CN115918544A - 一种多花黄精组织培养方法 - Google Patents

一种多花黄精组织培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115918544A
CN115918544A CN202310030159.7A CN202310030159A CN115918544A CN 115918544 A CN115918544 A CN 115918544A CN 202310030159 A CN202310030159 A CN 202310030159A CN 115918544 A CN115918544 A CN 115918544A
Authority
CN
China
Prior art keywords
content
culture medium
medium
culture
sucrose
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310030159.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115918544B (zh
Inventor
李宁
杨国群
汤阳灿
黄黎君
禹佩瑶
陈嘉丽
林增
蒋东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Central South University of Forestry and Technology
Original Assignee
Central South University of Forestry and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Central South University of Forestry and Technology filed Critical Central South University of Forestry and Technology
Priority to CN202310030159.7A priority Critical patent/CN115918544B/zh
Publication of CN115918544A publication Critical patent/CN115918544A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115918544B publication Critical patent/CN115918544B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/40—Afforestation or reforestation

Landscapes

  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及药用植物组织培养领域，具体公开了一种多花黄精组织培养方法，为以多花黄精未成熟种子经冷藏和机械损伤处理后得到的种子作为外植体进行组织培养。本发明的方法使用未成熟种子为材料，冷藏打破休眠，机械损伤处理促进种胚萌发得到外植体，后续针对外植体构建了一套快速、大量繁殖出多花黄精小苗的组培体系，可实现多花黄精的工厂化育苗，加快分子育种时代的推进。

Description

一种多花黄精组织培养方法
技术领域
本发明涉及药用植物组织培养领域，尤其涉及一种多花黄精组织培养方法。
背景技术
多花黄精(Polygonatum cyrtonema)为百合科多年生单子叶草本植物，具有极高的药用价值，传统中医认为其具有补脾，补精气，壮筋骨，益精髓，润肺生津的作用。现代医学研究表明黄精具有抗衰老，抗肿瘤，降血脂，降血脂等功效。随着黄精药用价值和经济价值的不断开发，野生黄精被掠夺性采挖，导致野生黄精资源日益稀少，严重制约了多花黄精的开发利用。单靠采挖野生资源这一种方式，已远不能满足国内外市场的需求，加之多花黄精自身的生长特点，野生资源恢复困难，在很大程度上对生物多样性造成破坏。
目前，多花黄精的繁殖方法主要有无性繁殖和有性繁殖两种，即根状茎繁殖和种子繁殖。种子繁殖存在着采集难度大、发芽率低、育苗周期长(一般三年育苗移栽)等问题。所以在当前的人工栽培中，繁殖主要依靠根茎的无性繁殖，但该方法也存在着很多缺点，例如：繁殖系数低、根茎用量大和多次繁殖容易积累病毒等，而组织培养既能实现快速大量繁殖，又能较好地保持优良性状，可实现多花黄精的工厂化育苗，加快分子育种时代的推进。
现如今已有多例关于多花黄精组织培养的研究的报道，但仅有少数几例有构建完整的组织培养体系，且他们的研究多以多花黄精成熟种子或根状茎作为启动材料，用来培养无菌苗。以成熟种子进行组织培养的技术缺陷主要集中在发芽时间长、愈伤组织诱导困难、特定植物激素不能经过高压蒸汽灭菌、不定芽生长势弱、后代性状分化严重等。而以多花黄精根状茎进行组织培养的技术缺陷则主要集中在消毒困难、实验难以重复、随继代次数的增加生长势降低等问题。
发明内容
本发明针对多花黄精组培中存在的问题，通过利用未成熟的多花黄精果实中的未成熟种子作为外植体，对其进行机械损伤处理后进行组培生根成苗，提供了一种优质、高效的多花黄精组培方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种多花黄精组织培养方法，所述方法包括以多花黄精未成熟种子经冷藏和机械损伤处理后得到的种子作为外植体进行组织培养。
上述方法中，所述未成熟种子从花凋谢后50-70天采摘的多花黄精未成熟果实中收集，此时多花黄精未成熟果实的果皮绿色，果实直径8-9毫米。
上述方法中，所述机械损伤处理为切除种脐周围部分组织。
上述方法中，所述机械损伤处理具体为在种脐往上1mm处切除切包含种脐在内的部分组织。
上述方法中，所述冷藏为4℃冷藏5天，目的是打破休眠。
上述方法中，所述方法还包括如下步骤：将外植体接种到初代培养基上培养得到带芽小球茎；将所述带芽小球茎接种到继代培养基上培养至获得大量带不定芽的愈伤组织；将所述带不定芽先后接种到不定芽增殖培养基和/或壮苗培养基上增殖获得多花黄精无根苗；
所述初代培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述初代培养基中6-BA的含量为2.0-3.0mg/L、2,4-D的含量为1.0-1.5mg/L；
所述继代培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、NAA、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述继代培养基中6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.1mg/L；
所述不定芽增殖培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、TDZ、NAA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述不定芽增殖培养基中6-BA的含量为1.5mg/L、TDZ的含量为0.5mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L；
所述壮苗培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述壮苗培养基中6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为0.15mg/L。
