CN115902208A - 一种负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板及其制备方法。针对现有聚苯乙烯酶标板稳定性能差、检测范围窄、检测时间长、检测准确度差等问题，本发明提供了一种负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，包括以下步骤：金属基底上生长石墨烯，旋涂聚甲基丙烯酸甲酯并固化，等离子体轰击，蚀刻，覆盖在聚苯乙烯板表面，去除聚甲基丙烯酸甲酯去除，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。本发明首次采用化学气相沉积法生长的石墨烯薄膜覆盖在聚苯乙烯板上，利用石墨烯独有的特性，可大大提高检测范围，缩小检测时间，使用了石墨烯薄膜在聚苯乙烯表面进行覆盖可大大提高其耐酸碱性，耐有机溶剂能力、抗油脂能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板及其制备方法。
背景技术
酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssayELISA)是各生物、化学实验室以及临床检测中常用的分析检测方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。然而，ELISA检测价格昂贵，检测限范围不够，已不能满足当前实际应用的要求。
石墨烯是最近十余年来发现的极其重要的新材料，石墨烯狭义概念是指由碳原子以sp2杂化轨道组成六角型蜂巢晶格结构的只有一个碳原子厚度的二维晶体。石墨烯层数呈正态分布，广义石墨烯大多数是指多层石墨烯，如寡层石墨烯(3～5层)，多层石墨烯(10层左右)。石墨烯是良好的导体，不但非常坚硬而且导电性极佳，其电子迁移率可达200000cmvs，电阻率可达10cm，是世界上电阻率最小的材料，亦是极佳的常温超导材料。石墨烯亦具有较好的生物兼容性和吸附各种原子与分子的特性。
抗原和抗体均属于蛋白质分子，极其微小，其分子之间的相对距离较大，彼此离的较远。常规抗ELISA一般是利用非共价键作用力，如氢键、静电引力、疏水相互作用力、范德华引力将抗原抗体结合，结合时间长，效果差。石墨烯具有较好的生物兼容性，同时具有吸附各种原子与分子和高达2600m2/g比表面的特性，如果采用石墨烯来吸附抗原和抗体，能大大加速抗原抗体之间的接触面积和结合效率。
ELISA检测使用到的酶标板一般由聚苯乙烯制成，聚苯乙烯化学稳定性较差，可以被多种有机溶剂如芳烃、卤代烃等溶解，会被强酸强碱腐蚀，不抗油脂，在受到紫外光照射后易变色。聚苯乙烯酶标板对蛋白的吸附作用主要是依靠疏水键、电荷间的相互作用等，对糖的吸附能力则与糖的分子量、结构、性质有很大关系。为了提高聚苯乙烯酶标板的稳定性，目前的方法是对其进行表面改性，改性处理后使其拥有带正电荷的氨基，但改性后的酶标板由于降低了疏水性，一部分蛋白分子无法结合，使得该类酶标板的检测效率降低。并且，改性后还需要对酶标板进行有效地封闭，由于亲水和共价的表面特性，使用的封闭液必须能够与非反应性氨基基团和所选择的交联剂中任何功能基团发生作用，这就造成了成本增加，并且操作不便。
因此，如何提高聚苯乙烯酶标板的稳定性，加强抗原抗体的结合效率，提高ELISA检测效率，是行业内亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：现有聚苯乙烯酶标板稳定性能差、检测范围窄、检测时间长、检测准确度差等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法。该方法包括以下步骤：
a、采用化学气相沉积法在金属基底上生长石墨烯，得到第一样片；
b、将聚甲基丙烯酸甲酯旋涂到第一样片的正面，加热固化后得到第二样片；
c、将第二样片的背面放入轰击等离子体装置，抽真空后轰击等离子体，轰击结束得到第三样片；
d、将第三样片正面朝上加入蚀刻溶液中，蚀刻掉金属基底，清洗后得到第四样片；
e、将聚苯乙烯酶标板从第四样片溶液中捞出，使第四样片平整覆盖在聚苯乙烯板表面，吸水晾干后加热烘干，得到第五样片；
f、将第五样片中的聚甲基丙烯酸甲酯去除，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤a所述的石墨烯为单层石墨烯、双层石墨烯或多层石墨烯，优选为单层石墨烯。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤a所述的金属基底为铜、镍、铂、钴、铁、钼、钌或铱中的一种。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤b所述的旋涂速度为2000-5000rmp/s，优选为3000rmp/s。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤b所述的加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为60-100℃，时间为10-60min。
