CN115917322A - 物质固定化用基底、及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的基底的用于对物质进行固定化的表面上形成有物质固定化剂的层，物质固定化剂具有光反应性基，且该物质固定化剂含有水溶性聚合物或经聚合而会成为水溶性聚合物的水溶性单体，物质固定化剂的所述层的厚度在3nm以上且低于500nm的范围内。

Description

物质固定化用基底、及其应用
技术领域
本发明涉及用于对多肽、蛋白质、酶、核酸、脂质等目标物质进行固定化的物质固定化用基底、及其应用。
背景技术
将抗体或抗原固定在板上而成的用于免疫测定的免疫板、或者将核酸固定化在包片上而成的DNA包片等已被广泛采用。
已开发出将蛋白质或核酸固定化在基底上的各种方法。例如，专利文献1记载了将含有要固定化到基底上的物质及物质固定化剂的水溶液涂敷在基底上并进行光照射，从而将该物质固定化在基底上。作为具体记载的物质固定化剂，其含有具有叠氮基等光反应性基的水溶性聚合物。
(现有技术文献)
专利文献1：国际公布第2004/088319号小册子
发明内容
(发明要解决的问题)
关于具有光反应性基且含有水溶性聚合物的物质固定化剂，光反应性基起到将物质固定化在基底上的作用。另外，根据推测，水溶性聚合物起到防止对基底的非特异性吸附等作用。但是，当使用通过如此的物质固定化剂而固定化有物质的基底，来对该物质与试样之间的相互作用进行检测时，成功得到良好信号的所需条件尚不明确，仍有改善余地。
本发明是鉴于所述问题而进行的，本发明的一个目的在于提供一种在与固定化了的物质之间的相互作用的检测上有关的特性得到改善的物质固定化用基底、及其应用。
(用以解决问题的技术手段)
为解决所述课题，本发明包括以下方面。
1)一种基底，该基底的用于对物质进行固定化的表面上，形成有物质固定化剂的层，所述物质固定化剂具有光反应性基，且含有水溶性聚合物或经聚合而可成为水溶性聚合物的水溶性单体，物质固定化剂的所述层的厚度在3nm以上且低于500nm的范围内。
(发明的效果)
根据本发明的一个方面，能够提供使用具有光反应性基且含有水溶性聚合物或水溶性单体的物质固定化剂而得到的、特性改善了的物质固定化用基底、及其应用。
具体实施方式
本发明一实施方式的物质固定化剂的共同点在于：1)具有光反应性基；2)含有水溶性聚合物或经聚合而可成为水溶性聚合物的水溶性单体。
本发明的一个实施方式的物质固定化剂为水溶性，相对于水或含有90质量％水的混合溶剂的、溶解度(溶解在水100g中的克数)优选为5以上。
物质固定化剂所含的水溶性聚合物的分子量优选为5×102～5×106，更优选为7×102～1×106，进而优选为1×103～5×105。
水溶性聚合物例如以溶解在亲水性溶剂中的状态来用作物质固定化剂。作为亲水性溶剂，可举出水、甲醇、乙醇、丙酮、及它们的混合溶剂。水溶性聚合物的浓度并无特别限定，但例如为0.005％～10％左右，优选为0.05％～5％左右。
本发明的一个实施方式的物质固定化剂能够对多种物质进行固定。例如，能够对多种的核酸、蛋白质、生物提取物进行固定，也能够对多克隆抗体及/或单克隆抗体进行固定。
以下，作为物质固定化剂，具体例示物质固定化剂(A)、(B)、(C)及(D)以进行说明。
〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕
关于本发明的一个实施方式的物质固定化剂(A)，所述水溶性聚合物在其1分子中具有至少2个所述光反应性基，并且，所述水溶性聚合物由分子整体为电中性的聚合物构成或者具有含聚氧乙烯构造或聚氧化烯构造的主链。
“分子整体为电中性”的意思是指：不含有会在pH约中性(pH6～8)的水溶液中电离成离子的基团；或者，即使含有会电离的基团，该基团也电离成阳离子及阴离子且两者的电荷合计实质上为0。这里的“实质上”是指：电荷的合计为0，或者即使不为0，也小到不会对本发明的效果产生不良影响。
(水溶性聚合物)
水溶性聚合物的平均1分子中的光反应性基的数量为2个以上，则并无特别限定，相对于水溶性聚合物全体的光反应性基含量优选为2.5摩尔％以上，更优选为5摩尔％以上，进而优选为10摩尔％以上，进而优选为15摩尔％以上，尤其优选为20摩尔％以上。另外，从使水溶性聚合物易溶解于挥发性极性溶剂的观点等来看，相对于水溶性聚合物全体的光反应性基含量优选低于50摩尔％，更优选为45摩尔％以下，进而优选为40摩尔％以下，进而优选为30摩尔％以下。本说明书中，“相对于水溶性聚合物全体的光反应性基含量(摩尔％)”是指，具有光反应性基的重复单元的数量相对于构成水溶性聚合物的重复单元的总数的比例，其以百分率表达。光反应性基可以直接键合在水溶性聚合物的主链上，或者也可以介由任意的间隔构造键合在水溶性聚合物的主链上，通常，从容易制造的观点来看，优选后者。
间隔构造并无任何限定，例如可以举出碳数1～10的亚烷基(其也可以经1个或2个羟基取代)、亚苯基(其也可以经1～3个的碳数1～4烷基或羟基取代)等。
向水溶性聚合物的主链中导入光反应性基的操作，可以根据常规方法容易地进行。或者，水溶性聚合物若是通过单体聚合而形成的诸如水溶性乙烯系高分子，则还可以将作为水溶性乙烯系高分子中主要构成单元的乙烯系单体，与光反应性乙烯系单体共聚，从而制造具有光反应性基的非离子性水溶性高分子。关于通过该方法获得的光反应性水溶性乙烯系高分子的优选例子，可举出聚((甲基)丙烯酰胺－光反应性(甲基)丙烯酰胺)共聚物、聚((甲基)丙烯酸缩水甘油酯－光反应性(甲基)丙烯酰胺)共聚物、及聚(乙二醇单(甲基)丙烯酸酯－光反应性丙烯酰胺)共聚物等。关于物质固定化剂(A)，国际公布第2004/088319号小册子(日本国专利4630817号)中记载了其一例，可以适当援引该记载。
作为聚合性基，例如可举出具有双键或三键的基团(例如，(甲基)丙烯酸酯基、乙烯基、丙烯基、丙烯酰基、甲基丙烯酰氧基、甲基丙烯酰胺基、丙烯酰氧基、丙烯酰胺基、苯乙烯氧基、苯乙烯酰胺基等)。水溶性单体在其1分子中例如可以含有1～3个、优选1～2个聚合性基。
(水溶性聚合物的主链)
水溶性聚合物的主链含有聚氧乙烯构造(－C－C－O－重复构造)，因此水溶性聚合物的主链是亲水性的。通过具有亲水性的主链，即使相较于以往水溶性聚合物具有更多的疏水性光反应性基，也可以保持其水溶性的性质。因此，如果将该水溶性聚合物溶解在水或亲水性溶剂(例如，甲醇及乙醇等低级醇)中来作为物质固定化剂使用，则可以相对提高该物质固定化剂中所能够包含的光反应性基的量(浓度)。通过使水溶性聚合物具有更多的光反应性基，便可以增加能够与要固定化的物质进行共价键合的部位(交联点)。因此，要固定化的物质可以更牢固地固定化在基底上，从而可以提高对该物质的检测灵敏度。
所述水溶性聚合物的主链优选含有式(1)所示的构造及式(2)所示的构造作为重复单元。另外，所述水溶性聚合物的主链的重复单元也可以是式(3)所示的构造及式(4)所示的构造。
－(R1－R12)－····(1)
－(R2－R12)－····(2)
－(R1－R12－O)－····(3)
－(R2－R12－O)－····(4)
式(1)及(3)中，R1为含有光反应性基的基团，
式(2)及(4)中，R2为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基、及它们组合在内的化学构造的基团，或为氢原子，