上述方法中，所述初代培养基具体可为初代培养基1或初代培养基2；所述初代培养基1中6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L；所述初代培养基2中6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.5mg/L。
上述方法中，所述方法还包括将多花黄精无根苗接种到生根培养基上进行生根培养得到多花黄精生根苗的步骤，所述生根培养基为向1/2MS基本培养基中添加IBA、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述生根培养基中IBA的含量为1.0mg/L。
所述初代培养基、所述继代培养基、所述不定芽增殖培养基、所述壮苗培养基的pH值均为6.1±0.1，所述生根培养基的pH值为6.1±0.1。
所述凝固剂为琼脂，所述初代培养基、所述继代培养基、所述不定芽增殖培养基、所述壮苗培养基中，琼脂的含量为7-9g/L；所述生根培养基中，琼脂的含量为7-9g/L。
获取所述外植体包括消毒的步骤。
所述得到带芽小球茎，需暗培养5天后再于光照时长14h/d条件下培养25-35天，可为30天。
所述得到不定芽，需培养25-35天，可为30天。
所述获得多花黄精无根苗，需先后在不定芽增殖培养基和壮苗培养基上各培养25-35天，可为30天。
所述得到多花黄精生根苗，需培养25-35天，可为30天。
本发明的多花黄精组织培养方法，还包括将多花黄精生根苗炼苗后移栽定植。
本发明以7月中旬未成熟种子作为启动材料，具有实验操作简单不繁琐(所用植物激素均能高压蒸汽灭菌)、打破休眠和消毒方式简单、种子萌发速度快、培养过程中生长势强等优点。在初代培养时带芽小球茎诱导率高、诱导速度快，在继代培养时实现愈伤组织的大量增殖和数量可观的不定芽生出，在不定芽的增殖与壮苗培养过程中均能实现百分之百增殖壮苗效果，整根无菌体系在不考虑增殖的情况下三到四个月即可建立完整的组织快繁体系，在考虑增殖生长的情况下六个月就能获得大量无菌苗，因此本发明可以为多花黄精的工厂化育苗提供理论与技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1中机械损伤处理示意图。
图2为本发明实施例1中初代培养基的培养后的照片。其中，图2的A为培养25天时的整体照片，图2的B为培养25天时的局部照片，图2的C和图2的D均为初代培养50天时诱导得到的带芽小球茎显微摄影图。
图3为本发明实施例1中继代培养基的培养后的照片。其中，图3的A和图3的B均为继代产生带有不定芽的愈伤组织，图3的C为继代产生的愈伤组织，图3的D为为带芽愈伤组织与愈伤组织单个细节图。
图4为本发明实施例1中不定芽诱导培养后的照片。其中，图4的A为不定芽增殖培养基培养30天的产物，图4的B为壮苗培养基培养30天的产物。
图5为本发明实施例1中生根培养后的照片。其中，图5的A为不定根在瓶内生长的照片，图5的B为移栽前组培苗整体照片，图5的C和图5的D均为不定根在瓶内生长的俯拍照片。
图6为本发明实施例1中移栽成活的多花黄精组培苗。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的所有培养基均按照常规方法配置，且经过116℃高压蒸汽灭菌30分钟，pH值使用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节至6.1±0.1。苗基质需经过121℃条件下灭菌20分钟。所涉及培养皿均为一次性无菌培养皿。
下述实施例中所用培养基、植物激素、琼脂均购于索莱宝生物科技有限公司。培养基所用植物激素缩写与全名对照表见表1。
表1所用植物激素缩写与全名对照表
缩写 全名
6-BA 6-苄氨基腺嘌呤
NAA 萘乙酸
2,4-D 2,4-二氯苯氧乙酸
TDZ 噻苯隆
IBA 吲哚丁酸
下述实施例中所使用LED光源为杭州茉钡特生物科技有限公司产品。
实施例1
多花黄精组培方法具体如下：
S1、打破休眠、消毒、机械损伤处理
S1-1、打破休眠：在湖南省怀化市雪峰山采集野生多花黄精，野生多花黄精5月中旬花凋谢，7月中旬采摘未成熟的多花黄精果实，此时多花黄精未成熟果实的果皮绿色，果实直径8-9毫米，4℃冷藏5天，打破休眠。
S1-2、消毒：打破休眠后的多花黄精果实使用5％的洗洁精清洗5分钟，清水冲洗5分钟，沥干水分后转移至超净工作台，使用75％酒精消毒30秒，将果实倒入无菌小烧杯中，用无菌水冲洗一次，然后使用0.1％HgCl2消毒20分钟，无菌水冲洗3～5次。
S1-3、机械损伤处理：用无菌手术刀取果实内种子，找到种脐，在种脐以上1mm处切除切除包含种脐在内的部分(具体见图1，虚线处为切割位点，切去虚线以下包含有种脐的部分)，更有利于植物激素进入外植体内刺激种胚萌发，加快启动培养的进程。
S2、初代培养
设置6种初代培养基，A1、A2、A2、A4、A5和A6，具体如下：
A1(1/2MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A1为以1/2MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.0mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A1的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解2.3g的1/2MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，Lot No.104P031，Cat#M8526)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，115℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A1。
A2(1/2MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A2为以1/2MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A2的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解2.3g的1/2MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为1.0mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，115℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A2。
A3(1/2MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A3为以1/2MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A3的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解2.3g的1/2MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为1.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，115℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A3。
A4(MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A4为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.0mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A4的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A4。