优选的，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤b所述的加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为90℃，时间为15min。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤c所述的抽真空时间为5-30min，优选为15min。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤c所述的轰击等离子体的功率为Low，时间为10-60min，优选为20min。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤c所述的轰击等离子体设备为型号PDC-002-HP的PLASMA Cleaner等离子刻蚀机。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤d所述的蚀刻溶液为过硫酸铵或氯化铁，浓度为0.1-3mol/L。
所述的蚀刻分为两次，第一次蚀刻时间为1-10h，优选为3h，第二次蚀刻将第三样片转移到新的蚀刻液中，蚀刻时间为1-20h，优选为18h。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤d所述的清洗的步骤具体操作为：先使用超纯水清洗一次，再使用1：20的盐酸溶液清洗一次，后使用超纯水清洗三次，然后使用聚苯乙烯捞出。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤e所述的吸水晾干时间为1-2h，加热温度为60-200℃，加热时间为5-60min。
优选的，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤e所述的吸水晾干时间为1.5h，加热温度为150℃，加热时间为15min。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤e所述的聚苯乙烯酶标板为九十六孔板或四十八孔板，优选为九十六孔板。
其中，上述负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法中，步骤f所述的去除聚甲基丙烯酸甲酯的具体操作为：将第四样片泡入丙酮当中加热，加热时间10-360min，加热温度30-56℃，后依次用丙酮和异丙醇各冲洗2min，使用氮气吹干。
进一步的，加热时间优选为60min，加热温度优选为40℃。
本发明还提供了一种上述制备方法直接制备得到的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
本发明的有益效果为：
本发明首次采用化学气相沉积法生长的石墨烯薄膜覆盖在聚苯乙烯板上，石墨烯具有较好的生物兼容性和吸附各种原子与分子的特性，石墨烯薄膜表面覆盖的聚苯乙烯板可以额外与石墨烯的碳基发生共价结合，可更牢固结合的结合抗原或抗体，且由于与抗原或抗体结合效果较好，有更多的抗原或抗体与酶标板结合，可大大提高检测范围，且可大幅度缩小检测时间，使用了石墨烯薄膜在聚苯乙烯表面进行覆盖可大大提高其耐酸碱性，耐有机溶剂能力、抗油脂能力。而石墨烯薄膜进行表面改性后比表面积大幅增大，石墨烯薄膜与抗体的结合面积就更大，所以石墨烯薄膜可以和抗体更好的结合，而且由于石墨烯薄膜可通过π-π堆叠牢固的结合在聚苯乙烯板上，结合后的抗体在清洗过程中更难被去除，会有更多的抗体结合在酶标板上，所以抗体可以通过更短的时间包被在酶标板上，且灵敏度会更高，而石墨烯溶液结合抗体溶液的话，抗体大部分是通过物理吸附残留在酶标板上，在清洗后残留在酶标板上的抗体数量相比于将石墨烯薄膜覆盖在酶标板上大大减小。
具体实施方式
本发明是使用化学气相沉积法生长的单层石墨烯薄膜转移至酶标板上进行表面改性，由于石墨烯与聚苯乙烯可形成π-π堆叠使石墨烯薄膜可牢固的结合在聚苯乙烯板上，且石墨烯亦具有较好的生物兼容性和吸附各种原子与分子的特性，相比于传统聚苯乙烯板通过疏水键、流水/离子键的被动吸附，单层石墨烯薄膜表面覆盖的聚苯乙烯板可以额外与石墨烯的碳基发生共价结合，可更牢固结合的结合抗原或抗体，而石墨烯由于其超高的比表面积，且由于与抗原或抗体结合效果较好，有更多的抗原或抗体与酶标板结合，可大大提高检测范围，且可大幅度缩小检测时间，提高准确度。且聚苯乙烯化学稳定性较差，可以被多种有机溶剂如芳烃、卤代烃等溶解，会被强酸强碱腐蚀，不抗油脂，在受到紫外光照射后易变色，而使用了石墨烯薄膜在聚苯乙烯板表面进行覆盖可大大提高其耐酸碱性，耐有机溶剂能力、抗油脂能力。