式(1)、(2)、(3)、(4)表达的主链中的碳原子上键合的氢原子也可以彼此独立地被选自如下群族的取代基所取代：卤素原子(例如氟原子、氯原子、溴原子、碘原子)、碳数1～4的烷基、及碳数1～4的卤代烷基(卤素原子的例示与上述相同)。
另外，关于后文中的卤素原子及碳数1～4的卤代烷基，如无特别说明，则其定义与前述相同。
(关于R1)
R1为含有光反应性基的基。作为光反应性基，例如，可举出叠氮基、乙酰基、苯甲酰基、重氮基、二氮丙啶基、酮基、及醌基等。R1优选是含有选自乙酰基、苯甲酰基、叠氮基(以－N3表达的基团)及二氮丙啶基(双氮丙环基/diaziridinyl：具有由1个碳原子与彼此双键键合的2个氮原子进行键合而形成的三元环构造，其中该碳原子具有空余键。)的光反应性基的基团，更优选是含有选自叠氮基及二氮丙啶基的光反应性基的基团，进而优选是含有选自芳香族叠氮基及芳香族二氮丙啶基的光反应性基的基团。作为芳香族叠氮基及芳香族二氮丙啶基，例如可举出经取代或非取代的苯基叠氮基、及经取代或非取代的苯基二氮丙啶基。如上所述，式(1)及(3)中的氢原子(可以是R1所具有的氢原子)可以被取代基所取代。作为取代基的例子，可举出卤素原子、碳数1～4的烷基、及碳数1～4的卤代烷基。
在一个实施方式中，R1是－R3R4，R3是主链中包含碳原子的连接子，R4是叠氮基或二氮丙啶基。在其他实施方式中，R3是主链中包含碳原子及杂原子的连接子。R3中含有杂原子，则例如可以有助于1)提高亲水性，2)抑制源自生物的试样等的非特异性吸附。构成连接子主链的原子数量并无特别限定，例如为1～20，优选为1～10，例如为1～6。作为杂原子的例子，可以举出氧原子、氮原子、硫原子、硅原子、及磷原子等，优选选自氧原子及氮原子。连接子的主链中含有杂原子时，杂原子的数量并无特别限定，例如为1～3，1～2。
在更具体的一例中，R3是具有包括醚基(－(CH2)n1－O－(CH2)n2－)、酰胺基(－NH－C(O)－)、亚烷基、及它们组合在内的化学构造的连接子。作为R3，例如可举出：*－NH－C(O)－；*－C(O)－NH－(CH2)n－NH－C(O)－；*－(CH2)n1－O－(CH2)n2－；等。另外，*代表与R4的键合键。这里，n、n1、及n2彼此独立地例如为1～5的整数，1～3或1～2的整数。氢原子也可以彼此独立地被选自卤素原子、碳数1～4的烷基、及碳数1～4的卤代烷基的取代基所取代。
作为R1的具体例子，可以举出以下所示的基团。以下的基团中将氟原子取代为了其他卤素原子后的化合物、将苯环上的至少一部分(1～4个)氢原子取代为了卤素原子后的化合物等，也是优选的基团的一例。
〔化1〕
Figure BDA0004001967630000061
(关于R2)
R2是具有包括两性离子性基、酰胺基(－NH－C(O)－)、聚氧化烯基(优选为聚氧乙烯基)、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团，或是氢原子。式(2)及(4)中的氢原子(可以是R2所具有的氢原子)也可以被取代基所取代。作为取代基的例子，可举出卤素原子、碳数1～4的烷基、及碳数1～4的卤代烷基。另外，若所述酰胺基构成内酰胺环的一部分，并且该内酰胺环的氮原子与式(2)及(4)中的碳原子键合着，则酰胺基中不存在氢原子。这些基团能有助于1)提高亲水性，2)抑制源自生物的试样等的非特异性吸附。作为水溶性官能基的例子，可举出磺基、羧基、羟基等。
R2(非特异相互作用抑制基)可以直接键合在水溶性聚合物的主链上，也可以介由任意的间隔构造来键合在水溶性聚合物的主链上，通常，从容易制造等观点来看，优选后者。
(关于R12)
R12为单键、碳数1～10的亚烷基(其也可以经1个或2个羟基取代)、亚苯基(其也可以经1～3个的碳数1～4烷基或羟基取代)。
从抑制源自生物的试样等的非特异性吸附的观点来看，关于两性离子性基，其优选具有磺酸甜菜碱类构造、磷酸甜菜碱类构造、或咪唑甜菜碱类构造。
磺酸甜菜碱类构造典型地指：含有－SO3 －及具有正电荷的原子，它们在两性离子性基中不位于相邻的位置(即隔着其他原子)，且具有正电荷的该原子上未键合有能够脱离的氢原子。具有正电荷的原子例如取季铵构造的氮原子。磺酸甜菜碱类构造的一例是－(CH2)n－N+(R)2－(CH2)n－SO3 －，式中的R彼此独立地为碳数1～4的烷基，n彼此独立地为1～5(优选为1～3)的整数。
磷酸甜菜碱类构造典型地指：含有磷酸二酯键(一方的酯的氧原子具有负电荷)、及具有正电荷的原子，它们在两性离子性基中不位于相邻的位置(即隔着其他原子)，且具有正电荷的该原子上未键合有能够脱离的氢原子。具有正电荷的原子例如是取季铵构造的氮原子。磷酸甜菜碱类构造的一例是－R11－PO4 －－(CH2)n－N+(R)3，式中的R彼此独立地碳数1～4的烷基，n为1～5(优选为1～3)的整数。－PO4 －－表示磷酸二酯键。另外，式中的R11为(CH2)n1、单键、或碳数1～10的亚烷基(且也可以经1个或2个羟基取代)，n1为1～5(优选为1～3)的整数。
作为磷酸甜菜碱类构造的例子，可举出源自2－甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、2－丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、N－(2－甲基丙烯酰胺)乙基磷酸胆碱、4－甲基丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱、6－甲基丙烯酰氧基己基磷酸胆碱、10－甲基丙烯酰氧基癸基磷酸胆碱、ω－甲基丙烯酰二氧乙撑磷酸胆碱或4－苯乙烯氧基丁基磷酸胆碱的(即由这些胆碱单元聚合而成的)单元。这些之中，尤其优选源自2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的单元。
咪唑甜菜碱类构造典型地指：含有具有负电荷的原子、以及咪唑环，其中，该咪唑环的某1个氮原子具有正电荷，具有负电荷的原子和该咪唑环在两性离子性基中不位于相邻的位置(即隔着其他原子)，且具有正电荷的氮原子上未键合有能够脱离的氢原子。具有负电荷的原子例如是取羧基构造的氧原子。咪唑甜菜碱类构造的一例是－(CH2)n－HC(COO－)－(CH2)n－(IM)，式中的(CH2)n虽记作(CH2)n，但n个基中的某一个也可以是(NH)，n彼此独立地为1～5(优选为1～3)的整数。式中的(IM)是咪唑环，其某1个氮原子具有正电荷，咪唑环上的碳原子上与(CH2)n－键合着。
磺酸甜菜碱类构造、磷酸甜菜碱类构造、或咪唑甜菜碱类构造含有磷酸胆碱基。本发明中的含磷酸胆碱的聚合物是基于如下技术观点而得出的：生物膜虽然会与各种物质接触，但几乎不发生非特异性吸附，于是着眼于这一点，利用含有作为生物膜构成成分的磷酸胆碱的高分子，将预期物质固定化在基底上，从而应该能够有效防止非特异性吸附。
R2可包括含氮的杂环构造。作为含氮的杂环构造，例如可举出咪唑环、吡咯烷酮环、吡咯环、吡啶环、嘧啶环、及内酰胺环(γ内酰胺环、δ内酰胺环等)等。
另外，R2优选包含式(5)或(6)所示的构造。
－C(O)－R5···(5)
－C(O)－OR5···(6)