A5(MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A5为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A5的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐(Solarbio公司产品，Lot No.926O031，Cat#M8521)、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为1.0mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A5。
A6(MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：A6为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。A6的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为1.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到初代培养基A6。
将步骤S1处理好的种子在无菌条件下分别接种于装有上述初代培养基A1、A2、A2、A4、A5或A6的培养皿中，接种时应注意不要戳破培养基表面，轻轻放在培养基表面即可。每种培养基接种8个培养皿，每个培养皿接种5颗种子，即每种培养基每重复接种40颗种子，3次重复。
先置于26±1℃条件下暗培养5天，后置于26±1℃，光照强度2500～3000LX，光照时长14h/d条件下培养。培养第8天(包括了暗培养的5天)，就可以看到种胚萌发，培养25天时的照片见图2的A和图2的B，培养50天时诱导得到的带芽小球茎显微摄影图见图2的C和图2的D，在培养25天时统计诱导率。
诱导率＝(小球茎数+愈伤组织数)/接种个数
表1
培养基 基础培养基 6-BAmg/L 2,4-Dmg/L 诱导率/％
A1 1/2MS 1.0 0.5 37.50±5.00D
A2 1/2MS 2.0 1.0 61.67±5.20C
A3 1/2MS 3.0 1.5 77.50±6.61B
A4 MS 1.0 0.5 41.67±6.29D
A5 MS 2.0 1.0 90.83±3.82A
A6 MS 3.0 1.5 95.83±5.20A
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。
结果见表1，表明A5和A6两种初代培养基的诱导率均高于90％。
S3、继代培养
将S2中以初代培养基培养得到的带芽小球茎在无菌条件下接种于继代培养基上，接种时应注意不要戳破培养基表面，轻轻放在培养基表面即可。
继代培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：继代培养基为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.1mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。继代培养基的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为0.1mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭菌完成后趁热在超净台中分装于一次性无菌培养皿中，待其冷却，得到继代培养基。
置于26±1℃，光照强度2500～3000LX，光照时长14h/d的条件下培养。只需一个月就能实现带不定芽的愈伤组织或愈伤组织(不带不定芽织)大量增殖的效果，二次继代即可使所有愈伤组织转变为带不定芽的愈伤组织，具体照片见图3，获得了大量的带不定芽的愈伤组织。
S4、不定芽的增殖与壮苗培养
将步骤S3继代获得的不定芽在无菌条件下接种到不定芽增殖培养基和/或壮苗培养基上，其中不定芽增殖培养基培养获得的大部分苗子可以不经过壮苗就直接生根，壮苗培养基主要是壮苗但同时也能导致不定芽增殖。
不定芽增殖培养基设置B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9和B10共10种，具体如下：
B1(MS+6-BA 0.75mg/L+TDZ 0.75mg/L+NAA 0.25mg/L+2,4-D 0.25mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B1为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为0.75mg/L、TDZ的含量为0.75mg/L、NAA的含量为0.25mg/L、2,4-D的含量为0.25mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B1的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为0.75mg/L的6-BA、最终含量为0.75mg/L的TDZ、最终含量为0.25mg/L的NAA和最终含量为0.25mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B1。
B2(MS+6-BA 1.5mg/L+TDZ 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B2为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.5mg/L、TDZ的含量为0.5mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B2的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.5mg/L的6-BA、最终含量为0.5mg/L的TDZ、最终含量为0.5mg/L的NAA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B2。
B3(MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B3为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.5mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B3的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.5mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B3。
B4(MS+6-BA 1.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B4为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为1.5mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B4的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.5mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B4。
