum，CGMCC 1.87，与R-le-pg的核苷酸相似度ANI为94％)以OD600＝0.01浓度分别接种人参植株，以未接菌组(Mock)为对照。具体步骤如下：
人参出苗后将人参根部用无菌水清洗，将其种植于无菌蛭石中，细菌培养组与空白对照组，分别放置于培养箱的不同层。分别加入50mL Hoagland基础培养液稀释的OD600＝0.01的细菌溶液。Mock组加入相同体积的Hoagland基础培养液。对人参进行培育：
结果如表5和图5：
表5：菌株对人参生长的影响(单位:mg/g)
| 生长指标 | Mock | R-le | R-le-pg |
| 叶绿素a(chlorophylla) | 1.52±0.08 | 2.03±0.09 | 2.08±0.23 |
| 叶绿素b(chlorophyllb) | 0.59±0.04 | 0.85±0.04 | 0.80±0.09 |
| 类胡萝卜素(carotenoid) | 0.30±0.01 | 0.49±0.02 | 0.44±0.05 |
结果显示，接种R-le和R-le-pg的人参生长状态良好，未出现萎蔫、枯黄等病害现象，与Mock组相比，接种R-le和R-le-pg的人参叶片叶绿素含量没有下降，反而略有上升，但差异不大(参见图5A和表5)。
另外，作为衡量光合作用效率的叶绿素a/b的比值，在各组之间没有明显差异(参见图5B)。
二、根瘤菌对人参皂苷合成基因的影响：
在接种一个月后，收集不同处理的人参根部材料，首先进行全转库组测序，文库构建及转录组测序工作由安诺优达基因科技(北京)有限公司完成。具体步骤如下：
样品检测合格后，每个样品取3μg总RNA作为起始原料来构建转录组测序文库。根据
UltraTM RNA Library Prep Kit for
(#E7530L，NEB)的操作说明分别选取不同的index标签建库。针对合格后的Total RNA样品，用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物(random hexamers)合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNApolymerase I合成二链的cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化或QiaQuick PCR试剂盒纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XPbeads或琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库。分别进行全转录组测序以及人参皂苷含量测定。转录组测序分析结果显示，在接种R-le-pg和R-le后，人参皂苷合成通路中部分基因明显上调表达，其中接种R-le-pg的上调基因更多。鉴于HMGR和UGT是人参皂苷合成的重要基因，表6展示了接种R-le和R-le-pg后相较于Mock组人参根部HMGR和UGT的表达。
表6：菌株接种后人参皂苷合成通路中基因分析
三、根瘤菌对人参皂苷的影响：
接下来对采集的人参根部材料通过Waters ACQUITY UPLC-QTOF仪器进行LC/MS液质联用测定人参皂苷含量。具体步骤如下：
培养30天收集材料。对人参皂苷进行粗提：
S2.人参皂苷粗提步骤
每批次药材各取50mg到15ml离心管中，加入3ml的70％甲醇将样品溶解后，超声一小时(温度<40℃)，4000rpm离心10分钟，分别取上清液至5ml容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度线，混匀后分别用移液枪吸取1ml至1.5ml EP管中，14000rpm离心十分钟后，取上清液至进样小瓶，得到浓度为10mg/ml的样品。
使用UPLC-QTOF-MS进行检测，检测条件如下。柱温：35℃，流动相：A[水+0.1％甲酸(v/v)]，溶剂B[乙腈+0.1％甲酸(v/v)]组成。洗脱梯度如下：0～0.5min，B 15％；0.5～7min，B 20～28％；7～8min，B 28～30％；8～16min，B 30～35％；16～21min，B 35～60％；21～22.8min，B 60～98％；22.8～25min，B 98％；25～25.2min，B 85～15％；25.2～28min，B 15％。进样量：5μL，流速为300μL/min。
质谱条件设置如下：源温度，120℃；脱溶剂温度，500℃；毛细管电压：1.0kV；锥电压，20V；锥形气体流量，50L/h；脱溶气体流量，800L/h。。扫描设置m/z：100-1500；扫描时间：0.3s；碰撞能量：低能量：6.00ev高能：35.00ev-50.00ev。
QC样品的制备：均匀量取适量所有待分析样品提取液，混合均匀后等分到进样小瓶中，每8个样品进1个QC样品。
人参皂苷含量通过Waters ACQUITY UPLC-QTOF仪器进行LC/MS液质联用测定，结果如图6和表7所示：
表7：接种R-le,R-le-pg后人参皂苷含量分析(单位:mg/g)
| 人参皂苷 | Mock | R-le | R-le-pg |
| Rb1 | 19.4149±0.3047 | 24.5436±1.0408 | 24.3454±1.0262 |
| Re | 17.6600±0.8058 | 16.4632±0.9419 | 19.0319±1.6299 |
| Rc | 15.7201±0.3213 | 16.6448±0.7347 | 14.9372±0.9315 |
| Rg1 | 6.3609±0.2876 | 5.1344±0.2519 | 8.7720±0.5692 |
| Ra1 | 6.5589±0.3417 | 7.8381±0.2605 | 9.8909±0.7954 |
| Rf | 1.0741±0.0641 | 0.9822±0.0326 | 1.2049±0.1417 |
| Rg2 | 1.4799±0.0895 | 1.4473±0.1108 | 1.2771±0.0940 |
| Rb2 | 6.4031±0.1232 | 7.0984±0.2863 | 4.7672±0.4238 |
| F2 | 3.0712±0.1139 | 1.9049±0.0523 | 3.4278±0.2788 |
| Ra2 | 0.6301±0.1010 | 1.0705±0.0928 | 1.0739±0.1662 |
| Rh1 | 0.0068±0.0038 | 0.0048±0.0014 | 0.0040±0.0033 |
| Rh2 | 0.0285±0.0051 | 0.0175±0.0037 | 0.0809±0.0317 |
| Rd | 3.689±0.1017 | 3.5065±0.1291 | 3.4814±0.1736 |
| Ro | 0.0067±0.0019 | 0.0360±0.0120 | 0.0041±0.0013 |
| Rg3 | 0.1422±0.0248 | 0.1080±0.0238 | 0.3567±0.1554 |
| F1 | 0.0309±0.0115 | 0.0198±0.0029 | 0.0314±0.0158 |
| Rb3 | 0.1136±0.0521 | 0.2199±0.0437 | 0.0096±0.0062 |
| CK | 0.2602±0.0209 | 0.3221±0.0329 | 0.5475±0.0345 |
图6A显示了通过LC/MS液质联用，鉴定及分析人参皂苷类型及含量，不同的峰代表不同类型的人参皂苷。我们所关注的人参皂苷单体在在谱图中用箭头标出，如图所示，箭头分别标明了人参皂苷Rg1、Rf、Re、Rh1、Rg2、Rc、Ra1、Rb1、Rc、F1、Rb2、Rb3、Rd、F2、Rg3、Rh2、Ro的出峰位置。
在接种R-le和R-le-pg后，人参总皂苷含量以及部分单体皂苷含量显著增加，其中，
根据表7的计算可知，接种R-le的人参总皂苷增加大约7.9％，接种R-le-pg的人参总皂苷增加大约15.5％，两者之间，以及两个菌株接种组相对于对照组(Mock组)都有显著性的差异(参见图6B)；
而在人参皂苷单体方面，实验组(R-le和R-le-pg)都可以显著性的提高Rb1、Ra1、Ra2、CK的含量，R-le组还可以显著性提高Rb2、Ro、Rb3的含量，R-le-pg组还可以显著性提高Re、Rg1、Rf、Rh2、Rg3的含量(参见图6C和表7)，其中Rb1、Re、Rg1、Ra1的丰度高，属于人参皂苷的主要成分。
综合上述结果，本申请鉴定得到的人参根瘤菌菌株R-le-pg以及其它豌豆根瘤菌都可以提高人参中皂苷单体或者总皂苷含量。
实施例3：制备包含人参或者人参提取物的药物组合物
本领域技术人员可以参照现有技术制备包括本发明的人参或者人参提取物的药物组合物。
所述人参为整体或者切片人参。
所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料，具体地，上述药学上可接受的辅料可选自：缓冲剂、保护剂、稳定剂、表面活性剂、渗透压调节剂等中的一种或多种。
所述药物组合物选自任意中药或者西药剂型，例如汤、酒、茶、露、丸、散、膏、丹、片、锭、胶、曲，以及条剂、线剂等多种内服、外敷剂型等中药剂型。或者液体剂型(例如注射剂、混悬剂)、固体剂型(如粉末剂，冷冻制剂)、半固体剂型(如凝胶剂、膜剂)、气体剂型(如气雾剂、喷雾剂)等西药剂型。
基于现有技术的教导，以及本发明人参的高人参皂苷含量，本发明的药物组合物可用于调节或者治疗免疫系统、神经系统，心血管系统、血液系统、内分泌系统、消化系统、生殖系统、呼吸系统、消化系统、肌肉骨骼系统等等的不适或者疾病。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种人参根瘤菌，其特征在于，所述人参根瘤菌属于豌豆根瘤菌种的亚种，分离自人参根系微环境，优选的，所述微环境包括人参根部和人参根部周围的土壤，更优选的，所述人参为林下参或者园参。
2.如权利要求1所述的人参根瘤菌，其特征在于，所述人参根瘤菌提高人参皂苷通路基因的表达，优选的，所述基因包括HMGR和UGT中的一种或者多种，更优选的，所述基因包括HMGR中的Pg_S0913.16、Pg_S0126.10、Pg_S0245.36、Pg_S2351.7和/或Pg_S6083.2、UGT中的Pg_S4157.4和/或Pg_S2390.5；或者，
所述人参根瘤菌提高人参皂苷单体或者总人参皂苷的含量，优选的，所述人参皂苷单体包括Rb1、Ra1、Ra2、CK中的一种或者多种，更优选的，所述人参皂苷还包括Re、Rg1、Rf、Rb2、Rh2、Ro、Rg3、Rb3中的一种或者多种。
3.如权利要求1-2任一所述的人参根瘤菌，其特征在于，所述人参根瘤菌的16S rDNA与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少96％以上的同一性，优选的，所述人参根瘤菌与所述豌豆根瘤菌标准菌株的核苷酸相似性(ANI)小于等于94％。
4.权利要求1-3任一所述人参根瘤菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括：S1)利用适合豌豆根瘤菌的培养基对人参根瘤菌进行培养。
5.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括豌豆根瘤菌或者豌豆根瘤菌的代谢产物，所述菌剂能够促进人参中多种人参皂苷的合成，所述的豌豆根瘤菌包括权利要求1-3任一所述的人参根瘤菌。
6.一种豌豆根瘤菌或者豌豆根瘤菌的代谢产物在提高人参皂苷中的用途，优选的，所述的豌豆根瘤菌包括权利要求1-3任一所述的人参根瘤菌。
7.一种人参的培育方法，其特征在于，所述培育方法包括外源施加菌剂促进人参皂苷合成，所述的菌剂包括豌豆根瘤菌或者豌豆根瘤菌的代谢产物，优选的，所述菌剂为权利要求5所述的菌剂。
8.一种人参皂苷的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括从人参中提取人参皂苷，所述的人参来自权利要求7所述的培育方法获得的人参。
9.一种权利要求7所述的培育方法获得的人参或其提取物在制备组合物中的用途。
10.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括权利要求7所述的培育方法获得的人参或其提取物。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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