式(5)及(6)中，R5为所述两性离子性基、咪唑基、聚氧化烯基、或者水溶性官能基。聚氧化烯基尤其优选为聚氧乙烯基(－(C2H4O)n－H)。n例如为1以上的整数，优选为10～1000而分子量为数百～数万。
作为R2的具体例子，可举出以下所示的基团。式中的n例如为1以上，优选为10～1000而分子量为数百～数万。
〔化2〕
Figure BDA0004001967630000081
(式(3)所示构造与式(4)所示构造的优选组合的示例)
·组合的例示＜1＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为主链上含有碳原子的连接子，R4为叠氮基或二氮丙啶基，式(4)中，R2为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团，或为氢原子。
·组合的例示＜2＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为主链上含有碳原子的连接子，R4为叠氮基或二氮丙啶基，式(4)中，R2含有式(5)所示的构造、或者式(6)所示的构造，R5为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团。
·组合的例示＜3＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为主链上含有碳原子及杂原子的连接子，式(4)中，R2为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团，或为氢原子。
·组合的例示＜4＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为主链上含有碳原子及杂原子的连接子，式(4)中，R2含有式(5)所示的构造、或者式(6)所示的构造，R5为具有包括两性离子性基、咪唑基、酰胺基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团。
·组合的例示＜5＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为具有包括醚基、酰胺基、亚烷基、及它们组合在内的化学构造的连接子，式(4)中，R2为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团，或为氢原子。
·组合的例示＜6＞：式(3)中，R1为－R3R4，R3为具有包括醚基、酰胺基、亚烷基、及它们组合在内的化学构造的连接子，式(4)中，R2含有式(5)所示的构造、或者式(6)所示的构造，R5为具有包括两性离子性基、酰胺基、咪唑基、聚氧化烯基、水溶性官能基及它们组合在内的化学构造的基团。
另外，关于本发明中使用的水溶性聚合物，作为优选例，可举出1分子中具有至少2个光反应性基的非离子性水溶性高分子(聚合物)。
这里，“非离子性”是意思指：其实质上不具有会在pH约中性(pH6～8)的水溶液中电离成离子的基团。这里，“实质上”是指完全不含有这样的基团，或者即使含有这样的基团，其也为微量程度而不会对本发明的效果造成不良影响(例如，这样的基团的数量为碳数的1％以下)。
作为这样的非离子性水溶性高分子的优选例，可举出但不限于聚乙二醇(PEG)及聚丙二醇等聚亚烷基二醇；以及以下列单体单元或它们的混合物为构成成分的非离子性乙烯系高分子等：乙烯醇、甲基乙烯基醚、乙烯基吡咯烷酮、乙烯基恶唑烷酮、乙烯基甲基恶唑烷酮、N－乙烯基琥珀酰亚胺、N－乙烯基甲酰胺、N－乙烯基－N－甲基甲酰胺、N－乙烯基乙酰胺、N－乙烯基－N－甲基乙酰胺、丙烯酸2－羟基乙基甲酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、N，N－二甲基丙烯酰胺、N－异丙基丙烯酰胺、二丙酮丙烯酰胺、羟甲基丙烯酰胺、丙烯酰吗啉、丙烯酰吡咯烷、丙烯酰哌啶、苯乙烯、氯甲基苯乙烯、溴甲基苯乙烯、乙酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸丁酯、氰基丙烯酸甲酯、氰基丙烯酸乙酯、氰基丙烯酸正丙酯、氰基丙烯酸异丙酯、氰基丙烯酸正丁酯、氰基丙烯酸异丁酯、氰基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙基乙烯基醚、正丙基乙烯基醚、异丙基乙烯基醚、正丁基乙烯基醚、异丁基乙烯基醚、叔丁基乙烯基醚等。
这些之中，尤其优选聚乙二醇、聚(甲基)丙烯酰胺及聚(甲基)丙烯酸缩水甘油酯。这些之中，尤其优选聚乙二醇，更优选具有最优效果的、在疏水性主链上带有亲水性侧链的(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯这类乙烯基聚合物。本说明书中，“(甲基)丙烯酸”指的是“甲基丙烯酸”或“丙烯酸”，而“(甲基)丙烯酸酯”指的是丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯。
作为优选的水溶性聚合物的例子，可举出包括以下式(7)及(8)所示构造的水溶性聚合物。
〔化3〕
Figure BDA0004001967630000101
〔化4〕
Figure BDA0004001967630000111
式(7)中，m是10以上1000以下的整数，n是10以上1000以下的整数。
式(8)中，p是10以上1000以下的整数，q是10以上1000以下的整数，r是10以上1000以下的整数，s是10以上1000以下的整数。
另外，作为水溶性聚合物的优选例，可举出下述通式[I]所示的化合物。
〔化5〕
Figure BDA0004001967630000112
(式中，X’、Y’、R1、R2代表的含义与前述的定义相同，n及m彼此独立地为2以上的整数，并且n大于m，包含X’的单元、以及包含Y’的单元以顺序随机的方式键合。)
在所述通式[I]所示的化合物群中，尤其优选下述式[II]所示的聚合物。
〔化6〕
Figure BDA0004001967630000121
(n’表示50～200的整数，m’表示5～40的整数，含磷酸胆碱的单元、以及含叠氮苯基的单元以顺序随机的方式键合)。
所述水溶性聚合物可以根据本领域技术人员的技术常识容易地实施，在下述的实施例中也具体记载了其一例。
(重复单元的数量)
式(2)所示构造的重复单元的数量优选大于式(1)所示构造的重复单元的数量。另外，式(4)所示构造的重复单元的数量优选大于式(3)所示构造的重复单元的数量。从能够有效防止非特异性吸附的观点来看，式(1)或式(3)所示构造的重复单元的数量优选为5～50，更优选为10～40，进而优选为20～30。另外，式(2)或式(4)所示构造的重复单元的数量优选为50～200，更优选为75～175，进而优选为100～150。
水溶性聚合物更优选为仅由式(1)所示构造及式(2)所示构造所构成的聚合物、或者仅由式(3)所示构造及式(4)所示构造所构成的聚合物，在不对本发明的效果造成不良影响的范围内，也可以含有源自聚合性单体的其他单元。这样的其他单元的比例并无特别限定，只要在不对本发明的效果产生不利影响的范围内即可，通常，其在聚合物中的所有单元中占30摩尔％以下，优选占10摩尔％以下。
物质固定化剂(A)可以通过公知的方法制备。例如，关于物质固定化剂(A)，在日本特开2020－132803号公报中也记载了其一例，可以适当参考该记载。
〔1－2.物质固定化剂(B)的一例〕
本发明的其他实施方式的物质固定化剂(B)包括：1分子中具有至少2个光反应性基的、水溶性合成高分子或水溶性天然高分子衍生物等。光反应性基的例子与“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目中记载的光反应性基的例子相同。
作为水溶性合成高分子，可举出聚丙烯酸及其衍生物、聚乙烯醇及其衍生物等。另外，如“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目所示，作为水溶性合成高分子的例子，还可以举出具有亲水性侧链(例如，具有化学反应性的羧酸基、氨基、羟基、卤素)的高分子。可以采用公知的化学反应在这些高分子中导入光反应性基。迄今为止，已经报告了在聚丙烯酸中导入了光反应性基的实例：Biomaterials,24,3021-6(2003)。还有，已经报告了在聚乙烯醇中导入了光反应性基的实例：由2-(2-(4-azidophenyl)vinyl)-4-(3-pyridylmethylene)-1,3-oxazolin-5-on合成的2-(3-(4-azidophenyl)prop-2-enoylamino)-N-(4,4-dimethoxy-butyl)-3-(3-pyridy l)prop-2-enamide；Biomaterials,26,211-216(2005)。
向水溶性聚合物的主链中导入光反应性基的手法，可以根据常规方法容易地进行。例如，可以使具有官能团的水溶性聚合物，与具有可与该官能团反应的官能团的叠氮化合物反应，从而使叠氮基与水溶性聚合物键合。在将聚乙二醇用作水溶性聚合物的情况下，由于两末端具有氨基或羧基的聚乙二醇已有市售品，因此可以使含叠氮基的化合物与这类市售的含官能团的聚乙二醇的官能团反应，从而使叠氮基与聚乙二醇键合。在下述实施例中也具体记载了多个这样的方法。
作为水溶性天然高分子，可以列举但不限于：明胶、酪蛋白、胶原、阿拉伯树胶、黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶、普鲁兰多糖、果胶、海藻酸钠、透明质酸、壳聚糖、壳多糖衍生物、卡拉胶、淀粉类(羧甲基淀粉、醛淀粉)、糊精、环糊精等天然高分子、甲基纤维素、粘胶、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素等水溶性纤维素衍生物等天然高分子。迄今为止，作为向多糖(透明质酸)中导入光反应性基的例子，报告了使用水溶性碳二亚胺，并将透明质酸通过酰胺基与叠氮苯胺偶联的例子：Macromol.Res.,21,216-220(2013)。另外，也报告了向同为多糖的普鲁兰中导入光反应性基的例子：Biomaterials,26,2401-2406(2005)。作为向明胶中导入光反应性基的例子，报告了将叠氮苯甲酸活化来形成为酯，从而通过酰胺基与明胶偶联的合成例：Biotechnol.Bioeng.,2011Oct；108(10):2468-76(2011)。介由这些水溶性高分子的羧酸基、氨基、羟基或硫醇基，或通过导入它们，将市售的化学反应性的光反应性交联剂(例如Thermo Fisher Scientific公司制造)以公知的方式修饰到水溶性高分子，从而能够得到物质固定化剂。
〔1－3.物质固定化剂(C)的一例〕
本发明的其他实施方式的物质固定化剂(C)含有：1分子中具有至少2个光反应性基的光交联剂、以及分子整体为电中性的水溶性聚合物。这里，“分子整体为电中性”的定义与“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目中叙述的定义相同。
光交联剂1分子中所含的光反应性基的数量例如为2～4个，优选为2～3个。作为光交联剂所具有的光反应性基的优选例子，可举出叠氮基(－N3)或二氮丙啶，但不限定于此。作为光交联剂，优选具有2个叠氮基的二叠氮化合物或二氮丙啶化合物，尤其优选水溶性二叠氮化合物或水溶性二氮丙啶化合物。作为本发明中使用的光交联剂的优选例子，可举出下述通式[III]所示的二叠氮化合物或下述通式[IV]的双二氮丙啶化合物。
〔化7〕
Figure BDA0004001967630000141
〔化8〕
Figure BDA0004001967630000142
在通式[III]及[IV]中，R表示单键或任意基团。－R－只要是用来连接至少2个光反应性基的构造，则无特别限定。光反应性基的例子与“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目中记载的光反应性基的例子相同。作为优选的－R－的例子，可举出：单键(即2个苯基叠氮基直接相互连接)；碳数1～6的亚烷基(可含有1个或2个的碳-碳不饱和键，或1个或2个碳原子也可以与氧双键键合而构成羰基，尤其优选为亚甲基)；－CH2－、－O－、－SO2－、－S－S－、－S－、－R2···Y···R3－，其中，···表示单键或双键，Y为碳数3～8的亚环烷基，R2及R3彼此独立地为碳数1～6的亚烷基(可含有1个或2个的碳-碳不饱和键，或该亚烷基的基端碳原子与Y之间的键可以是双键)，1个或2个碳原子可以与氧双键键合而构成羰基，亚环烷基可以经1个或2个以上的任意取代基所取代(若经取代，则作为优选，构成亚环烷基的碳原子当中，有1个或2个碳原子与氧双键键合而构成羰基，及/或该碳原子被1个或2个的碳数1～6烷基所取代)。另外，通式[II]中，各苯环可以经1个或2个以上的任意取代基(优选卤素、碳数1～4的烷氧基、磺酸或其盐等亲水性基)所取代。另外，也可以换成聚氧乙烯等中分子量聚合物。另外，作为优选的－R－的具体例子，可以例示如下：
通式[IV]中，R的定义与通式[III]的R的定义相同。R31是F或CF3。
本发明的一个实施方式中使用的光交联剂之中，尤其优选水溶性的光交联剂。光交联剂的“水溶性”是指其可以实现0.5mM以上、优选2mM以上浓度的水溶液。
光交联剂在使用时的浓度(与被固定化物质混合前的浓度)并无特别限定，优选1μM～2mM，进而优选0.01mM～0.5mM。另外，相对于水溶性聚合物的光交联剂添加量并无特别限定，优选0.1～50重量％，尤其为1～30重量％，进而为1～10重量％。
作为水溶性聚合物的优选例子，可举出非离子性水溶性聚合物。非离子性水溶性聚合物等的优选水溶性聚合物例子等与“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目中的叙述相同。
在使用具有亲水性基及疏水性基这两者的化合物来作为光交联剂的情况下，为了防止胶束化，水溶性聚合物优选含有：具有磷酸甜菜碱类构造的单元、及源自诸如(甲基)丙烯酸烷基酯(烷基部分的碳数优选为3～6)这种兼具亲水性基及疏水性基(烷基酯部分)的单体的构造单元。另外，也可以混合具有多个如“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕栏目或“〔1－2.物质固定化剂(B)的一例〕”栏目中所举出的光反应性基的水溶性高分子。
关于物质固定化剂(C)，国际公布第2005/111618号小册子中也记载了其一例，可以适当援引该记载。
〔1－4.物质固定化剂(D)的一例〕
本发明其他实施方式的物质固定化剂(D)含有：分子整体为电中性且具有聚合性基的水溶性单体(以下也简称为“水溶性单体”、“单体”)、光聚合引发剂、及1分子中具有至少2个光反应性基的光交联剂。这里，“分子整体为电中性”的定义与“〔1－1.物质固定化剂(A)的一例〕”栏目中叙述的定义相同。
本发明的一个实施方式的物质固定化剂通过接受光照射，能够发生(1)单体的聚合、(2)光交联剂所含光反应性基的自由基化这两种反应。由此，通过单体的聚合而形成聚合物，并且所形成的聚合物与基底介由光交联剂而结合，聚合物与被固定化物质也介由光交联剂而结合，结果是能够将被固定化物质固定化在基底上。另外，本发明的物质固定化剂中所含的单体在分子整体上为电中性，因此通过该单体的聚合，能够在基底上形成电中性的聚合物。如此形成的聚合物可以在基底上发挥防止非特异性吸附的效果。因此，根据本发明，可以在防止非特异性吸附的同时将预期物质固定化在基底上。关于将物质固定化在基底上的方法，将在后文进行详细描述。
以下，对本发明的一个实施方式的物质固定化剂所含的单体、光聚合引发剂、光交联剂进行说明。
(水溶性单体)
分子整体为电中性的单体可以是双极性或非离子性单体。这里，双极性的意思是指：其具有在pH约中性(例如pH6～8)的水溶液中会电离成阳离子的基团和会电离成阴离子的基团，从而单体1分子的电荷的合计实质上为0。另外，“非离子性”的定义与“〔1－2.物质固定化剂(B)的一例〕”栏目中记载的定义同义。其中，非离子性单体具有优异的防止非特异性吸附的效果，且具有可廉价地制造或获得的优点。
水溶性单体具体例如是在“〔1－2.物质固定化剂(B)的一例〕”栏目中作为非离子性水溶性高分子之优选单体所列举的单体。
另外，作为水溶性单体的优选例子，可举出具有“〔1－2.物质固定化剂(B)的一例〕”栏目中述及的通式[I]所示构造的、含磷酰基的双极性单体。
本发明的一个实施方式的物质固定化剂中的水溶性单体的浓度可以为0.0001～10质量％，优选为0.001～1质量％。
(光聚合引发剂)
本发明的一个实施方式的物质固定化剂(D)含有水溶性单体及光聚合引发剂。通过光照射，例如通过紫外线照射的能量，光聚合引发剂会产生自由基(活性种)，其与单体的聚合性基反应而引发聚合。作为光聚合引发剂，可以使用二苯酮系、苯偶姻系、苯乙酮系、噻吨酮系光聚合引发剂。由于紫外线吸收特性、反应开始效率、黄变性等性质随光聚合引发剂的种类而不同，因此优选考虑这些性质来选择最佳的光聚合引发剂。另外，为了促进光聚合引发剂的引发反应，也可以并用被称为敏化剂的助剂。
本发明的一个实施方式的物质固定化剂(D)优选含有水溶性的光聚合引发剂，具体而言，优选含有1－[4－(2－羟基乙氧基)－苯基]－2－羟基－2－甲基－1－丙烷－1－酮、(4－苯甲酰基苄基)三甲基氯化铵等。
光聚合引发剂的添加量并无特别限定，优选相对于所述单体，光聚合引发剂的添加量为1～20质量％，更优选为2～10质量％。
(光交联剂)
例如，可以使用与物质固定化剂(C)所含的相同的光交联剂。另外，关于物质固定化剂(D)，在日本特开2006－316010号中也记载了其一例，可以适当参考该记载。
〔2.固定化对象物质〕
通过本发明一实施方式的物质固定化剂而得到固定化的物质并无特别限定，可以可例举多肽(包括糖蛋白质及脂蛋白质)、酶、多糖类、核酸、脂质以及细胞(动物细胞、植物细胞、微生物细胞等)及其构成要素(包括核、线粒体等细胞器、细胞膜或器官膜等膜类)。另外，作为该物质，可以例举过敏原、自体抗原等抗原、病毒等。本发明的一个实施方式的物质固定化剂所含的光反应性基(尤其是叠氮基及/或二氮丙啶基)受光照射时，氮分子发生游离而产生尼特灵(nitrin)和/或卡宾(carbene)。由于该尼特灵和/或卡宾不仅可以与氨基或羧基等官能团键合，还可以与构成有机化合物的碳原子键合，因此能够将大多数有机物无取向地固定化。
〔3.基底〕
作为基底，只要至少其表面由能够与所述光反应性基键合的物质构成，则没有特别限定，可以例示由微孔板等中广泛采用的聚苯乙烯、乃至聚对苯二甲酸乙二醇酯、ABS树脂、聚碳酸酯、或聚丙烯等有机物构成的基底。也可以使用在玻璃板上涂敷硅烷偶联剂等而形成的基底。此外，基板的形态不受限制，可以采用诸如微阵列板等的板状物、珠状物或纤维状物。此外，还可以采用板上设的孔或槽(例如，微孔板上的培养孔)等。本发明一实施方案的物质固定化剂尤其适用于微阵列形态。
基底中，其用于对物质进行固定化的表面可以改性。改性的一例是通过UV-臭氧处理、等离子体处理、辉光放电及电晕放电处理等亲水化处理，使基底表面具有适当的亲水性。基底表面的亲水性以其与水的接触角来表达时，接触角优选在20°以上且低于80°的范围内。该接触角更优选在25°以上且低于60°的范围内，或25°以上且55°以下的范围内，或35°以上且55°以下的范围内，特别优选在38°以上且51°以下的范围内。另外，关于与水的接触角，可使用协和界面科学株式会社生产的DropMaster500，在基底表面上滴入1μL蒸馏水并于1000ms后测定静态接触角，分析方法为θ/2法(具体也可参照实施例)。如果基底的表面与水的接触角在上述范围内，则1)可更容易地将物质固定化剂均匀涂敷至基底的表面，并且2)可更容易将物质固定化剂的层上形成的、含有该物质的包被点的直径控制在适当范围内。
〔4.物质的固定化方法〕
(1)第一方式的固定化方法
本发明的一个实施方式的物质的固定化方法(以下，有时简记为“物质固定化方法”)包括：将含有要固定化在基底上的物质及所述物质固定化剂的水溶液或水悬浮液涂敷在基底的表面，并进行光照射。
在采用所述物质固定化剂(A)或(B)的情况下，水溶液或水悬浮液中的水溶性聚合物浓度(wt/vol％)并无特别限定，但例如为0.005％～10％左右，优选为0.05％～5％左右。该浓度更优选为0.5％～3％左右。
将含有物质固定化剂的水溶液或水悬浮液涂敷于基底的表面的方法并无特别限定，例如可举出旋涂法、喷涂法、浸渍法等。
此后，优选将涂敷了的液体干燥，然后进行光照射。该光是能够使所用的光反应性基产生自由基的光，在采用叠氮基及/或二氮丙啶基作为光反应性基的情况下，光优选为紫外线。照射的光线的能量并无特别限定，通常平均每1cm2为1mW～100mW左右。
在采用上述物质固定化剂(A)或(B)的情况下，通过照射光，聚合物中的光反应性基产生自由基，从而该聚合物与基底及要被固定化的物质这两者共价键合。在采用上述物质固定化剂(C)的情况下，通过照射光，光交联剂的光反应性基产生自由基，从而聚合物介由该光交联剂与基底及要被固定化的物质这两者共价键合。在采用上述物质固定化剂(D)的情况下，通过照射光，水溶性单体进行聚合而形成为聚合物。并且，光交联剂的光反应性基产生自由基，从而该聚合物介由该光交联剂与基材及要被固定化的物质这两者共价键合。结果是，要固定化的物质介由聚合物而被固定化在基底上。
在物质固定化方法中，由于利用由光反应性基产生的自由基进行键合反应，因此不是与要被固定化的物质上的特定部位键合，而是与随机的部位键合。因此，当然也可能会出现因活性部位被用来键合而丧失活性的分子。反之，也当然会有在对活性部位不产生影响的部位发生键合的分子，而通过本物质固定化方法，即使是以往因恰好的取代基位于活性部位或其附近而难以通过共价键合来实现固定化的物质，其也能够在整体上不丧失活性的情况下通过共价键合来固定化在基底上。
在未被光照射的部分，光反应性基不与基底及物质键合，因此如果洗涤，则聚合物、单体(物质固定化剂(D)的情况下)、物质都可除去。因此，通过隔着光掩模等来进行选择性曝光，则可以以任意图案来将物质固定化。由此，通过选择性曝光，能以形成微阵列形态等各种任意形状的方式来将物质固定化，因此非常有利。
(2)第二方式的固定化方法
或者，可以首先在基底上涂敷(例如覆膜)本发明的一个实施方式的物质固定化剂，并在该物质固定化剂上，将所要固定化的物质进行微点涂，然后对基底的整个面进行光照射。在这种情况下，由于所要固定化的物质的涂点形成在物质固定化剂的层上，因此，介由物质固定化剂而共价键合地固定化至基底上的物质的比例可提高。关于涂敷物质固定化剂的方法，可以将含有物质固定化剂的水溶液或水悬浮液，与上述的“第一方式的固定化方法”同样地涂敷在基底的表面即可。关于水溶液或水悬浮液中所含的水溶性聚合物或水溶性单体的浓度，其要求与上述“第一方式的固定化方法”同样即可。
或者，可以在基底上将本发明的一个实施方式的物质固定化剂进行微点涂，并在该物质固定化剂上将所要固定化的物质进行微点涂，然后对基底的整个面进行光照射。在这种情况下，所要固定化的物质的涂点也是形成在物质固定化剂的层(彼此分离的包被点)上的，因此，介由物质固定化剂而共价键合地固定化至基底上的物质的比例可提高。
(3)第三方式的固定化方法
或者，物质固定化方法中，也可以在基底上，将本发明一实施方式的物质固定化剂与所要固定化的物质的混合物进行微点涂，，并对基底的整个面进行光照射。微点涂是一种将液体涂敷到基底上非常狭窄的区域的手法，常用于DNA包片等的制作，用于该用途的设备也在市场上有销售，使用市售的设备便可以很容易地进行微点涂。
若是如第二方式的固定化方法或第三方式的固定化方法那样进行微点样，则进行微点涂的溶液中也可以含有增粘剂。通过使用增粘剂，可以期待微涂点的液滴尺寸稳定、以及CV值(涂点相互间的变动系数)的减小等效果。作为增粘剂，例如可举出乙二醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、甘油、及羧甲基纤维素等，优选乙二醇、聚乙二醇或聚乙烯醇。
进行微点涂的溶液中的增粘剂浓度并无特别限定，可以适当决定来实现预期的液滴尺寸。增粘剂是乙二醇的情况下，其浓度优选在3重量％～75重量％的范围内，更优选在4重量％～60重量％的范围内，进而优选在5重量％～50重量％的范围内。
物质固定化方法可较好用于制备：固定化有抗体或其抗原结合性片段或固定化有抗原的免疫测定板(包括过敏原包片)；将DNA或RNA固定化在基板上而形成的核酸包片；微阵列等。但不限于这些，例如，还可以用于细胞整体或其构成要素的固定化等。
〔5.涂敷有物质固定化剂的基底〕
本发明的一个实施方式的基底的用于对物质进行固定化的表面上形成有物质固定化剂的层。通过在该物质固定化剂的层上设置所要固定化的物质，并进行光照射，就能够将该物质，介由物质固定化剂的层而固定化在基底上。
基底中，物质固定化剂层的厚度在3nm以上且低于500nm的范围内，优选在3nm以上且450nm以下的范围内，更优选在3nm以上且350nm以下的范围内，进一步优选在3nm以上且300nm以下的范围内。另外，物质固定化剂的层的厚度，既可以是对物质进行固定化之前的层的厚度，也可以是对物质进行固定化之后的层的厚度。通过使物质固定化剂的层的厚度在规定的范围内，在后述的检测等中使用时，能够得到充分的信号。并且可以抑制相对于基底的非特异性吸附。
物质固定化剂层的厚度例如可以使用光谱型偏振光椭率仪求出。对使用光谱型偏振光椭率仪得到的数据(Ψ和Δ)，用Cauchy模型进行拟合，从而确定物质固定化剂层形成前的基底(基板)的膜厚及物质固定化剂层形成后的基底(基板)的膜厚，将两者的差作为物质固定化剂的层的厚度。详细还可以参照实施例的记载。
〔6.检测用试剂盒、检测方法〕
本发明还提供一种检测用试剂盒，其具备固定化有物质的基底。根据需要，检测用试剂盒可还具备试剂盒使用说明书等。若固定化在基底上的物质为过敏原，则可以是过敏检测用或抗体检测用试剂盒。另外，若固定化在基底上的物质为抗体，则可以是基于夹心法的生化标记物检测用试剂盒。本发明还提供一种方法，其使用固定化有物质的基底、或者所述检测用试剂盒，来检测固定化在了基底上的物质与试样之间的相互作用。试样的一例是源自生物的试样，例如可举出源自血液(包括血清等血液部分成分)、唾液、或者髓液等体液的试样。
固定化在基底上的物质与试样之间的相互作用的信号检测，例如可通过化学发光法或荧光法等这些与信号种类相应的方法来进行。
〔7.实施方式的总结〕
本发明的实施方式例如包括以下所示的方面。
1)一种基底，该基底的用于对物质进行固定化的表面上，形成有物质固定化剂的层，所述物质固定化剂具有光反应性基，且含有水溶性聚合物或经聚合而会成为水溶性聚合物的水溶性单体，物质固定化剂的所述层的厚度在3nm以上且低于500nm的范围内。
2)根据1)所述的基底，其中，物质固定化剂是以下的(A)、(B)、(C)或者(D)所述的物质：
(A)所述水溶性聚合物在其1分子中具有至少2个所述光反应性基，并且，所述水溶性聚合物由分子整体为电中性的聚合物构成或者具有含聚氧乙烯构造或聚氧化烯构造的主链；
(B)所述水溶性聚合物是1分子中具有至少2个所述光反应性基的、水溶性合成高分子或水溶性天然高分子衍生物；
(C)该物质固定化剂含有：1分子中具有至少2个所述光反应性基的光交联剂、以及分子整体为电中性的所述水溶性聚合物；
(D)该物质固定化剂含有：分子整体为电中性且具有聚合性基的水溶性单体、光聚合引发剂、以及1分子中具有至少2个所述光反应性基的光交联剂。
3)根据1)或2)所述的基底，其中，所述物质介由物质固定化剂的所述层而得到固定化。
4)根据3)所述的基底，其中，该基底中固定化有所述物质。
5)根据1)～4)中任一项所述的基底，其中，所述物质选自多肽、酶、多糖类、核酸、脂质、以细胞及其构成要素。
6)根据2)～5)中任一项所述的基底，其中，物质固定化剂是以下的(b)或者(d)所述的物质固定化剂：
(b)所述水溶性聚合物由1分子中具有至少2个光反应性基的非离子性水溶性高分子构成，该非离子性水溶性高分子为聚亚烷基二醇或聚乙烯系高分子；或者
(d)该物质固定化剂含有：作为水溶性单体的(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、光聚合引发剂、以及1分子中具有至少2个作为光反应性基的叠氮基的光交联剂。
7)根据1)～6)中任一项所述的基底，其中，该基底的用于对物质进行固定化的表面与水的接触角在20°以上且低于80°的范围内。
8)根据1)～7)中任一项所述的基底，其中，相对于所述水溶性聚合物全体，所述光反应性基的含量为2.5摩尔％以上且低于50摩尔％。
9)一种过敏检测用或抗体检测用试剂盒，其具备：所述物质为过敏原的、1)～8)中任一项所述的基底。
10)一种基于夹心法的生化标记物检测用试剂盒，其具备：所述物质为抗体的、1)～8)中任一项所述的基底。
11)一种方法，其使用1)～8)中任一项所述的基底、或者9)或10)所述的试剂盒，对固定化在了基底上的物质与试样之间的相互作用进行检测。
以下将描述本发明的实施例，并且更详细地描述本发明的实施方式。当然，本发明并不限定于以下的实施例，在细节方面可以采用各种方式是毋庸置疑的。此外，本发明不限于上述实施方式，在说明书所示的范围内能够进行各种变更，并且通过适当组合分别公开的技术手段而获得的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的所有文献均可作为参考来援引。
(实施例)
在以下实施例中，如无特别说明，则％表示质量％。
〔实施例1〕
(1)材料等
<基板(基底)>
使用了ABS树脂制的黑色基板(AS ONE株式会社的ABS-B-050501)或石英(Kenis3-131-601)。基板的厚度为1mm，切割成23mm×26mm，供以下实验使用。
<包被剂(物质固定化剂)>
制备了以下三种包被剂。
·多价交联型(相当于物质固定化剂(A))
也称为聚乙烯型Az-PEG-1，其按照日本国专利4630817号(国际公布第2004/088319号)中实施例1的方法制得。即，在茄型烧瓶中，将N-叠氮苯基丙烯酰胺、甲基丙烯酸PEG(聚合度n＝8)单酯溶解于乙酸乙酯中，并加入偶氮双异丁腈(AIBN)，灌满氮气密封，在60℃下搅拌了6小时。停止加热，待一定程度上溜去溶剂后，转移到二乙醚中，并用超声波仪进行了处理。回收固体，减压干燥了2小时。结果得到了光反应性聚(甲基丙烯酸乙二醇单酯－N-叠氮苯基丙烯酰胺)共聚物。Az-PEG-1是含有10摩尔％的含叠氮苯基单体的光反应性水溶性聚合物。
·多价交联型(相当于物质固定化剂(A))
也称氧乙烯型Az-PEG-2，其按照特开2020-132803号公报中实施例1的方法制得。Az-PEG-2是含有2.5摩尔％以上且低于50摩尔％的含叠氮苯基单体的光反应性水溶性聚合物。
·光反应加成型(相当于物质固定化剂(B))
按照Macromol.Re.,21,216(2013)DOI 10.1007/s13233-013-1016-7的方法合成了光反应性透明质酸(Hyal-Az)。将透明质酸钠(100mg)溶解在100mL水中，加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(即，1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(92mg)、以及4-叠氮基苯胺盐酸盐(即，4-azidoanilinehydrochloride)(99mg)。将混合物一边在pH7.0下在暗室中搅拌，一边在室温下反应了24小时。然后，通过透析进行精制，得到了光反应性透明质酸。该光反应性透明质酸含有含叠氮苯基的糖单体10摩尔％。
·交联剂混合型(相当于物质固定化剂(C))
也称为混合系Az-1。使用聚乙二醇(平均分子量9501050、Ardrich)作为聚合物，使用4，4’－二叠氮芪－2，2’－二磺酸(Fluka)作为光交联剂。将聚合物9％及交联剂1％溶解在水溶液(水:乙醇＝50vol％:50vol％)中，制备了物质固定化剂(C)。
(2)使用包被剂的基板涂敷方法
用Ipsolon(泉工业株式会社制造)对切割成23mm×26mm的ABS基板或石英板进行辉光放电处理(100W、90秒)。辉光放电处理后，用旋涂机(MIKASA MS-B100)滴下上述包被剂的浓度各不同的水溶液(水:乙醇＝50vol％:50vol％)70μL，以转数不同的方式进行旋涂。
(3)包被剂的膜厚的测定
采用偏振光椭率测定法，如下进行了涂膜剂的膜厚测定。
[测定装置]
使用了光谱型偏振光椭率仪(M-2000UI,J.A.Woollam,Co.,Inc.,Lincoln,NE,USA)。
[测定条件及测定流程]
在测定波长范围为250～1700nm，朝试料的光入射角为50°、60°、70°，数据累计测定次数为100的条件下，在涂敷包被剂前的ABS基板中心附近进行了测定。用Cauchy模型，将得到的偏振光椭率测定数据(Ψ及Δ)进行拟合，由此确定了涂敷包被剂前的ABS基板的折射率及膜厚。Cauchy模型虽然是仅考虑透明电介质折射率正态分散的现象论模型，但得到了良好的拟合结果，因此认为该黑色ABS基板的消光系数k小到可以忽略的程度，所以在分析中，使用了以k＝0来拟合(忽略光吸收)的结果。Cauchy模型处理的折射率以n(λ)＝A+B/λ2+C/λ4的形式描述(λ是向试样入射的光的波长)，系数A、B、C通过拟合来确定。
对涂敷包被剂前的ABS基板进行评价后，对其形成包被剂的薄膜，并对真空干燥后的该ABS基板进行了测定及分析。作为被分析的模型，假设了在ABS基板上设有1层包被剂层的结构。作为ABS基板本身的折射率，使用了就涂敷所述包被剂前的ABS基板所得到的测定结果，通过对折射率(Cauchy模型的系数)进行拟合，确定了包被剂层的膜厚。
一般来说，当膜厚较薄(10nm左右以下)时，很难单独地将膜厚和折射率精确地求出，因此，通常先在膜厚较厚的膜上求出折射率，然后将其视为膜厚较薄的膜来仅进行膜厚拟合。在本实施例中，根据物质固定化剂的干燥条件，随着溶剂的残留量的变化，折射率有可能变化，因此折射率也拟合进行了解析。
关于石英，其折射率的重现性极高，因此确认到对本测定中所用的石英基板单独进行的测定结果与用偏振光椭率仪分析软件得出的值充分一致。
而且，在将包被剂的浓度和旋涂的转数固定的情况下，确认到无论在石英基板上涂敷还是在ABS树脂上涂敷，膜厚度都达到了相同程度。求出了制膜条件与膜厚之间的关系，并将其作为基准。
此外，还确认到了利用反射型共聚焦激光显微镜(奥林巴斯OLS4100)测定的厚度也与这些利用偏振光椭率仪得出的膜厚为相同程度。
(4)发光强度的测定法
准备蛋白质[Biotin化BSA：使用生物素标记剂Biotin Sulfo-OSu(DOJINDO产品号B319)对BSA施以Biotin标记化后的产物(日本Chemiphar株式会社制造)；或Rabbit IgG(Sigma株式会社制造)]浓度为100μg/mL的点涂溶液，用多针式阵列机(BioRoboticsMicroGridII compact)，在旋涂有上述包被剂水溶液的ABS基板上进行了微点涂。
经阵列点涂后的基板在真空干燥机中干燥10分钟后，用UV照射装置(UV－CROSSLINKER：UVP CL1000S、254nmUV)照射10分钟来将微涂点进行光固定化。
接着，以每次用200μL的PBS清洗10秒的方式，对基板进行了共3次预清洗。然后，将经3000倍稀释的碱性磷酸酯酶链霉素(Streptavidin Alkaline Phosphatase)或标记抗体(Promega公司制造)120μL，与光固定化了的蛋白质反应8分钟。反应后，以每次用200μL的PBS清洗10秒的方式，对基板进行了共6次清洗。然后，将基质(DynaLight ThermoFisher公司制造)120μL(原液)涂敷到基板上。用CCD相机测定了涂敷30秒后的发光量，并用Dynacom株式会社制造的SpotSolver(产品名；注册商标)，以非固定化区域为背景域并以固定化区域为信号域，通过对像素数进行计数来测定了发光强度。背景域的测定结果如表1～4所示，信号域的测定结果如表5～8所示。
(表1)
表1背景域、AzPEG-1、ABS基板、Biotin化BSA
Figure BDA0004001967630000261
(表2)
表2背景域、AzPEG-1、石英基板、Biotin化BSA
Figure BDA0004001967630000262
(表3)
表3背景域、Hyal-Az、ABS基板、兔IgG
Figure BDA0004001967630000271
(表4)
表4背景域、混合系Az-1、ABS基板、兔IgG
Figure BDA0004001967630000272
(表5)
表5信号域、AzPEG-1、ABS基板、Biotin化BSA
Figure BDA0004001967630000273
(表6)
表6信号域、AzPEG-2、ABS基板、兔IgG
Figure BDA0004001967630000281
(表7)
表7信号域、Hyal-Az、ABS基板、兔IgG
Figure BDA0004001967630000282
(表8)
表8信号域、混合系Az-1、ABS基板、Biotin化BSA
Figure BDA0004001967630000283
为了获得S/N比充分高的信号强度，需要尽可能降低噪音(背景噪音)。为此，求出了所需的最低膜厚。由表1～4可知，膜厚3nm以上的情况下，非特异性吸附可充分抑制到与非涂敷状态相比的15％以下。
为了获得S/N比充分高的信号强度，需要尽量增多被固定化的蛋白质。尽管膜厚越高，则固定化的量越大，但这会限制在最外侧膜面与分析物进行相互作用的生物高分子(蛋白质)在膜表面上的浓度，从而蛋白质的相互作用会受到局限。最佳膜厚的决定取决于添加的蛋白质浓度，而根据表5～8可知，在通常的蛋白质浓度下，当膜厚为500nm时，发光强度会急剧下降。因此可知，为了获得S/N比充分高的信号强度，其并非受限于基质的材质，而是物质固定化剂的层需要为3nm以上且低于500nm。物质固定化剂的层尤其优选在3nm～350nm的范围内。
〔实施例2〕
使用与实施例1相同的方法，检测了蛋白质与标记抗体之间的相互作用。但使用等离子处理装置(Samco株式会社的等离子清洁机PC-300)进行了等离子处理，以替代辉光放电处理。经各种等离子处理后，测定了涂敷包被剂前的ABS基板表面与水的接触角。另外，作为包被剂，使用了氧乙烯型Az-PEG-2和聚乙烯型Az-PEG-1(物质固定化剂(A))，其浓度为1.0wt/vol％。制膜是在实现10nm膜厚的条件下进行的。
与水的接触角(静态接触角)的测定详细如下。作为测定装置，使用了协和界面科学株式会社的DropMaster500。分析方法为θ/2法，在ABS基板表面滴下1μL蒸馏水，从滴下到测定的时间间隔为1000ms。测定结果如表9及表10所示。
表9中，“叠氮苯基的含有率”栏表示物质固定化剂中的叠氮苯基的含有率(摩尔％)。“物质固定化剂的种类”栏中的“1”表示Az-PEG-1，“2”表示Az-PEG-2。
(表9)
表9采用聚乙烯型Az-PEG-1或Az-PEG-2(物质固定化剂(A))
Figure BDA0004001967630000291
(表10)
表10采用聚乙烯型Az-PEG-1(物质固定化剂(A))
Figure BDA0004001967630000301
表9中，“○”表示溶于挥发性极性溶剂(水与乙醇的混合溶液)，“×”表示不溶于挥发性极性溶剂。当叠氮苯基的含有率达到50摩尔％以上时，无法溶于挥发性极性溶剂，因此未能在基板上进行涂敷。
由表10可知，涂敷包被剂前的基板表面的接触角也会对发光强度产生影响。涂敷包被剂之前的基板表面的接触角优选在20°以上且低于80°的范围内，该接触角特别优选在38°以上且51°以下的范围内。
〔实施例4〕
使用与实施例1相同的方法，检测了蛋白质与标记抗体之间的相互作用。进行了等离子处理(使用等离子处理装置Samco株式会社的等离子清洁机PC-300，以10W来处理10秒)，以替代辉光放电处理。作为包被剂，使用了聚乙烯型Az-PEG-1(物质固定化剂(A))，其浓度为1.0wt/vol％。但是，在用多针式阵列机进行微点涂的点涂溶液中，加入有乙二醇作为增粘剂。结果，液滴的尺寸(涂点的尺寸)成功稳定，并未因涂点相互接近而难以测定，CV值如表11所示那样成功减小。
(表11)
表11
乙二醇浓度(％) CV
0 9
50 3
(产业上的可利用性)
本发明例如可用于对临床样本进行分析及测定，可用于生命科学研究及医疗用途等。

Claims (11)

1.一种基底，
该基底的用于对物质进行固定化的表面上，形成有物质固定化剂的层，
所述物质固定化剂具有光反应性基，且所述物质固定化剂含有水溶性聚合物或经聚合而会成为水溶性聚合物的水溶性单体，
物质固定化剂的所述层的厚度在3nm以上且低于500nm的范围内。
2.根据权利要求1所述的基底，其中，
所述物质固定化剂是以下(A)、(B)、(C)或者(D)所述的物质固定化剂：
(A)所述水溶性聚合物在其1分子中具有至少2个所述光反应性基，并且，所述水溶性聚合物由分子整体为电中性的聚合物构成或者具有含聚氧乙烯构造或聚氧化烯构造的主链；
(B)所述水溶性聚合物是1分子中具有至少2个所述光反应性基的、水溶性合成高分子或水溶性天然高分子衍生物；
(C)物质固定化剂含有：1分子中具有至少2个所述光反应性基的光交联剂、以及分子整体为电中性的所述水溶性聚合物；
(D)物质固定化剂含有：分子整体为电中性且具有聚合性基的水溶性单体、光聚合引发剂、以及1分子中具有至少2个所述光反应性基的光交联剂。
3.根据权利要求1或2所述的基底，其中，
所述物质介由物质固定化剂的所述层而得到固定化。
4.根据权利要求3所述的基底，其中，
该基底中固定化有所述物质。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的基底，其中，
所述物质选自多肽、酶、多糖类、核酸、脂质、细胞及其构成要素。
6.根据权利要求2～5中任一项所述的基底，其中，
物质固定化剂是以下(b)、(c)或者(d)所述的物质固定化剂：
(b)所述水溶性聚合物由1分子中具有至少2个光反应性基的非离子性水溶性高分子构成，该非离子性水溶性高分子为聚亚烷基二醇或聚乙烯系高分子；
(c)物质固定化剂含有：1分子中具有至少2个所述光反应性基的光交联剂、以及分子整体为电中性的所述水溶性聚合物；
(d)物质固定化剂含有：作为水溶性单体的(甲基)丙烯酸聚乙二醇酯、光聚合引发剂、以及1分子中具有至少2个作为光反应性基的叠氮基的光交联剂。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的基底，其中，
该基底的用于对物质进行固定化的表面与水的接触角在20°以上且低于80°的范围内。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的基底，其中，
相对于所述水溶性聚合物全体，所述光反应性基的含量为2.5摩尔％以上且低于50摩尔％。
9.一种过敏检测用或抗体检测用试剂盒，
其具备：所述物质为过敏原的、权利要求1～8中任一项所述的基底。
10.一种基于夹心法的生化标记物检测用试剂盒，
其具备：所述物质为抗体的、权利要求1～8中任一项所述的基底。
11.一种方法，
其使用权利要求1～8中任一项所述的基底、或者权利要求9或10所述的试剂盒，对固定化在了基底上的物质与试样之间的相互作用进行检测。
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