B5(MS+TDZ 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B5为以MS基本培养基为基础培养基，TDZ的含量为1.5mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B5的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.5mg/L的TDZ和最终含量为0.5mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B5。
B6(MS+TDZ 1.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B6为以MS基本培养基为基础培养基，TDZ的含量为1.5mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B6的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.5mg/L的TDZ和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B6。
B7(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B7为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、NAA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B7的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为1.0mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B7。
B8(MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B8为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B8的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为1.0mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B8。
B9(MS+TDZ 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B9为以MS基本培养基为基础培养基，TDZ的含量为3.0mg/L、NAA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B9的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的TDZ和最终含量为1.0mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B9。
B10(MS+TDZ 3.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：B10为以MS基本培养基为基础培养基，TDZ的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。B10的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的TDZ和最终含量为1.0mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到不定芽增殖培养基B10。
将S3获得的不定芽先接种到不定芽增殖培养基B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9或B10上，具体将带不定芽的愈伤组织切成1.0cm3左右带不定芽的小块，尽量保持不定芽完整，每种培养基每重复接种一个培养瓶，每个培养瓶接种一小块，5次重复。
置于26±1℃，光照强度2500～3000LX，光照时长14h/d的条件下培养，诱导培养一个月(30天)后的照片见图4的A，得到增殖的不定芽。统计初始不定芽数量，一个月后继续统计不定芽数量，计算芽增殖系数：
芽增殖系数＝初始不定芽数/接种一月后不定芽数
结果见表2:
表2
Figure BDA0004046569900000101
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)，结果表明，不定芽增殖培养基B2的芽增殖系数最高。
上述不定芽增殖培养基培养得到的不定芽，高度高于3.0cm(含)的直接作为多花黄精无根苗用于生根，高度低于3.0cm(不含)的接种到壮苗培养基上进行壮苗得到高度高于3.0cm(含)的多花黄精无根苗。
壮苗培养基设置C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7和C8共8种，具体如下：
C1(MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C1为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为0.15mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C1的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为0.15mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C1。
C2(MS+6-BA 2.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C2为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C2的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C2。
C3(MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C3为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为0.15mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C3的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为0.15mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C3。
C4(MS+6-BA 3.0mg/L+2,4-D 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C4为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C4的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的2,4-D，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C4。
C5(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C5为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.15mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C5的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为0.15mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C5。
