CN115925801A - 一类基于小分子阿片和神经肽ff的杂聚肽及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类基于N‑4‑哌啶基‑N‑苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的多靶点杂聚肽，该类杂聚肽是以小分子结构的N‑4‑哌啶基‑N‑苯基丙酰胺和多肽结构的神经肽FF作为化学模板，通过将N‑4‑哌啶基‑N‑苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的“药效团”进行化学偶联，获得的一系列肽‑小分子杂合结构的杂聚肽。动物体内药理学活性鉴定表明，该类杂聚肽具有高效镇痛活性，且无成瘾和呼吸抑制等阿片样副作用。并且，化合物1‑4及化合物7‑9无镇痛耐受现象，在慢性痛的长期镇痛治疗中具有潜在的应用前景。因此，该类基于N‑4‑哌啶基‑N‑苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽具备高效、低副作用的理想镇痛药物开发价值。

Description

一类基于小分子阿片和神经肽FF的杂聚肽及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及疼痛治疗领域，具体涉及一类基于小分子结构的N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和多肽结构的神经肽FF的杂聚肽及其合成方法，和该类杂聚肽分子在制备镇痛药物中的应用。

背景技术

疼痛是临床最常见的疾病之一，其发病率非常高，全球超过10亿人口长期受到慢性疼痛的困扰，严重影响人们的生活质量，全球老龄化问题加速了疼痛的发生(Nature2016，535：S4)。目前，疼痛主要通过药物疗法治疗，尤其吗啡、芬太尼等Mu阿片类镇痛药物，该类镇痛药物因临床疗效显著，是中度和重度疼痛治疗的一线药物。然而，阿片类镇痛药物的长期使用会引起呼吸抑制、便秘、耐受及成瘾等副作用，同时伴随恶心、呕吐、肌肉僵直、瘙痒等不良反应，从而大大限制了其临床应用范围。特别近年在美国，芬太尼类阿片药物的滥用人数急剧增加，导致因阿片类药物过量致死的人数持续增加，出现“阿片类药物危机”(Science2018，361：831)。

然而，芬太尼类镇痛药物普遍存在疗效好、生物利用度高、生产成本低廉等优点，其临床疗效显著，镇痛药效是吗啡的50～100倍，且便秘的副作用弱于吗啡，是目前使用最广泛的阿片类镇痛药物之一，用于缓解手术期间和术后的剧痛，治疗癌痛等慢性疼痛，还可作为麻醉辅助用药(Neuropharmacology 2018，134：121)。因此芬太尼类小分子阿片配体本身疗效好、其结构易于改造，通过有效的药物设计策略对其进行化学修饰并降低其副作用，可促进具有更高安全性和成药性的镇痛新药研发。

ZL201110098832.2、ZL201110097843.4和CN 106084001 A(专利申请号201610252648.7)公开了一系列基于阿片肽和神经肽FF化学构建的多靶点肽类配体，其能产生无耐受镇痛作用且便秘副作用有所降低，说明阿片/神经肽FF系统的多靶点策略可有效降低阿片肽的副作用，但上述公开的化合物其成药性仍不明确。本发明采用阿片/神经肽FF系统多靶点分子设计策略，以阿片小分子N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF为化学模板分子化学构建肽-小分子杂合结构的杂聚肽，该类配体在降低镇痛耐受、成瘾和呼吸抑制等阿片样副作用的同时，具有较高的成药性。

发明内容

本发明的目的是针对现有芬太尼等小分子镇痛药物存在显著阿片样副作用的缺陷，提供一类镇痛效果好、副作用低的基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽分子。

本发明的杂聚肽分子，是通过将N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF药效团进行化学嵌合，构建的一系列肽-小分子杂合结构的杂聚肽。其结构通式如下：

其中：

R选自苯基或噻吩基；

Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Arg-Xaa₅-NH₂为神经肽FF(Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂)关键药效团，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄和Xaa₅选自天然或非天然氨基酸；Xaa₁选自Phe或NMe-Phe；Xaa₂选自Gln或β-Ala；Xaa₃选自Pro或D-Pro；Xaa₄选自Gln、β-Ala或Aib；Xaa₅选自Phe、Phg、Ala或Cha；

Y选自-CH₂C(＝O)-、-C₂H₅C(＝O)-或-OCH₂C(＝O)-，所述-CH₂C(＝O)-、-C₂H₅C(＝O)-或-OCH₂C(＝O)-的相应羧酸通过与Xaa₁的氨基形成肽键连接。

在本发明的通篇说明书中，采用常规的三字母代码代表天然氨基酸，并采用公认的代码代表其他氨基酸，如NMe-Phe(N^α-甲基苯丙氨酸)、β-Ala(β-丙氨酸)、D-Pro(D型脯氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、Phg(苯甘氨酸)和Cha(环己基丙氨酸)。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物1。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-C₂H₅C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物2。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-OCH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物3。

R为噻吩基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物4。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phg，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物5。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Ala，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物6。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为β-Ala，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物7。

R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Aib，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物8。

R为苯基，Xaa₁为NMe-Phe，Xaa₂为β-Ala，Xaa₃为D-Pro，Xaa₄为β-Ala，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽标记为化合物9。

上述各化合物的氨基酸序列如表1所示：

表1基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽的氨基酸序列结构

本发明的另一目的是提供上述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽的化学合成方法，包括以下工艺步骤：

步骤1，树脂预处理：将酰胺树脂在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30～40分钟以充分溶胀，减压抽干溶剂，之后加入DMF洗涤，抽干；

步骤2，脱除Fmoc保护：在步骤1预处理的树脂中，加入脱保护试剂，搅拌反应3～7分钟后抽干，重复3次；之后加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

步骤3，氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加到步骤2所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干，茚检后按步骤2的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

步骤4，肽链的延长：根据多肽的结构设计，从C端开始依次选择N-α-Fmoc及侧链保护的氨基酸采用逐一偶联的方式，将步骤2所得脱除Fmoc保护基团的树脂按步骤3的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂；

步骤5，肽链的切割：将步骤4所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2～3小时；过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀；吸除上清液，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽；

步骤6，粗肽的纯化：使用高效液相色谱仪纯化，收集主峰，冷冻干燥即得杂聚肽产品。

在本发明优选的实施方案中，在步骤2中所述脱保护试剂是由六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺以1:1:98的体积比组成的混合溶液。

在本发明优选的实施方案中，在步骤3所述氨基酸的缩合中，N-α-Fmoc及侧链保护氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐及二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2，N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2～5倍过量。

在本发明优选的实施方案中，在步骤4所述肽链的延长中，所述C端开始N-α-Fmoc保护的氨基酸依次为Fmoc-Xaa₅-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Xaa₄-OH、Fmoc-Xaa₃-OH、Fmoc-Xaa₂-OH、Fmoc-Xaa₁-OH及N末端结构通式为

的羧酸类似物。

在本发明优选的实施方案中，在步骤5中所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶液。

上述方法制备的一系列杂聚肽，经质谱鉴定和色谱分析检测，与所设计化学物结构一致。表明成功合成了基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，纯化后杂聚肽纯度达98％以上。

本发明还有一个目的，就是提供上述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽在制备高效、低副作用镇痛药物中的应用。

附图说明

图1为皮下注射化合物1对小鼠急性痛所产生剂量依赖性镇痛作用的时间-量效曲线

图2为连续八天皮下注射化合物1-9在小鼠急性痛中的镇痛耐受评价

图3为皮下注射化合物1对小鼠炎症痛的镇痛作用

图4为皮下注射化合物1对小鼠呼吸系统的作用

图5为皮下注射化合物1的小鼠躯体依赖性评价

图6为皮下注射化合物1的小鼠心理成瘾性评价

具体实施方式

以下提供本发明的基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽在疼痛治疗中的应用的实施例，旨在说明本发明并非限定本发明的范围。在本说明书的指导下，本领域技术人员还可以对本发明进行若干改变或修饰，这些改变或修饰也同样处于本发明的保护范围之内。

本发明使用的仪器如下：

本发明已知的起始原料N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺的羧酸类似物可按照本领域内已知的方法合成(Future Med Chem,2014,6:385-412；PLoS One,2014,9:e108250)，其它原料可从吉尔生化(上海)有限公司、天津南开和成公司、北京百灵威科技有限公司、萨恩化学技术(上海)有限公司等公司购买。

实施例一、化合物1的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：在上述预处理的树脂中，加入体积比为1:1:98的六氢吡啶：1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯：N,N-二甲基甲酰胺脱保护试剂，搅拌反应5分钟后抽干，重复3次；之后加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤，得到脱除Fmoc基团保护的树脂。

(3)茚检：挑出少量树脂加入试管中，以1：2：1的比例按顺序加入1滴配方①、2滴配方②和1滴配方③，煮沸3min后观察溶液和树脂颜色。如果脱除Fmoc保护完全，溶液、树脂均呈蓝色。茚三酮试剂配方为：①20g苯酚/5mL乙醇；②0.05mL 0.001mol/L氰化钾(水)/2.5mL吡啶；(3)0.5g茚三酮/10mL乙醇。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽170.1mg，粗肽产率为71.9％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物1样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物1样品纯度为98.2％，计算总产率为25.0％。

实施例二、化合物2的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物5-氧亚基-5-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}戊酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽160.6mg，粗肽产率为67.1％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物2样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物2样品纯度为99.3％，计算总产率为31.3％。

实施例三、化合物3的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物[(2-氧亚基-2-{苯基[1-(2-苯基乙基)六氢吡啶-4-基]氨基}乙基)氧基]乙酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽185.6mg，粗肽产率为77.4％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物3样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物3样品纯度为99.1％，计算总产率为44.2％。

实施例四、化合物4的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Phe-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-(苯基{1-[2-(噻吩-2-基)乙基]哌啶-4-基}氨基)丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽174.1mg，粗肽产率为73.1％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物4样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物4样品纯度为99.4％，计算总产率为16.8％。

实施例五、化合物5的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Phg-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽185.1mg，粗肽产率为80.0％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物5样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物5样品纯度为98.9％，计算总产率为23.6％。

实施例六、化合物6的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Ala-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽157.5mg，粗肽产率为71.1％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物6样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物6样品纯度为99.1％，计算总产率为23.4％。

实施例七、化合物7的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Cha-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽179mg，粗肽产率为98.9％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物7样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物7样品纯度为97.6％，计算总产率为13.0％。

实施例八、化合物8的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.4mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Cha-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽180.0mg，粗肽产率为98.4％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物8样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物8样品纯度为95.7％，计算总产率为21.0％。

实施例九、化合物9的合成

(1)树脂预处理：称取500mg取代值为0.43mmol/g的Rink-Amide-MBHA树脂放于合成仪中，在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30分钟以充分溶胀树脂后，减压抽干溶剂，之后再加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤后抽干。

(2)脱除Fmoc保护：方法同实施例一。

(3)茚检：方法同实施例一。

(4)氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc保护的Fmoc-Cha-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐和二异丙基乙胺以1:1:1:2的摩尔比完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，混匀得混合溶液，其中N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2.5倍过量。然后混合溶液加到上述步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干。抽干后用上述步骤(3)的方法茚检，如果缩合完全，溶液呈淡黄、树脂无色。之后再按步骤(2)的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

(5)肽链的延长：从肽链序列的C端开始依次将Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-D-Pro-OH、Fmoc-β-Ala-OH、Fmoc-NMe-Phe-OH和N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物4-氧亚基-4-{苯基[1-(2-苯基乙基)哌啶-4-基]氨基}丁酸采用逐一偶联的方式，将步骤(4)所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤(4)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂

(6)肽链的切割：将步骤(4)所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入10mL由三氟乙酸、三异丙基硅烷和水组成的体积比为95:2.5:2.5的切割剂，于室温下切割反应3小时。过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀。吸除上清液，加入20％的醋酸水溶液充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽187.0mg，粗肽产率为80.0％。

(7)粗肽的纯化：通过反向高效液相色谱仪，使用色谱制备柱XBridge TM BEH130Prep C₁₈(619mm×250mm)对步骤(6)得到的粗肽进行纯化，选择乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)作为流动相，收集主峰，冷冻干燥即得化合物9样品。使用色谱分析柱XBridge TM BEH 130Prep C₁₈(4.6mm×250mm)检测，化合物9样品纯度为97.5％，计算总产率为15.8％。

上述合成的一系列杂聚肽的化学表征结果如表2所示：

表2杂聚肽的化学表征

注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-80％乙腈/水(0.1％TFA)(30分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-100％乙腈/水(0.1％TFA)(30分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6mm×250mm。

实施例十、活性测试

(1)小鼠辐射热甩尾镇痛实验

利用小鼠光热甩尾实验，通过皮下给药方式，研究杂聚肽对急性痛的镇痛作用。

1)药物注射方法

对于小鼠皮下方式给药，使用1mL注射器，针头刺入小鼠背部皮下，把针尖轻轻向左右摆动，摆动轻松则说明已刺入皮下。之后注射药物，注射体积为10μl/g体重。注射后用手按压或捏住刺入部位，防止药物漏出。

2)辐射热甩尾实验方法

小鼠辐射热甩尾实验利用自制光热甩尾仪进行检测。实验动物使用体重18-22g的成年昆明系雄性小鼠。操作者需通过前期训练，轻柔、熟练地捉拿小鼠，实验时将动物尾巴靠外三分之一处放置于光热甩尾仪的光束上。注射药物前，需先测定基础甩尾潜伏期，同时为减少小鼠组织损伤，最大甩尾潜伏期设置为10秒。注射药物后，记录小鼠在不同时间点的甩尾潜伏期。记录的数据用最大可能镇痛效应(MPE)表示，MPE(％)＝100×[(药物注射后痛阈-基础痛阈)/(10秒-基础痛阈)]。ED₅₀值表示药物产生一半最大镇痛作用的剂量，通过Graphpad PRISM 5软件计算得到。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Dunnett检验，与生理盐水组比较具有统计学意义。

3)辐射热甩尾镇痛实验结果与结论

小鼠辐射热甩尾镇痛实验的实验结果如图1及表3所示。皮下注射化合物1都能产生剂量依赖的镇痛作用，其镇痛作用的ED₅₀值分别为0.024mg/kg，且镇痛作用持续时间为90分钟。与化合物1类似，皮下分别注射化合物2-9也都能产生剂量依赖的镇痛作用。以上实验结果说明，本专利所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽对急性痛具有潜在的治疗价值。

表3皮下注射杂聚肽所产生的镇痛活性

(2)化合物1-9的镇痛耐受实验

小鼠皮下连续注射8天，利用上述光热甩尾实验，评价化合物1-9的镇痛耐受现象。

1)镇痛耐受实验方法

小鼠连续8天皮下注射药物，每天注射一次，用光热甩尾实验检测药物甩尾潜伏期。对照化合物芬太尼及化合物1-9的最大镇痛作用都出现在注射药物后的30分钟内，因此记录第一天和第八天给药后第30分钟的甩尾潜伏期。第1天需先测定基础甩尾潜伏期，同时为减少小鼠组织损伤，最大甩尾潜伏期设置为10秒。记录的数据用最大可能镇痛效应(MPE)表示，MPE(％)＝100×[(药物注射后痛阈-基础痛阈)/(10秒-基础痛阈)]。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Tukey HSD检验，与药物第1天镇痛作用比较具有统计学意义。

2)镇痛耐受实验结果与结论

药物连续注射8天在辐射热甩尾急性痛中的镇痛耐受的实验结果如图2所示。与第一天对比，皮下连续注射芬太尼在第8天几乎丧失镇痛效果，说明皮下注射芬太尼产生镇痛耐受现象。皮下连续8天注射化合物5-6产生与芬太尼相似的镇痛耐受现象。相反，皮下注射化合物1-4及化合物7-9，在第8天都保持等效的镇痛作用。此外，皮下单独注射生理盐水不产生镇痛作用。以上实验结果说明，化合物1-4及化合物7-9在急性痛中不出现镇痛耐受现象，暗示其在发挥高效镇痛作用的同时无镇痛耐受的阿片样副作用，具有针对慢性痛等长期疼痛的治疗潜力，而化合物5-6可在急性痛等短期疼痛中使用。

(3)化合物1在角叉菜胶炎症痛模型中的镇痛作用

利用小鼠注射角叉菜胶诱导的炎症痛模型，检测注射杂聚肽对炎症痛的镇痛作用。

1)角叉菜胶诱导的炎症痛模型和Von Frey实验

小鼠角叉菜胶诱导的炎症痛利用电子Von Frey触痛仪检测。首先测定正常昆明系小鼠的基础痛阈值(g)。之后通过小鼠足跖皮下注射2％的角叉菜胶溶液20μl，小鼠被注射足产生机械痛敏。记录24小时后小鼠被注射足的机械痛敏值(g)，然后皮下注射化合物1，记录药物注射后不同时间点的机械痛阈值(g)。机械痛敏值(g)用平均值±标准误表示。ED₅₀值表示药物产生一半最大镇痛作用的剂量，通过Graphpad PRISM 5软件计算得到。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Dunnett检验，与生理盐水组比较具有统计学意义。

2)炎症痛镇痛实验结果与结论

化合物1对小鼠角叉菜胶诱导的炎症痛镇痛作用的实验结果如图3所示。皮下注射化合物1对炎症痛能产生剂量依赖的镇痛作用，其镇痛作用的ED₅₀值为0.042mg/kg，且镇痛作用持续时间为90分钟。以上实验结果说明，化合物1对炎症痛的治疗具有潜在的药用价值。

(4)化合物1对呼吸系统的作用

通过给药后，抽取特定时间点小鼠心脏血，进行血气分析，检测化合物1对小鼠呼吸系统的作用。

1)血气分析实验

血气分析实验通过采集小鼠血液后，利用血气分析仪进行检测。小鼠皮下注射药物后，使用含抗凝剂的注射器在特定时间点(5、15和30分钟)从小鼠心脏采血0.2mL，每只小鼠仅使用一次。采血后立即通过麦迪卡EasyBloodGas血气分析仪检测，记录pH、pCO₂和pO₂值。数值用平均值±标准误表示。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Dunnett检验，与生理盐水组比较具有统计学意义。

2)对呼吸系统作用的实验结果与结论

药物对呼吸系统作用的实验结果如图4所示。与生理盐水组相比，皮下注射对照化合物芬太尼导致pH值在第15分钟显著地降低、pCO₂值在第15分钟显著地增强以及pO₂值在第5分钟显著地降低，说明芬太尼具有明显的呼吸抑制作用。而皮下注射化合物1后，所记录pH、pCO₂和pO₂值的与生理盐水组的值相比没有变化。以上实验结果说明，化合物1无呼吸抑制的阿片样副作用。

(5)化合物1的躯体依赖性评价

通过纳洛酮戒断实验，检测注射化合物1后小鼠的躯体依赖性。

1)纳洛酮戒断实验

通过以递增的剂量(0.2、0.4、0.6、0.8、1、1、1mg/kg)每隔8小时小鼠皮下注射一次药物，连续注射七次。最后一次注射药物2小时后通过皮下注射纳洛酮诱导阿片戒断反应，视频监控记录小鼠在不透明观察桶(高32厘米、直径9厘米)中跳跃次数，以此评价药物的躯体依赖性，也即生理成瘾性。跳跃次数用平均值±标准误表示。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Dunnett检验，与生理盐水组比较具有统计学意义。

2)躯体依赖性评价的实验结果与结论

药物躯体依赖性评价的实验结果如图5所示。与生理盐水组相比，皮下注射阳性对照物芬太尼使小鼠的跳跃次数显著增加，说明其出现纳洛酮戒断症状。而皮下注射化合物1后小鼠的跳跃次数与生理盐水组相比没有变化。以上实验结果说明，化合物1无躯体依赖的阿片样副作用。

(6)化合物1的心理成瘾性评价

通过小鼠条件位置偏爱实验，评价注射化合物1后小鼠的心理成瘾性。

1)条件位置偏爱实验

条件位置偏爱(CPP)实验使用CPP盒来检测，CPP盒由三部分组成，包括两个尺寸20cm×20cm×20cm的大隔间，以及连接大隔间的一个尺寸为5cm×20cm×20cm的小隔间。两个大隔间具有视觉差异，一个大隔间贴黑色壁纸，另一个大隔间贴白底壁纸。两个大隔间底部设置小门，可关闭或打开以控制小鼠进出。实验共计5天，分筛选、训练和测试三个阶段进行。在筛选阶段，即第1天，小鼠可在整个装置自由活动15分钟，记录小鼠在每个大隔间的停留时间，筛选在单个隔间里停留时间不超过全部时间60％的小鼠。在训练阶段，小鼠注射生理盐水后，将其限定在某一隔间训练40分钟；6小时后，注射药物并将小鼠限定在另一隔间训练40分钟。在第2天-第4天，连续训练三天。最后1天为测试阶段，小鼠在整个装置自由活动15分钟，记录小鼠在每个大隔间的停留时间。数据用条件位置偏爱分数表示，定义为第五天小鼠在药物关联隔间中的停留时间减去第一天小鼠在药物关联隔间中的停留时间。数据用平均值±标准误表示。P值小于0.05表示根据单因素方差分析及Tukey HSD检验，与生理盐水组比较具有统计学意义。

2)心理成瘾性评价的实验结果与结论

药物心理成瘾性评价的实验结果如图6所示。与生理盐水组相比，皮下注射阳性对照物芬太尼使小鼠在药物关联隔间中的停留时间显著增多，说明其出现条件位置偏爱。而皮下注射注射高剂量(1、10mg/kg)的化合物1与生理盐水组相比均没有使小鼠产生显著的条件位置偏爱。以上实验结果说明，化合物1无心理成瘾性的阿片样副作用。

Claims (16)

1.一类基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，其结构通式如下：

其中：

R选自苯基或噻吩基；

Xaa₁-Xaa₂-Xaa₃-Xaa₄-Arg-Xaa₅-NH₂为神经肽FF(Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH₂)关键药效团，Xaa₁、Xaa₂、Xaa₃、Xaa₄和Xaa₅选自天然或非天然氨基酸；Xaa₁选自Phe或NMe-Phe；Xaa₂选自Gln或β-Ala；Xaa₃选自Pro或D-Pro；Xaa₄选自Gln、β-Ala或Aib；Xaa₅选自Phe、Phg、Ala或Cha；

Y选自-CH₂C(＝O)-、-C₂H₅C(＝O)-或-OCH₂C(＝O)-，所述-CH₂C(＝O)-、-C₂H₅C(＝O)-或-OCH₂C(＝O)-的相应羧酸通过与Xaa₁的氨基形成肽键连接。

2.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

3.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-C₂H₅C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

4.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-OCH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

5.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为噻吩基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phe，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

6.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Phg，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

7.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Gln，Xaa₅为Ala，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

8.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为β-Ala，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

9.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为Phe，Xaa₂为Gln，Xaa₃为Pro，Xaa₄为Aib，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

10.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，R为苯基，Xaa₁为NMe-Phe，Xaa₂为β-Ala，Xaa₃为D-Pro，Xaa₄为β-Ala，Xaa₅为Cha，Y为-CH₂C(＝O)-时，杂聚肽的序列为

11.根据权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽，其特征在于，其合成方法包括以下工艺步骤：

步骤1，树脂预处理：将酰胺树脂在适量二氯甲烷中浸泡，低速搅拌30～40分钟以充分溶胀，减压抽干溶剂，之后加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽干；

步骤2，脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)保护：在步骤1预处理的树脂中，加入脱保护试剂，搅拌反应3～7分钟后抽干，重复3次；之后加入N,N-二甲基甲酰胺洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

步骤3，氨基酸的缩合：依次将N-α-Fmoc及侧链保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于N,N-二甲基甲酰胺中，再加入二异丙基乙胺后混匀得混合溶液；然后加到步骤2所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌缩合60min，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤、抽干，茚检后按步骤2的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

步骤4，肽链的延长：根据多肽的结构设计，从C端开始依次选择N-α-Fmoc保护的氨基酸采用逐一偶联的方式，将步骤2所得脱除Fmoc保护基团的树脂按步骤3的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂；

步骤5，肽链的切割：将步骤4所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2～3小时；过滤，滤液低于40℃的条件下充分减压旋干，然后用冰冷乙醚析出沉淀；吸除上清液，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粉状固体粗肽；

步骤6，粗肽的纯化：使用高效液相色谱仪纯化，收集主峰，冷冻干燥即得杂聚肽产品。

12.根据权利要求2所述杂聚肽的合成方法，其特征在于，所述步骤2中，所述脱保护试剂是由六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺以1:1:98的体积比组成的混合溶液。

13.根据权利要求2所述杂聚肽的合成方法，其特征在于，所述步骤3中，N-α-Fmoc保护氨基酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐及二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1:2，N-α-Fmoc保护氨基酸相比脱除Fmoc基团保护的树脂2～5倍过量。

14.根据权利要求2所述杂聚肽的合成方法，其特征在于，所述步骤4中，所述C端开始N-α-Fmoc及侧链保护的氨基酸依次为Fmoc-Xaa₅-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Xaa₄-OH、Fmoc-Xaa₃-OH、Fmoc-Xaa₂-OH、Fmoc-Xaa₁-OH及N末端结构通式为的羧酸类似物。

15.根据权利要求2所述杂聚肽的合成方法，其特征在于，所述步骤5中，所述切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比形成的混合溶液。

16.权利要求1所述基于N-4-哌啶基-N-苯基丙酰胺类似物和神经肽FF的杂聚肽在制备高效、低副作用的理想镇痛新药中的应用。

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