CN115925805A

CN115925805A - 一种人质膜膜泡关联蛋白pv-1融合蛋白及其制备方法

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Publication number: CN115925805A
Application number: CN202210799180.9A
Authority: CN
Inventors: 张静静; 安文琪; 邢体坤; 宋路萍; 王斌
Original assignee: Hualan Genetic Engineering Co ltd
Current assignee: Hualan Gene Engineering Henan Co ltd
Priority date: 2022-07-08
Filing date: 2022-07-08
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-07-08
Also published as: CN115925805B

Abstract

本发明公开了一种人质膜膜泡关联蛋白PV‑1融合蛋白及其制备方法。具体地公开了氨基酸序列为SEQ ID No.1的信号肽SP1、该信号肽与PV‑1的融合蛋白(SEQ IDNo.5)以及该融合蛋白的制备方法。本发明采用信号肽SP1促进PV‑1融合蛋白真核细胞分泌表达，HEK293表达系统蛋白产量和纯度显著高于CHO表达系统。进一步研究表明PV‑1组氨酸标签融合蛋白(SP1‑PV1‑His)表达效率显著高于Fc融合蛋白(SP1‑PV1‑Fc)，其中，HEK293表达系统提高27.2倍。此外，组氨酸标签分子量小，空间位阻弱，有利于保持蛋白活性，纯化简单，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

Description

一种人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉一种人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白及其制备方法。

背景技术

血管内皮细胞位于心血管系统的内表面，它既是感应细胞又是效应细胞，不仅能感知血液中的炎性信号、激素水平、切应力、压力等信息，而且能通过分泌多种血管活性物质对这些信息做出反应，在维持内环境渗透压平衡，血管壁完整性和阻止血栓形成中发挥重要的作用。血管内皮细胞的空隙(Trans endothelial channels，TEC)或带有隔膜的微孔(Fenestrae)或凹洞(Caveolae)是重要的亚细胞结构，在血管-组织间物质交换中发挥重要的作用。

人质膜膜泡关联蛋白(Plasmalemma vesicle associated protein，即PLVAP，简称PV-1)分子量约55-60kD，II型跨膜糖蛋白，是目前已知唯一的内皮血管微孔隔膜或质膜凹洞隔膜蛋白。早期研究证明，PV-1在内环境渗透性，白细胞迁移和血管新生中具有重要作用，近期研究表明PV-1与癌症、创伤性脊髓损伤，缺血性脑疾病或眼病密切相关。生物系统的血管-脑组织屏障和血管-视网膜屏障等内皮血管管壁上无质膜微孔或凹洞，也无PV-1蛋白表达，但病理状态下，如缺血性脑中风、脑部原发性或转移性肿瘤、糖尿病视网膜病变等情况下，血管-组织屏障结构遭到破坏，内皮血管管壁出现有微孔并伴有PV-1抗原表达。

综上所述，PV-1蛋白有望成为治疗年龄相关性黄斑变性(Age-related MacularDegeneration，AMD)、糖尿病黄斑水肿(Diabetic Macular Edema，DME)和成年患者视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿等疾病的新靶点。但是，目前关于PV-1靶点表达相关的文献报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种可提高人质膜膜泡关联蛋白分泌效率的信号肽和/或人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白及其制备方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为了实现上述目的，本发明首先提供了多肽，所述多肽的氨基酸序列可为SEQ IDNo.1。

所述多肽可为信号肽，名称为SP1。

所述信号肽SP1为人工改造的用于促进人质膜膜泡关联蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。

本发明还提供了融合蛋白，所述融合蛋白可为包括人质膜膜泡关联蛋白和所述信号肽SP1的蛋白质。

所述人质膜膜泡关联蛋白(Plasmalemma vesicle associated protein，PLVAP，PV-1)的氨基酸序列为SEQ ID No.3，PV-1编码序列(CDS)的核苷酸序列为SEQ ID No.4。

进一步地，所述信号肽SP1(SEQ ID No.1)可连接(融合)至所述人质膜膜泡关联蛋白(SEQ ID No.3)的N端。

进一步地，所述融合蛋白还可包括组氨酸标签蛋白。

所述组氨酸标签蛋白的氨基酸序列可为HHHHHH。

进一步地，所述组氨酸标签蛋白(HHHHHH)可直接或者通过接头(linker)连接(融合)至所述人质膜膜泡关联蛋白(SEQ ID No.3)的C端。

所述接头用于连接所述组氨酸标签蛋白和所述人质膜膜泡关联蛋白，所述接头可为柔性肽接头，包括(GGGGS)n，A(EAAAK)nA，(GGQGG)n和IEGRMD，但不限于此。

进一步地，所述接头(linker)的氨基酸序列可为GGGGS。

进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID No.5或SEQ ID No.5的第1-409位。

SEQ ID No.5的第1-409位所示的融合蛋白(名称为SP1-PV1)从N端到C端依次为：信号肽SP1(SEQ ID No.1)、人质膜膜泡关联蛋白(SEQ ID No.3)。

SEQ ID No.5所示的融合蛋白(名称为SP1-PV1-His)从N端到C端依次为：信号肽SP1(SEQ ID No.1)、人质膜膜泡关联蛋白(SEQ ID No.3)、接头(GGGGS)、组氨酸标签蛋白(HHHHHH)。

本发明还提供了核酸分子，所述核酸分子可为下述任一种：

A1)编码所述信号肽SP1的核酸分子；

A2)编码所述融合蛋白的核酸分子；

A3)编码序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.6的第16-1278位或SEQ ID No.6的第16-1242位所示的DNA分子；

A4)核苷酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.6的第16-1278位或SEQ ID No.6的第16-1242位所示的DNA分子。

SEQ ID No.2所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的信号肽SP1。

SEQ ID No.6的第16-1278位所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的融合蛋白(SP1-PV1-His)。

SEQ ID No.6的第16-1242位所示的DNA分子编码氨基酸序列是SEQ ID No.5的第1-409位所示的融合蛋白(SP1-PV1)。

其中，SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽SP1的编码序列，第73-1242位为PV-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为PacI识别位点。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法(定向进化和点突变等)，对本发明的信号肽SP1编码基因或融合蛋白的编码基因进行突变。经过人工改造的，具有与本发明的信号肽SP1编码基因或融合蛋白的编码基因75％或75％以上同一性的基因序列，只要编码信号肽SP1或本发明的融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

与本发明所述融合蛋白(SP1-PV1-His或SP1-PV1)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

C1)含有所述核酸分子的表达盒；

C2)含有所述核酸分子的重组载体、或含有C1)所述表达盒的重组载体；

C3)含有所述核酸分子的重组微生物、或含有C1)所述表达盒的重组微生物、或含有C2)所述重组载体的重组微生物；

C4)含有所述核酸分子的重组细胞、或含有C1)所述表达盒的重组细胞、或含有C2)所述重组载体的重组细胞。

上述任一所述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主菌或宿主细胞中表达人质膜膜泡关联蛋白PV-1或上述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步地，所述表达盒还可包括增强子序列。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、P1人工染色体(PAC)或Ti质粒人工染色体(TAC)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，所述载体具体可为pCGS3表达载体。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。

本文所述细胞(宿主细胞)是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞(如酵母细胞、曲霉菌)、动物细胞(如哺乳动物细胞、昆虫细胞)或原核细胞(如大肠杆菌或枯草杆菌)。所述细胞具体可为CHO细胞(如ExpiCHO-S^TM Cells)和/或HEK293细胞(如Expi293F^TM Cells)。

所述重组载体具体可为重组载体pCGS3-PV1-His。所述重组载体pCGS3-PV1-His是用核苷酸是SEQ ID No.6的DNA片段替换pCGS3载体的HindIII识别位点和PacI识别位点间的片段(小片段)，保持pCGS3载体的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽SP1的编码序列，第73-1242位为PV-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为PacI识别位点。重组载体pCGS3-PV1-His表达氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的融合蛋白SP1-PV1-His。

所述重组细胞具体可为将所述重组载体pCGS3-PV1-His导入宿主细胞CHO细胞(ExpiCHO-S^TM Cells)或HEK293细胞(Expi293F^TM Cells)得到的重组细胞。

本发明还提供了所述信号肽SP1，和/或，所述核酸分子，和/或，所述生物材料的下述任一种应用：

B1)在制备人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白中的应用；

B2)在提高人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白表达量或产量中的应用；

B3)在引导人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白在哺乳动物细胞中分泌表达中的应用；

B4)在提高人质膜膜泡关联蛋白或其融合蛋白分泌效率中的应用。

上述任一所述应用中，所述提高人质膜膜泡关联蛋白PV-1或其融合蛋白表达量或产量可为提高人质膜膜泡关联蛋白PV-1或其融合蛋白在宿主细胞中的表达量或产量。在本发明的具体实施例中，所述宿细胞可为CHO细胞或HEK293细胞。所述提高的方法可为在所述宿主细胞中导入所述重组质粒pCGS3-PV1-His。

本发明还提供了本文中任一所述融合蛋白(SP1-PV1-His和/或SP1-PV1)的下述任一种应用：

D1)在以人质膜膜泡关联蛋白为靶点的相关药物的筛选和/或开发中的应用；

D2)在制备人质膜膜泡关联蛋白结合试剂中的应用；

D3)在制备人质膜膜泡关联蛋白抗体中的应用。

本发明还提供了一种制备人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白的方法，所述方法可包括使编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子在宿主细胞中进行表达，得到所述人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：

E1)构建含有编码本文中任一所述融合蛋白(SP1-PV1-His和/或SP1-PV1)的核酸分子的重组表达载体；

E2)将所述重组表达载体导入宿主细胞，得到重组细胞；

E3)培养所述重组细胞，经分离和/或纯化得到所述人质膜膜泡关联蛋白融合蛋白。

进一步地，所述编码本文中任一所述融合蛋白的核酸分子可为下述任一种：

F1)SEQ ID No.6的第16-1278位所示的DNA分子；

F2)SEQ ID No.6的第16-1242位所示的DNA分子；

F3)SEQ ID No.6所示的DNA分子。

进一步地，所述宿主细胞为CHO细胞(ExpiCHO-S^TM Cells)或HEK293细胞(Expi293F^TM Cells)。

进一步地，所述导入是通过电转或转染试剂等转染等方式，导入CHO或HEK293细胞。

本发明采用信号肽SP1(SEQ ID No.1)促进人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白真核细胞分泌表达，HEK293表达系统蛋白产量和纯度显著高于CHO表达系统。进一步研究证明：人质膜膜泡关联蛋白组氨酸标签融合蛋白(SP1-PV1-His)表达效率显著高于Fc融合蛋白(SP1-PV1-Fc)，其中，HEK293表达系统提高27.2倍，CHO表达系统纯化未获得SP1-PV1-Fc。此外，组氨酸标签分子量小，空间位阻弱，有利于保持蛋白活性，纯化简单，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。本发明开发的信号肽SP1及与之融合的融合蛋白SP1-PV1-His和SP1-PV1将为设计新型PV-1靶点药物提供关键抗原，为后期以PV-1为靶点的相关药物的应用和开发提供强有力的支撑。

附图说明

图1为人工合成信号肽SP1分泌预测图。SP(Sec/SPI)表示氨基酸序列预测为信号肽概率，CS表示氨基酸序列预测信号肽酶酶切位点的概率，OTHERS表示氨基酸序列非信号肽的概率。纵坐标为氨基酸序列为预测结构的概率，横坐标为蛋白质氨基酸序列。

图2为PV-1融合蛋白重组表达质粒核酸电泳酶切鉴定图。其中，泳道M为Marker，泳道1为pCGS3-PV1-His重组表达质粒，泳道2为pCGS3-PV1-Fc重组表达质粒。

图3为CHO瞬转分泌上清SDS-PAGE鉴定图。其中，泳道1为pCGS3-PV1-His@CHO，泳道2为pCGS3-PV1-Fc@CHO，泳道3为无转染表达质粒的阴性组。

图4为HEK293瞬转分泌上清SDS-PAGE鉴定图。其中，泳道1为pCGS3-PV1-Fc@HEK293，泳道2为pCGS3-PV1-His@HEK293，泳道3为无转染表达质粒的阴性组。

图5为CHO瞬转分泌上清纯化过程SDS-PAGE鉴定图。其中，泳道1表示培养上清超滤废液，泳道2表示培养浓缩上清，泳道3表示亲和层析流穿液，泳道4表示洗杂废液，泳道5表示亲和层析洗脱液，泳道6表示超滤置换PBS蛋白溶液。

图6为HEK293瞬转分泌上清纯化过程SDS-PAGE鉴定图。其中，泳道1表示培养上清超滤废液，泳道2表示培养浓缩上清，泳道3表示亲和层析流穿液，泳道4表示洗杂废液，泳道5表示亲和层析洗脱液，泳道6表示超滤置换PBS蛋白溶液。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：

ExpiCHO-S^TM Cells(即下述实施例中所述ExpiCHO-S细胞)：Thermo Fisher公司；

ExpiCHO^TM Expression Medium：Thermo Fisher公司；

ExpiFectamine^TM CHO Transfection Kit：Thermo Fisher公司(包含ExpiFectamine^TMCHO Reagent；ExpiFectamine^TMCHO Enhancer；ExpiCHO Feed)；

OptiPRO^TMSFM Serum Free Medium(简称OptiPRO^TM SFM培养基)：Thermo Fisher公司；

Expi293F^TM Cells：Thermo Fisher公司；

Expi293^TM Expression Medium：Thermo Fisher公司；

ExpiFectamine^TM293 Transfection Kit：Thermo Fisher公司(包含ExpiFectamine293^TM Reagent；ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 1；ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 2)；

Opti-MEM^TM I Reduced Serum Medium：Thermo Fisher公司；

pCGS3表达载体：Merck公司；

GXL Premix：TAKARA公司；

HindIII：NEB公司；

PacI：NEB公司；

DNA Ligation Kit Ver.2.1：TAKARA公司；

Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Amicon Ultra-15离心过滤装置：Millipore公司；

Amicon Ultra-0.5离心过滤装置：Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；

Sure PAGE^TM，Bis-Tris，10×8，4-12％，12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司；

下述实施例中的主要仪器及其厂家信息如下：

凝胶成像系统：Protein Simple公司；

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；

CO₂恒温摇床：CRYSTAL公司；

HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；

DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂。

下述实施例中融合蛋白SP1-PV1-His的氨基酸序列为SEQ ID No.5；其中SEQ IDNo.5的第1-19位为信号肽SP1，SEQ ID No.5的第20-409位为人质膜膜泡关联蛋白，SEQ IDNo.5的第410-414位为连接肽(接头)，SEQ ID No.5的第415-420位为组氨酸标签蛋白。

融合蛋白SP1-PV1-His编码序列(CDS)的核苷酸序列为SEQ ID No.6的第16-1278位。其中，SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽SP1的编码序列，第73-1242位为PV-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为PacI识别位点。

实施例1、信号肽预测

采用SignalP-5.0在线软件预测人工合成信号肽SP1效率：人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.5或SEQ ID No.7)输入网址https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0，物种选择真核生物(Eukarya)，输出格式选择完整输出(Long output)，提交服务器预测信号肽SP1效率及切点位置。预测结果如图1所示，输入序列的第1-19位为信号肽结构概率为97.97％，信号肽酶酶切位点位于第19和20位氨基酸之间，预测结果显示信号肽SP1切割效率为79.78％，有利于人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白分泌表达(图1)。

实施例2、重组表达质粒构建

本实施例委托金斯瑞生物进行密码子优化并合成PV1-Fc基因(SEQ ID No.8)，交付质粒命名为pUC57-PV1-Fc，其中PV1蛋白(UniProtKB登录号：Q9BX97)选择为胞外区第53-442位置。

采用pUC57-PV1-Fc为模板，引物1和引物2为引物，使用DNA聚合酶

GXL Premix(TAKARA)进行PCR扩增PV1-His基因(SEQ ID No.6)，上述PCR扩增使用引物序列如下(下划线表示酶切位点)：

引物1：5’-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGCTCTGCCCGTCTGGCT-3’；

引物2：5’-CCTTAATTAATCAATGATGGTGGTGATGGTGAGAGCCTCCACCCCCTCCGGAAGATGGAGCCACAGG-3。

HindIII和PacI双酶切pCGS3表达载体(Merck公司)，获得酶切的pCGS3载体片段；HindIII和PacI双酶切上述PCR扩增的PV1-His，获得酶切的PV1-His基因片段；HindIII和PacI双酶切上述金斯瑞合成pUC57-PV1-Fc，获得酶切的PV1-Fc基因片段。利用DNALigation Kit Ver.2.1(TAKARA公司)将酶切的PV1-His基因片段和酶切的PV1-Fc基因片段分别和酶切的pCGS3表达载体片段连接，转化，挑单克隆，HYG-A全恒温摇瓶柜(太仓设备)培养，提取质粒鉴定获得两个重组表达质粒，分别命名为pCGS3-PV1-His和pCGS3-PV1-Fc。

上述所得两种重组表达质粒的酶切，使用DYY-6C型电泳仪(北京六一)、DYCP-31DN型水平电泳槽(北京六一)进行核酸电泳，鉴定结果如图2所示。由图可见，第1泳道为pCGS3-PV1-His表达质粒，酶切后载体7106bp，目标基因1286bp；第2泳道为pCGS3-PV1-Fc载体为7106bp，目标基因为2249bp，酶切条带大小符合预期。

重组表达质粒pCGS3-PV1-His是用核苷酸是SEQ ID No.6的DNA片段替换pCGS3载体的HindIII识别位点和PacI识别位点间的片段(小片段)，保持pCGS3载体的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。SEQ ID No.6的第1-6位为HindIII识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72位为信号肽SP1的编码序列，第73-1242位为PV-1蛋白的编码序列，第1243-1257位为连接肽(接头)的编码序列，第1258-1275位为组氨酸标签蛋白的编码序列，第1276-1278位为终止密码子，第1279-1286位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-PV1-His表达氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的融合蛋白SP1-PV1-His。

重组表达质粒pCGS3-PV1-Fc是用核苷酸是SEQ ID No.8所示的DNA片段替换pCGS3载体的HindIII识别位点和PacI识别位点间的片段(小片段)，保持pCGS3载体的其它核苷酸序列不变得到的重组载体。SEQ ID No.8的第1-6位为HindIII识别位点，第7-15位为Kozak序列，第16-72为信号肽SP1，第73-1242位置为PV-1蛋白，第1243-1248位为连接肽，第1249-2238位为Fc标签基因，第2239-2241位为终止密码子，第2242-2249位为PacI识别位点。重组表达质粒pCGS3-PV1-Fc表达氨基酸序列如SEQ ID No.7所示的融合蛋白SP1-PV1-Fc。

实施例3、蛋白瞬转表达

3.1 CHO细胞瞬转表达

依据质粒原始浓度，按照每毫升细胞培养物转染0.8μg质粒的量，计算转染50mL细胞所需原始质粒的体积。在超净工作台(苏州安泰)中将pCGS3-PV1-His和pCGS3-PV1-Fc上述两个重组表达质粒分别加入到3.84mL OptiPRO^TM SFM培养基中，再分别加入160μLExpiFectamine^TMCHO Reagent，上下颠倒混匀，室温反应5分钟。将质粒和转染试剂复合物缓慢滴入含有ExpiCHO-S细胞的细胞培养基ExpiCHO^TM Expression Medium(Thermo公司)中培养以表达2个重组蛋白分子，边加边摇晃细胞培养物，使DNA与转染试剂复合物分散均匀。在CO₂恒温摇床(CRYSTAL公司)中37℃，8％CO₂，120rpm，振幅26mm，湿度≥80％条件培养。转染后18至22h按照转染50ml细胞的量添加辅料和增强剂，即取300μl ExpiFectamine^TMCHOEnhancer(Thermo公司)与8ml ExpiCHO Feed(Thermo公司)混匀后缓慢加入细胞培养物中。同时将培养条件37℃降至32℃、CO₂浓度由8％降至5％；转染后第5天再次添加补料。当活率降至65％-75％时终止培养得到培养物，所得培养物依次命名为pCGS3-PV1-His@CHO和pCGS3-PV1-Fc@CHO。培养物进行3500g离心30min获得培养上清，采用Sure PAGE^TM，Bis-Tris，10×8，4-12％，12wells预制胶(金斯瑞)进行SDS-PAGE蛋白电泳，凝胶成像系统(Protein Simple公司)拍照记录(图3)。实验证明，pCGS3-PV1-Fc@CHO在还原和非还原的SDS-PAGE条件下，均无目的蛋白表达；但是pCGS3-PV1-His@CHO出现目的条带(箭头表示)，灰度分析表达量占总蛋白百分比为9.86％。

3.2 HEK293细胞(Expi293F^TM Cells)瞬转表达

质粒稀释：依据质粒原始浓度，按照每毫升细胞培养物转染1μg质粒的量，计算转染50mL细胞所需原始质粒的体积。在超净工作台(苏州安泰)中将pCGS3-PV1-His和pCGS3-PV1-Fc上述两个重组表达质粒分别加入3mL Opti-MEM^TM I Reduced Serummedium，轻轻颠倒混匀。转染试剂稀释：取转染50mL细胞所需转染试剂的量，即160μL ExpiFectamine293^TMReagent于2.8ml Opti-MEM^TM I Reduced Serum medium(Thermo公司)中轻轻上下颠倒混匀，静置5min。将稀释好的转染试剂加入稀释好的pCGS3-PV1-His和pCGS3-PV1-Fc上述两个重组表达质粒中轻轻上下颠倒混匀，室温反应10至20min。将混合好的转染试剂和DNA复合物缓慢加入细胞培养物中，边加边摇晃细胞培养物，使DNA与转染试剂复合物分散均匀。在CO₂恒温摇床(CRYSTAL公司)中37℃，8％CO₂，120rpm，振幅26mm，湿度≥80％条件培养。转染后18至22h按照转染50ml细胞的量添加增强剂，即取300μl ExpiFectamine^TM293Transfection Enhancer 1(Thermo公司)与3ml ExpiFectamine^TM 293TransfectionEnhancer 2(Thermo公司)混匀后缓慢加入细胞培养物(含有Expi293F^TM Cells的Expi293^TMExpression Medium)中。转染后每天监测细胞活率，当活率降至65％至75％时终止培养，所得培养物依次命名为pCGS3-PV1-His@HEK293和pCGS3-PV1-Fc@HEK293。收集培养物于3500g离心30min收集上清，采用Sure PAGE^TM，Bis-Tris，10×8，4-12％，12wells预制胶(金斯瑞)进行SDS-PAGE蛋白电泳，凝胶成像系统(Protein Simple)拍照记录(图4)。实验证明，pCGS3-PV1-Fc@HEK293在还原和非还原的SDS-PAGE条件下，均无显著目的蛋白表达；但是pCGS3-PV1-His@HEK293出现目的条带(箭头表示)，灰度分析表达量占总蛋白百分比为31.78％。

实施例4、蛋白亲和层析

4.1超滤浓缩

收样上清(即实施例3中3.1和实施例3中3.2所得培养物“收集培养物于3500g离心30min”后所得上清)进行4℃，Amicon Ultra-15离心过滤装置(Millipore公司)6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至20-30ml，即为超滤浓缩上清(图5或图6泳道2)，流穿Amicon Ultra-15离心过滤装置的废液即为培养上清超滤废液(图5或图6泳道1)。

4.2蛋白亲和层析

蛋白质的纯化采用Ni-NTA 6FF His标签蛋白纯化试剂盒进行，步骤如下：

步骤4.1获得的超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer按照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育。两倍柱体积的Binding/Wash Buffer平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱。将超滤浓缩上清和Binding/Wash Buffer混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱；如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中，即为亲和层析流穿液(图5或图6泳道3)。两倍柱体积的Binding/wash buffer清洗柱子并收集流穿液，直到流穿液的吸光度OD_280nm接近基线，即为洗杂废液(图5或图6泳道4)。两倍柱体积的Elution Buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，重复此步骤直到流穿液的吸光度OD_280nm接近基线，收集亲和层析洗脱液(图5或图6泳道5)。

4.3、超滤置换

镍柱纯化后的蛋白溶液加Amicon Ultra-0.5离心过滤装置(Millipore公司)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μl。轻轻加入300μl PBS(pH 7.4)，10000g离心至剩余150μl，重复三次。PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2ml超滤置换PBS蛋白溶液(图5或图6泳道6)，留样进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。CHO和HEK293两种表达系统的产品(即本发明融合蛋白SP1-PV1-His)纯化后产量分别为14.03mg/L和45.70mg/L(产量比SP1-PV1-Fc的高27.2倍)，产品灰度分析纯度分别为81.27％和94.15％(SP1-PV1-Fc纯化后在HEK293表达系统产量分别为1.62mg/L，纯度为89.18％，在CHO表达系统未纯出目的蛋白)。

综合以上各实施例的结果，信号肽SP1高效引导人质膜膜泡关联蛋白PV-1融合蛋白真核细胞分泌表达，HEK293蛋白制品产量和纯度显著高于CHO表达系统。进一步研究证明：人质膜膜泡关联蛋白组氨酸标签融合蛋白表达效率显著高于Fc融合蛋白，且组氨酸标签分子量小，空间位阻弱，有利于保持蛋白活性；纯化简单，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。