C6(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C6为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C6的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为2.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C6。
C7(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.15mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C7为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、NAA的含量为0.15mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C7的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为0.15mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，灭待其冷却，得到壮苗培养基C7。
C8(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：C8为以MS基本培养基为基础培养基，6-BA的含量为3.0mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。C8的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解4.74g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为3.0mg/L的6-BA和最终含量为0.5mg/L的NAA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到壮苗培养基C8。
将不定芽增殖培养基上培养所得的高度低于3.0cm(不含)的不定芽接种到壮苗培养基上，具体是在无菌条件下将长有不定芽的愈伤组织切割成1.0cm3的小块，尽量避免切坏不定芽，然后将其接种到壮苗培养基上。
每重复每种壮苗培养基接种1个培养瓶，每个培养瓶接种一小块，5次重复。置于26±1℃，光照强度2500～3000LX，光照时长14h/d的条件下培养，增殖培养1个月(30天)后获得无根苗，照片见图4的B。统计初始苗高和接种一个月苗高，计算生长系数：
生长系数＝接种一个月苗高/初始苗高
结果见表3:
表3
培养基 基础培养基 6-BAmg/L 2,4-Dmg/L NAAmg/L 生长系数
C1 MS 2.0 0.15 0 1.29±0.06D
C2 MS 2.0 0.5 0 1.50±0.03CD
C3 MS 3.0 0.15 0 2.08±0.21A
C4 MS 3.0 0.5 0 1.64±0.16BC
C5 MS 2.0 0 0.15 1.36±0.04D
C6 MS 2.0 0 0.5 1.35±0.18D
C7 MS 3.0 0 0.15 1.74±0.19B
C8 MS 3.0 0 0.5 1.44±0.08CD
注：数据分析采用spss软件，Waller-Duncan(W)a,b,c检验显著性，同列数据后不同字母表示差异达显著水平(P<0.05)，结果表明壮苗培养基C3的壮苗效果最佳。
为保持高水平的生长势，将不定芽增殖培养基B2和壮苗培养基C3交替使用可在短期内实现多花黄精无根苗的大量扩增，增殖率可达100％。
S5、生根培养
将步骤S4培养获得的多花黄精无根苗在无菌条件下接种到生根培养基上，具体如下：
生根培养基(1/2MS+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)：生根培养基为以1/2MS基本培养基为基础培养基，IBA的含量为1.0mg/L、蔗糖的含量为30g/L、琼脂的含量为7g/L的培养基。生根培养基的具体配制方法(以1L为例)可为：利用水溶解1.12g的MS培养基基础盐、30g蔗糖和7g琼脂粉，并在其中添加最终含量为1.0mg/L的IBA，加水定容至1L，调pH值至6.1±0.1，分装至20个组培瓶中，116℃高压蒸汽灭菌30分钟，待其冷却，得到生根培养基。
将无根苗在无菌条件下切成分别带有3～6小叶的小块，接种于生根培养基中进行生根培养，每个培养瓶接种一小块。整个生根过程均置于26±1℃，光照强度2500～3000LX，光照时长14h/d的条件下培养。一个月就可得到根系生长发达、生长势旺的生根苗，照片见图5。
S6、移栽
S5得到的生根苗在培养室打开盖子，炼苗3天后用自来水冲洗干净组培苗根部培养基，注意不要损伤根系，然后移栽到花盆中，花盆内装有经过高压蒸汽灭菌后的育苗基质，育苗基质为营养土：珍珠岩＝3:1(V:V)，放置在室外进行育苗。移栽前五天，白天套上透明塑料，晚上揭除，三天浇灌一次MS液体培养基作为营养液，每天浇水保持基质中的水分含量适中。
每个花盆移栽2株。
移栽成活的多花黄精照片见图6。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、含量和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种多花黄精组织培养方法，其特征在于，所述方法为以多花黄精未成熟种子经冷藏和机械损伤处理后得到的种子作为外植体进行组织培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述未成熟种子从花凋谢后50-70天采摘的多花黄精未成熟果实中收集。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述机械损伤处理为切除种脐周围部分组织。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述机械损伤处理具体为在种脐往上1mm处切除切包含种脐在内的部分组织。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述冷藏为4℃冷藏5天。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：将外植体接种到初代培养基上培养得到带芽小球茎；将所述带芽小球茎接种到继代培养基上培养至获得大量带不定芽的愈伤组织；将所述带不定芽先后接种到不定芽增殖培养基和/或壮苗培养基上增殖获得多花黄精无根苗；
所述初代培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述初代培养基中6-BA的含量为2.0-3.0mg/L、2,4-D的含量为1.0-1.5mg/L；
所述继代培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、NAA、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述继代培养基中6-BA的含量为2.0mg/L、NAA的含量为0.1mg/L；
所述不定芽增殖培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、TDZ、NAA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述不定芽增殖培养基中6-BA的含量为1.5mg/L、TDZ的含量为0.5mg/L、NAA的含量为0.5mg/L、2,4-D的含量为0.5mg/L；