本发明化学气相沉积法的具体操作步骤为：
a、先对金属基底裁剪成与石英片大小相同的尺寸，再对金属基底进行清洗；所述清洗先将金属基底完全浸没于乙酸溶液中，浸泡时间为0～120min，优选30min，之后将金属基底从乙酸溶液转移到超纯水溶液，完全浸没，浸泡0～120min，优选5min，再将金属基底从超纯水溶液转移到丙酮溶液，完全浸没，浸泡0～120min，优选5min，最后将金属基底从丙酮溶液转移到无水乙醇溶液，完全浸没，浸泡0～120min，优选5min，将金属基底从无水乙醇中捞出，快速吹干，得到清洗后的金属基底；
b、将表面处理好的金属基底放置于石英片表面，然后将CVD炉盖打开，将石英片放入CVD炉中，并盖好炉盖，之后抽真空，设定气体参数AR流量为0～5000，优选Ar＝1000，H2流量为0～1000，优选H2＝100，CH4流量为0～1000，优选CH4＝50，当气压大于770托时，手动打开尾气阀，电炉开始加热，设定气体参数AR流量为0～5000，优选Ar＝1000，H2流量为0～1000，优选H2＝50，CH4流量为0～1000，优选CH4＝0，炉子温度设定最高值为100～1200℃，优选1050℃，温度变化速率为0～2000℃/h，优选1800℃/h，炉子温度稳定在1050℃时，设定炉子温度为1050℃，设定气体参数AR流量为0～5000，优选Ar＝1000，H2流量为0～1000，优选H2＝100，CH4流量为0～1000，优选CH4＝50，在1050℃生长，生长时间为1～120min，优选10min；生长结束后设定气体参数为AR流量为0～5000，优选Ar＝1000，H2流量为0～1000，优选H2＝0，CH4流量为0～1000，优选CH4＝0，冷却至室温，冷却速度为0～1000℃/h，优选600℃/h，冷却结束后将铜箔取出，得到负载在金属基底上的石墨烯薄膜。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例1采用本发明方法制备负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板
包括如下步骤：
(1)采用化学气相沉积法在铜箔上生长石墨烯，先对铜箔裁剪成与石英片大小相同的尺寸，再对铜箔进行清洗，先将金属基底完全浸没与乙酸溶液中，浸泡时间为30min。之后将铜箔从乙酸溶液转移到超纯水溶液，完全浸没，浸泡5min，再将铜箔从超纯水溶液转移到丙酮溶液，完全浸没，浸泡5min，最后将铜箔从丙酮溶液转移到无水乙醇溶液，完全浸没，浸泡5min。将铜箔从无水乙醇中捞出，快速吹干，得到清洗后的铜箔。将表面处理好的铜箔放置于石英片表面，然后将CVD炉盖打开，将石英片放入CVD炉中，并盖好炉盖，之后抽真空，设定气体参数AR流量Ar＝1000，H2流量为100，CH4流量为50，当气压大于770托时，手动打开尾气阀，电炉开始加热，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为50，CH4流量为0，炉子温度设定最高值为1050℃，温度变化速率为1800℃/h，炉子温度稳定在1050℃时，设定炉子温度为1050℃，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为100，CH4流量为50，在1050℃生长，生长时间为10min。生长结束后设定气体参数为AR流量为1000，H2流量为0，CH4流量为0，冷却至室温，冷却速度为600℃/h，冷却结束后将铜箔取出，得到第一样片：
(2)将聚甲基丙烯酸甲酯旋涂到第一样片的正面，旋涂速度为3000rmp/s，加热固化后得到第二样片，加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为90℃，时间为15min。
(3)将第二样片的背面放入轰击等离子体装置，设备名称为PLASMA Cleaner等离子刻蚀机，型号为PDC-002-HP，抽真空15min后轰击等离子体，轰击结束得到第三样片轰击等离子体的功率为Low，时间为20min；
(4)将第三样片正面朝上加入1mol/L过硫酸铵蚀刻溶液中，所述的蚀刻分为两次，第一次蚀刻时间3h，第二次蚀刻将第三样片转移到新的蚀刻液中，蚀刻时间为18h。蚀刻掉金属基底，之后清洗先使用超纯水清洗一次，再使用1：20的盐酸溶液清洗一次，后使用超纯水清洗三次，后得到第四样片；
(5)九十六孔将聚苯乙烯酶标板从第四样片溶液中捞出，使第四样片平整覆盖在聚苯乙烯板表面，吸水晾干，吸水晾干时间为1.5h，最后加热，加热温度为150℃，加热时间为15min。吸水晾干后加热烘干，得到第五样片；
(6)将第五样片中的聚甲基丙烯酸甲酯去除，去除步骤为将第四样片泡入丙酮当中加热，加热时间60min，加热温度40℃，后依次用丙酮和异丙醇各冲洗2min，使用氮气吹干，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
实施例2采用本发明方法制备负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板
包括如下步骤：
(1)采用化学气相沉积法在铜箔上生长石墨烯，先对铜箔裁剪成与石英片大小相同的尺寸，再对铜箔进行清洗，先将金属基底完全浸没与乙酸溶液中，浸泡时间为120min。之后将铜箔从乙酸溶液转移到超纯水溶液，完全浸没，浸泡120min，再将铜箔从超纯水溶液转移到丙酮溶液，完全浸没，浸泡120min，最后将铜箔从丙酮溶液转移到无水乙醇溶液，完全浸没，浸泡120min。将铜箔从无水乙醇中捞出，快速吹干，得到清洗后的铜箔。将表面处理好的铜箔放置于石英片表面，然后将CVD炉盖打开，将石英片放入CVD炉中，并盖好炉盖，之后抽真空，设定气体参数AR流量Ar＝1000，H2流量为100，CH4流量为50，当气压大于770托时，手动打开尾气阀，电炉开始加热，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为50，CH4流量为0，炉子温度设定最高值为1200℃，温度变化速率为1800℃/h，炉子温度稳定在1200℃时，设定炉子温度为1200℃，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为100，CH4流量为50，在1200℃生长，生长时间为10min。生长结束后设定气体参数为AR流量为1000，H2流量为0，CH4流量为0，冷却至室温，冷却速度为600℃/h，冷却结束后将铜箔取出，得到第一样片：
(2)将聚甲基丙烯酸甲酯旋涂到第一样片的正面，旋涂速度为5000rmp/s，加热固化后得到第二样片，加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为100℃，时间为60min。
(3)将第二样片的背面放入轰击等离子体装置，设备名称为PLASMA Cleaner等离子刻蚀机，型号为PDC-002-HP，抽真空15min后轰击等离子体，轰击结束得到第三样片轰击等离子体的功率为Low，时间为60min；
(4)将第三样片正面朝上加入3mol/L过硫酸铵蚀刻溶液中，所述的蚀刻分为两次，第一次蚀刻时间10h，第二次蚀刻将第三样片转移到新的蚀刻液中，蚀刻时间为20h。蚀刻掉金属基底，之后清洗先使用超纯水清洗一次，再使用1：20的盐酸溶液清洗一次，后使用超纯水清洗三次，后得到第四样片；
(5)九十六孔将聚苯乙烯酶标板从第四样片溶液中捞出，使第四样片平整覆盖在聚苯乙烯板表面，吸水晾干，吸水晾干时间为1.5h，最后加热，加热温度为150℃，加热时间为15min。吸水晾干后加热烘干，得到第五样片；
(6)将第五样片中的聚甲基丙烯酸甲酯去除，去除步骤为将第四样片泡入丙酮当中加热，加热时间60min，加热温度56℃，后依次用丙酮和异丙醇各冲洗2min，使用氮气吹干，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
实施例3采用本发明方法制备负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板
包括如下步骤：
(1)采用化学气相沉积法在铜箔上生长石墨烯，将未清洗的铜箔放置于石英片表面，然后将CVD炉盖打开，将石英片放入CVD炉中，并盖好炉盖，之后抽真空，设定气体参数AR流量Ar＝1000，H2流量为100，CH4流量为50，当气压大于770托时，手动打开尾气阀，电炉开始加热，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为50，CH4流量为0，炉子温度设定最高值为900℃，温度变化速率为1800℃/h，炉子温度稳定在900℃时，设定炉子温度为900℃，设定气体参数AR流量为1000，H2流量为100，CH4流量为50，在900℃生长，生长时间为10min。生长结束后设定气体参数为AR流量为1000，H2流量为0，CH4流量为0，冷却至室温，冷却速度为600℃/h，冷却结束后将铜箔取出，得到第一样片：
(2)将聚甲基丙烯酸甲酯旋涂到第一样片的正面，旋涂速度为2000rmp/s，加热固化后得到第二样片，加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为60℃，时间为60min。
(3)将第二样片的背面放入轰击等离子体装置，设备名称为PLASMA Cleaner等离子刻蚀机，型号为PDC-002-HP，抽真空15min后轰击等离子体，轰击结束得到第三样片轰击等离子体的功率为Low，时间为10min；
(4)将第三样片正面朝上加入1mol/L过硫酸铵蚀刻溶液中，所述的蚀刻分为两次，第一次蚀刻时间3h，第二次蚀刻将第三样片转移到新的蚀刻液中，蚀刻时间为18h。蚀刻掉金属基底，之后清洗先使用超纯水清洗一次，再使用1：20的盐酸溶液清洗一次，后使用超纯水清洗三次，后得到第四样片；
(5)九十六孔将聚苯乙烯酶标板从第四样片溶液中捞出，使第四样片平整覆盖在聚苯乙烯板表面，吸水晾干，吸水晾干时间为1h，最后加热，加热温度为150℃，加热时间为15min。吸水晾干后加热烘干，得到第五样片；
(6)将第五样片中的聚甲基丙烯酸甲酯去除，去除步骤为将第四样片泡入丙酮当中加热，加热时间60min，加热温度30℃，后依次用丙酮和异丙醇各冲洗2min，使用氮气吹干，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
实施例4采用新型冠状病毒酶联免疫试剂盒标定标准曲线
包括如下步骤：
(1)平衡：新型冠状病毒酶联免疫试剂盒(购自上海江莱生物科技有限公司，冠状病毒检测试剂盒ELISA)，在使用前从储存的冰箱中取出，放在室温条件下进行平衡，不少于30min，使其中的组分达到室温(除酶标抗体)。同时取出稀释好的60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml新型冠状病毒国家标准溶液。
(2)配制洗液：准确量取浓缩洗液4ml，加入50ml离心管中，用去离子水定容至40ml，充分混匀。
(3)加样：将包被好新型冠状病毒抗体的酶标板取出，加入试剂盒自带的新型冠状病毒标准品，其浓度分别为(0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml)，50ul/孔。设1复孔，加60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml新型冠状病毒国家标准品溶液，50ul/孔，均设3孔。加样后，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
(4)洗涤：去除酶标板中的内含物，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(5)反应：用稀释液将酶标抗体按一定的稀释倍数稀释后每孔加入100ul，然后于室温(20-25摄氏度)反应0.5h(小时)。
(6)洗板：去除酶标板中的内含物，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s(秒)。每次洗涤均需拍干。
(7)显色：向每个反应孔加TMB(四甲基联苯胺)显色液，50ul/孔。震荡5s，用封口膜封口，室温避光孵育15min。
(8)终止：加终止液50ul/孔，轻柔震荡5s混匀。
(9)读板：记录实验结果并保存，在10min内用多功能酶标仪于450nm下检测其OD值。
(10)制作回归方程：将不同浓度下的标准品与其对应的OD值列成线性回归方程，记录其方程和相关系数，相关系数要求r2>0.99。
实施例5采用实施例1制备的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板进行检测
包括如下步骤：
(1)包被：取新型冠状病毒抗体用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10ug/ml，取覆盖石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板，依次往样品孔中加样(100ul/孔)，共包被4*7孔，然后放置于4℃下包被过夜。
(2)洗涤：去除酶标板中的内含物，每孔加0.15M、pH＝7.4的PBST洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(3)封闭：向每个包反应孔中加含1％明胶的1％Tween-20的封闭液300ul进行封闭，于室温(20-25摄氏度)下放置1小时。
(4)倒掉反应孔中的封闭液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(5)加样：标准品的稀释与加样：用样品稀释液将标准品稀释至目标浓度(100ng/ml、90ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、0ng/ml)，每孔分别加50ul。
(6)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
(7)洗板：倒掉样品孔中的反应液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。
(8)反应：用稀释液将酶标抗体按一定的稀释倍数稀释后每孔加入100ul，然后于室温(20-25摄氏度)反应0.5h(小时)。
(9)洗板：倒掉未结合的酶标抗体，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上吸干残留液体。
(10)显色：每孔加入TMB显色液50ul，置室温(20-25摄氏度)反应15min。
(11)终止：加终止液50ul/孔，轻柔震荡5s混匀。
(12)读板：记录实验结果并保存，在10min内用多功能酶标仪于450nm下检测其OD值，将OD值带入制得的标准品标定标准曲线。
实施例6采用氨基化聚苯乙烯板进行检测
包括如下步骤：
(1)包被：取新型冠状病毒抗体用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10ug/ml，取氨基化聚苯乙烯酶标板，依次往样品孔中加样(100ul/孔)，共包被4*7孔，然后放置于4℃下包被过夜。
(2)洗涤：去除酶标板中的内含物，每孔加0.15M、pH＝7.4的PBST洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(3)封闭：向每个包反应孔中加含1％明胶的1％Tween-20的封闭液300ul进行封闭，于室温(20-25摄氏度)下放置1小时。
(4)倒掉反应孔中的封闭液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(5)加样：标准品的稀释与加样：用样品稀释液将标准品稀释至目标浓度(100ng/ml、90ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、0ng/ml)，每孔分别加50ul。
(6)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
(7)洗板：倒掉样品孔中的反应液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。
(8)反应：用稀释液将酶标抗体按一定的稀释倍数稀释后每孔加入100ul，然后于室温(20-25摄氏度)反应0.5h(小时)。
(9)洗板：倒掉未结合的酶标抗体，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上吸干残留液体。
(10)显色：每孔加入TMB显色液50ul，置室温(20-25摄氏度)反应15min。
(11)终止：加终止液50ul/孔，轻柔震荡5s混匀。
(12)读板：记录实验结果并保存，在10min内用多功能酶标仪于450nm下检测其OD值，将OD值带入制得的标准品标定标准曲线。
实施例7采用未经表面处理的聚苯乙烯板进行检测
包括如下步骤：
(1)包被：取新型冠状病毒抗体用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10ug/ml，取未经表面处理的聚苯乙烯酶标板，依次往样品孔中加样(100ul/孔)，共包被4*7孔，然后放置于4℃下包被过夜。
(2)洗涤：去除酶标板中的内含物，每孔加0.15M、pH＝7.4的PBST洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(3)封闭：向每个包反应孔中加含1％明胶的1％Tween-20的封闭液300ul进行封闭，于室温(20-25摄氏度)下放置1小时。
(4)倒掉反应孔中的封闭液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗涤3次，每次静置应不少于20s。每次洗涤均需拍干。
(5)加样：标准品的稀释与加样：用样品稀释液将标准品稀释至目标浓度(100ng/ml、90ng/ml、75ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、0ng/ml)，每孔分别加50ul。
(6)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
(7)洗板：倒掉样品孔中的反应液，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。
(8)反应：用稀释液将酶标抗体按一定的稀释倍数稀释后每孔加入100ul，然后于室温(20-25摄氏度)反应0.5h(小时)。
(9)洗板：倒掉未结合的酶标抗体，每孔加洗涤液300ul洗涤2min，洗板3次，每次洗涤后要在滤纸上吸干残留液体。
(10)显色：每孔加入TMB显色液50ul，置室温(20-25摄氏度)反应15min。
(11)终止：加终止液50ul/孔，轻柔震荡5s混匀。
(12)读板：记录实验结果并保存，在10min内用多功能酶标仪于450nm下检测其OD值，将OD值带入制得的标准品标定标准曲线。
实施例1-3得到的不同条件制备的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板，具体如下表1所示。
表1不同条件制备的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板检测结果表
由表1的数据可看出，采用本发明制备负载石墨烯薄膜聚苯乙烯酶标板的方法相较于其他方法单层率大幅提高，破损率大幅降低，洁净度大幅提高。
实施例5-7体现了负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板，氨基化聚苯乙烯板和未经表面处理的聚苯乙烯板在进行ELISA检测中的具体差异，具体如下表2所示。
表2不同的聚苯乙烯酶标板检测结果表
由表2的数据可看出，采用本发明制备的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板能够提高检测范围，最高检测范围可达到90ng/ml，并且具有更好的检测精密度，还能大幅减少酶标板包被抗体时间。
Claims (10)
1.负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、采用化学气相沉积法在金属基底上生长石墨烯，得到第一样片；
b、将聚甲基丙烯酸甲酯旋涂到第一样片的正面，加热固化后得到第二样片；
c、将第二样片的背面放入轰击等离子体装置，抽真空后轰击等离子体，轰击结束得到第三样片；
d、将第三样片正面朝上加入蚀刻溶液中，蚀刻掉金属基底，清洗后得到第四样片；
e、将聚苯乙烯酶标板从第四样片溶液中捞出，使第四样片平整覆盖在聚苯乙烯板表面，吸水晾干后加热烘干，得到第五样片；
f、将第五样片中的聚甲基丙烯酸甲酯去除，得到负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
2.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤a所述的石墨烯为单层石墨烯、双层石墨烯或多层石墨烯。
3.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤a所述的金属基底为铜、镍、铂、钴、铁、钼、钌或铱中的一种。
4.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：满足下述至少一项，
步骤b所述的旋涂速度为2000-5000rmp/s；或
步骤b所述的加热固化聚甲基丙烯酸甲酯的温度为60-100℃，时间为10-60min。
5.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：满足下述至少一项，
步骤c所述的抽真空时间为5-30min；或
步骤c所述的轰击等离子体的功率为Low，时间为10-60min；或
步骤c所述的轰击等离子体设备为型号PDC-002-HP的PLASMA Cleaner等离子刻蚀机。
6.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤d所述的蚀刻溶液为过硫酸铵或氯化铁，浓度为0.1-3mol/L。
7.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤d所述的蚀刻分为两次，第一次蚀刻时间为1-10h，第二次蚀刻将第三样片转移到新的蚀刻液中，蚀刻时间为1-20h。
8.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤e所述的吸水晾干时间为1-2h，加热温度为60-200℃，加热时间为5-60min。
9.根据权利要求1所述的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板的制备方法，其特征在于：步骤f所述的去除聚甲基丙烯酸甲酯的具体操作为：将第四样片泡入丙酮当中加热，加热时间10-360min，加热温度30-56℃，后依次用丙酮和异丙醇各冲洗2min，使用氮气吹干。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法直接制备得到的负载石墨烯薄膜的聚苯乙烯酶标板。
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2022
- 2022-09-07 CN CN202211099773.0A patent/CN115902208A/zh active Pending
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