所述壮苗培养基为向MS基本培养基中添加6-BA、2,4-D、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述壮苗培养基中6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为0.15mg/L。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述初代培养基为初代培养基1或初代培养基2；所述初代培养基1中6-BA的含量为2.0mg/L、2,4-D的含量为1.0mg/L；所述初代培养基2中6-BA的含量为3.0mg/L、2,4-D的含量为1.5mg/L。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，述方法还包括将多花黄精无根苗接种到生根培养基上进行生根培养得到多花黄精生根苗的步骤，所述生根培养基为向1/2MS基本培养基中添加IBA、蔗糖和凝固剂得到的固体培养基，所述生根培养基中IBA的含量为1.0mg/L。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，获取所述外植体包括消毒的步骤。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述多花黄精生根苗炼苗后移栽定植。
CN202310030159.7A 2023-01-10 2023-01-10 一种多花黄精组织培养方法 Active CN115918544B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310030159.7A CN115918544B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种多花黄精组织培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310030159.7A CN115918544B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种多花黄精组织培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115918544A true CN115918544A (zh) 2023-04-07
CN115918544B CN115918544B (zh) 2023-09-15

Family

ID=86656082

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310030159.7A Active CN115918544B (zh) 2023-01-10 2023-01-10 一种多花黄精组织培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115918544B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104472353A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 广西中医药大学 一种建立黄精快繁殖体系的方法
CN109463238A (zh) * 2018-12-19 2019-03-15 湖南新汇制药股份有限公司 一种黄精块茎的培育方法
CN111264391A (zh) * 2020-03-30 2020-06-12 贵州大学 一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法
JP2022160084A (ja) * 2021-04-06 2022-10-19 懐化学院 黄精の急速繁殖方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104472353A (zh) * 2014-11-21 2015-04-01 广西中医药大学 一种建立黄精快繁殖体系的方法
CN109463238A (zh) * 2018-12-19 2019-03-15 湖南新汇制药股份有限公司 一种黄精块茎的培育方法
CN111264391A (zh) * 2020-03-30 2020-06-12 贵州大学 一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法
JP2022160084A (ja) * 2021-04-06 2022-10-19 懐化学院 黄精の急速繁殖方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
田怀等: "黄精组织培养快繁技术体系建立的研究", 南京师大学报（自然科学版）, vol. 43, no. 03, pages 129 - 135 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115918544B (zh) 2023-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101258835B (zh) 铁皮石斛优质种苗快速繁殖方法
CN106718934B (zh) 一种利用胚轴和胚根直接分化不定芽的白术再生体系
CN109258460A (zh) 微茎尖培养结合热处理获得增城蜜菊脱毒苗的培育方法
CN112237142B (zh) 一种建立中国石蒜或忽地笑再生体系的组培培养基及其方法
WO2021077755A1 (zh) 一种黑老虎带芽茎段的消毒方法及其快速增殖方法
CN112273232A (zh) 温郁金脱毒苗培养方法
CN113519394A (zh) 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法
CN111903515A (zh) 一种‘玉台一号’花瓣愈伤组织的诱导方法
CN105191803B (zh) 一种铁皮石斛组培袋苗生产方法
KR20090120813A (ko) 노랑무늬붓꽃의 잎 절편을 이용한 캘러스의 대량증식방법및 노랑무늬붓꽃의 대량분화방법
CN111869569B (zh) 用于金姜花离体培养的培养体系及其应用
CN105706933A (zh) 一种滁菊株系离体再生的方法
CN110741937B (zh) 一种黄精快速繁殖的方法
CN114467760B (zh) 一种睡莲成熟胚愈伤组织诱导及增殖的方法
CN111328714A (zh) 一种虎舌红愈伤诱导及增殖方法
CN109984035A (zh) 一种建立金钗石斛再生体系的方法
CN115918544B (zh) 一种多花黄精组织培养方法
CN102090336B (zh) 一种杜衡组织培养的繁殖方法
CN108834893B (zh) 一种红根野蚕豆组培快繁新方法
Zhai et al. Shoot multiplication and plant regeneration in Caragana fruticosa (Pall.) Besser
CN106613970A (zh) 黄精叶钩吻的组培快速繁殖方法
CN108450333B (zh) 一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法
CN112753579B (zh) 一种民族药石吊兰叶的离体培养及植株再生的方法
CN116584379B (zh) 化橘红组织培养快速繁殖方法
CN103704132A (zh) 广藿香多倍体的诱导方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant