CN115894652A - 桃小分子热休克基因在提高植物耐苯甲酸胁迫方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了桃小分子热休克基因PpHsp20‑26及其应用，该基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。本发明首先通过不同逆境条件下热激蛋白PpHsp20‑26基因的表达分析，发现PpHsp20‑26基因在多种外源非生物胁迫处理下表达量上调，猜测其可能参与多种胁迫响应的过程，然后将其导入到拟南芥中，发现转基因拟南芥对苯甲酸的耐受性更好，且转基因拟南芥中的过氧化氢、丙二醛的含量均比对照低，而抗超氧阴离子活力比对照高，植株体内活性氧残留更少，细胞损伤更小，进一步利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默桃中的该基因，出现相反的结果，证明该基因正向调控植物对苯甲酸的耐受性，过表达该基因能够有效增强植株抵抗苯甲酸胁迫的能力。

Description

桃小分子热休克基因在提高植物耐苯甲酸胁迫方面的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及桃小分子热休克基因在提高植物耐苯甲酸胁迫方面的应用。

背景技术

桃[Prunus persica(L.)Batsch]，蔷薇科，原产于我国，是我国栽培历史悠久分布区域广泛的主要果树之一。近年来我国桃树栽培面积稳步发展，桃产量和消费量均处于世界领先地位(USDA 2017)。但是桃的生产寿命较短，更新换代频繁，而其具有严重的连作障碍现象，无法在同一块区域重复种植，严重制约了我国桃产业的健康可持续发展。自毒物质的积累是造成桃连作障碍的重要因素，其中苯甲酸就是重要的自毒物质之一。

前人研究发现高浓度苯甲酸会抑制桃根系生长，破坏根尖的表皮细胞和薄壁细胞结构，并使细胞器发生畸变甚至消失，最终影响根系的正常功能，致使幼苗生长受阻，生物量下降。Tagliavinit和Marangoni研究发现，上一茬桃树在土壤中残留的根系越多，后来新栽植的桃苗生长所受的阻碍作用就越强。Mizutani和Kipkoriony等人通过对桃树根系中生氰糖苷水解过程的研究，发现扁桃苷水解首先产生扁桃腈，随后又进一步分解成氢氰酸和苯甲醛，苯甲醛在空气中容易氧化生成苯甲酸。Isreal通过实验发现扁桃腈、苯甲醛以及苯甲酸均会抑制幼苗的生长。

热休克蛋白(Heat shock proteins)是植物在高温、盐渍、干旱和重金属离子等非生物胁迫下诱导合成的一类应激蛋白。在逆境条件下，热休克蛋白作为分子伴侣促进其他蛋白的重新折叠、稳定、组装、胞内运输和降解，促进受损蛋白的修复和细胞的存活，从而对植物耐受逆境胁迫起着非常重要的作用。根据分子量可以将植物热激蛋白分为6类：Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、小分子热休克蛋白sHsps(或Hsp20)，其中小分子热休克蛋白种类最丰富分布最为广泛。

除热胁迫外，sHsp还被诱导应对许多其他逆境，如渗透胁迫(如盐、干旱)、氧化胁迫、低温胁迫、重金属胁迫等，表明其参与了植物对一般非生物胁迫的响应。但是关于桃小分子热休克基因Hsp20在苯甲酸胁迫下的功能目前还未见报道。

发明内容

基于此，本发明首次通过植物基因工程技术，分离克隆出桃PpHsp20-26基因完整编码区的DNA片段，并证明其具有提高桃苗抵抗苯甲酸胁迫的功能，对于缓解桃连作障碍具有重要意义。

本发明提供一种桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

本发明还提供了一种桃小分子热休克基因PpHsp20-26在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，其中，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26能够编码权利要求1中所述的蛋白质。

本发明还提供了一种桃小分子热休克基因PpHsp20-26在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，其中，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

本发明还提供了含有上述桃小分子热休克基因PpHsp20-26的表达盒、表达载体、重组菌在提高植物耐甲酸胁迫中的应用。

本发明还提供了上述桃小分子热休克基因PpHsp20-26、桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质或含有桃小分子热休克基因PpHsp20-26的表达盒、表达载体、重组菌在培育耐苯甲酸胁迫植物中的应用，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

本发明还提供了一种提高植物耐苯甲酸胁迫的方法，所述方法包括将桃小分子热休克基因PpHsp20-26导入到植物中或在植物中过表达桃小分子热休克基因PpHsp20-26。

其中，所述植物包括但不限于拟南芥、桃。

本发明首先通过不同逆境条件下热激蛋白PpHsp20-26基因的表达分析，发现PpHsp20-26基因在多种外源非生物胁迫处理下表达量上调，猜测其可能参与了多种胁迫响应的过程，然后将其导入到拟南芥中，发现转基因拟南芥对苯甲酸的耐受性更好，且转基因拟南芥中的过氧化氢、丙二醛的含量均比对照要低，而抗超氧阴离子活力比对照好，植株体内活性氧残留更少，细胞损伤更小，进一步利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默桃中的该基因，则出现相反的结果，证明该基因正向调控植物对苯甲酸胁迫的耐受性，过表达该基因能够有效增强植株抵抗苯甲酸胁迫的能力。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2为实施例1中PpHsp20-26基因cDNA扩增后的胶图；

图3为实施例2中不同逆境条件下PpHsp20-26基因的表达量分析，其中A为盐胁迫下的表达量分析、B为脱水处理时的表达量分析，C为低温处理下的表达量分析；

图4为实施例3中拟南芥阳性植株的鉴定结果，其中A为阳性转基因验证的胶图，B为PpHsp20-26基因超表达的验证胶图；

图5为苯甲酸胁迫对PpHsp20-26转基因拟南芥种子萌发情况的影响，其中A为长势图，B为萌发率的分析图；

图6为苯甲酸胁迫对PpHsp20-26转基因拟南芥幼苗的生长影响，其中A为根系表型，B为根长分析；

图7为苯甲酸胁迫下PpHsp20-26转基因拟南芥对苯甲酸胁迫的抗性分析，其中A为表型分析，B为叶绿素荧光成像结果分析，C为叶绿素荧光参数Fv/Fm比较分析；

图8为PpHsp20-26转基因拟南芥中关键指标分析，其中A为台盼蓝染色情况分析，B为相对电导率分析，C为丙二醛含量分析；

图9为PpHsp20-26转基因拟南芥植株内ROS的稳态分析，其中A为DAB染色情况分析，B为NBT染色情况分析，C为过氧化氢含量分析，D为抗超氧阴离子活力分析；

图10为TRV介导的VIGS系统在桃中的沉默效果验证图；

图11为PpHsp20-26基因沉默植株中PpHsp20-26基因的表达量分析；

图12为PpHsp20-26基因沉默植株表型分析，其中A为长势分析，B为株高分析，C为地下部鲜重分析，D为地下部干重分析；

图13为PpHsp20-26基因沉默植株表型分析，其中A为根系情况分析，B为总根长分析，C为根体积分析；

图14为PpHsp20-26基因沉默植株关键指标分析，其中A为叶绿素含量分析，B为丙二醛含量分析，C为过氧化氢含量分析，D为抗超氧阴离子活力分析；图15为实施例3中pk7lic8.1载体的图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1桃PpHsp20-26基因全长cDNA的克隆

研究材料毛桃实生幼苗种植在华中农业大学园艺林学学院恒温生长室，苗龄为30天。挑选生长健壮，长势一致的30株幼苗混合，迅速用液氮进行速冻。RNA的提取采用北京艾德莱生物科技有限公司EASYspin Plus Plant RNA Kit EASYspinPlus植物RNA快速提取试剂盒，将提取到的桃RNA立即放至-80℃超低温冰箱中保存以备用，取2μL RNA样品用于1％琼脂糖凝胶电泳，用Nanodrop 2000仪器(Thermo Scientific,美国)检测其浓度。

利用Primer-Primer BLAST 5.0设计引物进行PpHsp20-26基因的克隆，其中PpHsp20-26基因的序列信息参见NCBI数据库，登录号为XM_007207829.2，cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，翻译的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示，设计的扩增引物对如下：

正向引物：5’-ATGTCGATCATCCCAAGCTTTA-3’(SEQ ID NO:1)，

反向引物：5’-TTAACCAGAGATTTCAATGGCTTT-3’(SEQ ID NO:2)；

取毛桃RNA 1μg参照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa,日本)反转录试剂盒说明书进行操作，以得到的cDNA为模板，采用南京诺唯赞公司高保真酶进行PpHsp20-26基因扩增。其中反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix 1μL，正向引物2μL，反向引物2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，模板1μL，ddH₂O 18μL，反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸40s、35个循环，72℃终延伸5min。

扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。之后，用生工生物工程股份有限公司胶回收试剂盒按照使用说明回收特异目的条带。回收纯化的溶液与pEASY-Blunt Zero载体(购自北京全式金生物科技有限公司)进行连接，连接体系中基因与载体的摩尔比为7:1连接。反应总体积是5μL，其中1μL载体，4μL的PCR纯化的产物，25℃连接5min后，得pEASY-PpHsp20-26质粒载体，采用热击法转化到大肠杆菌感受态Trans5α(擎科生物，武汉)中，转化后12-16h挑取平板上单克隆于2mL离心管，加入含50μgmL^-1卡那霉素的LB液体培养基，37℃摇床震荡培养至菌液浑浊，然后吸取1μL菌液作为模板后进行阳性鉴定。试剂采用康为世纪2×Taq Master Mix(Dye)，反应体系为：2×TaqMaster Mix(Dye)12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板1μL，ddH₂O 9.5μL，PCR程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，32个循环，72℃终延伸2min。阳性鉴定引物序列如下：

正向引物：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’(SEQ ID NO:3)，

反向引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’(SEQ ID NO:4)；

获得阳性克隆后，将阳性克隆进行测序(由武汉擎科生物科技公司完成)。测序正确的克隆摇菌并使用北京全式金生物技术有限公司质粒小提试剂盒提取菌液质粒。

根据生物信息学分析cDNA序列显示，PpHsp20-26基因全长477bp，它包括的编码阅读框编码158个氨基酸，图2中PpHsp20-26扩增片段大小与之一致。

实施例2不同逆境条件下热激蛋白PpHsp20-26基因的表达分析

为了分析PpHsp20-26在不同逆境条件下的表达模式，利用qRT-PCR分析了该基因在盐、脱水和低温处理下的表达情况，进行如下处理：

盐胁迫：将桃苗置于100mM NaCl溶液中，并于25℃，65％湿度，光照16h/黑暗8h，光照强度300μmol m^-2s^-1条件下培养，在处理后0、3、6、12、24和48h取样并保存备用。

脱水处理：将桃苗置于干净的滤纸上，并于25℃，65％湿度，光照16h/黑暗8h，光照强度300μmol m^-2s^-1条件下培养，在处理后0、1、3、6、24和48h取样并保存备用。

低温处理：将桃苗置于4℃，65％湿度，光照16h/黑暗8h，光照强度300μmol m^-2s^-1培养箱中进行处理，在处理后0、3、6、12、24和48h取样并保存备用。

采用艾德莱试剂盒提取RNA，cDNA的合成参照PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser(TaKaRa,中国)反转录试剂盒的操作手册进行，qRT-PCR反应使用上海翊圣生物科技公司Hieff^TM qPCR SYBR GreenMaster Mix。qRT-PCR反应体系中有：2×Mix 5μL，cDNA 0.6μL，正向引物0.2μL，反向引物0.2μL，ddH₂O 4μL，反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s、40个循环，熔解曲线阶段按照仪器默认设置。qRT-PCR引物序列如下：

PpHsp20-26-qPCR:

正向引物:5’-GATTGGAAGGAGACCCCGGA-3’(SEQ ID NO:5)，

反向引物:5’-CCTGTGCCACTTGTCGTTCT-3’(SEQ ID NO:6)；

内参引物PpTEF2:

正向引物:5’-AGCAAGTCACCCAACAAGCATA-3’(SEQ ID NO:7)，

反向引物:5’-CCAACCAAACTCTTCAGCCAAT-3’(SEQ ID NO:8)。

如图3所示，盐胁迫、低温胁迫和脱水胁迫下PpHsp20-26的表达量均呈现先升高后降低的趋势，处理后6小时达到峰值，约为对照(0h)的5倍及以上，说明该基因参与了多种胁迫应答。

实施例3PpHsp20-26提高转基因拟南芥对苯甲酸的耐受性

(1)植物超表达载体构建

利用One stepcloning kit重组法构建pk7lic8.1-PpHsp20-26超表达载体，以实施例1中获得的带有PpHsp20-26全长片段的pEASY-Blunt Zero载体质粒为模板进行第一轮PCR反应。反应引物序列如下：

正向引物：5’-GATATAACATTACGCCGAGGATGTCGATCATCCCAAGCTTTAGA-3’(SEQ IDNO:9)；

反向引物：5’-CGCGACATATAGGGAAGAGGACCAGAGATTTCAATGGCTTTGA-3’(SEQ ID NO:10)；

反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix 1μL，正向引物2μL，反向引物2μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，模板2μL，ddH₂O 17μL，反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸1min、35个循环，72℃5min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，按照生工生物工程股份有限公司胶回收试剂盒的使用说明，回收目的条带，测定回收产物浓度。

根据pk7lic8.1载体(图谱见图15)的多克隆位点和PpHsp20-26基因的编码区序列上的酶切位点，选择StuI作为内切酶。反应体系为：10X Fastdigest Buffer 2μL，限制性内切酶StuI 1μL，pk7lic8.1载体2μg，反应程序为：37℃，10min；80℃，10min。按照重组试剂盒(One StepCloning Kit,

)的要求配制反应体系：线性化克隆载体，0.03pmol[载体使用量＝(0.02x克隆载体碱基对数)ng]；插入片段扩增产物，0.06pmol[片段使用量＝(0.04x插入片段碱基对数)ng]；

II，2μL；5x CE II Buffer，4μL。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡，置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min后，采用热击法转化到大肠杆菌感受态Trans5α中。PCR阳性鉴定方法同上，鉴定引物序列为：

正向引物：5’-CACTGACGTAAGGGATGACGCA-3’(SEQ ID NO:11)；

反向引物：5’-ACACATGAGCGAAACCCTATAAG-3’(SEQ ID NO:12)；

获得阳性克隆后，将阳性克隆进行测序(由武汉擎科生物科技公司完成)。测序正确的克隆摇菌并用北京全式金生物技术有限公司质粒小提试剂盒提取pk7lic8.1-PpHsp20-26质粒，随后将该质粒转入农杆菌GV3101感受态中(唯地生物，中国)。

(2)农杆菌介导的拟南芥遗传转化

拟南芥遗传转化采用蘸花法，具体步骤如下：

菌液复苏：将含有质粒pk7lic8.1-PpHsp20-26和pk7lic8.1(对照)的农杆菌在添加10μg mL^-1利福平和50μg mL^-1壮观霉素抗生素的LB固体培养基上划线活化，28℃恒温培养箱中暗培养2-3d至菌斑长出；

菌体活化：挑取单克隆接种至3mL含有10μg/mL利福平和50μg mL^-1壮观霉素抗生素的LB液体培养基中，28℃摇床中220rpm振荡培养12-16h，菌液浑浊后，吸取200-300uL菌液接种至50mL含相应抗生素的LB液体培养基中继续培养12-16h至菌液再次浑浊；

收集菌体：将培养好的菌液6000rpm离心10min，去除上清；

菌液重悬：使用0.5％蔗糖溶液重悬菌体，并调节菌液OD₆₀₀值至0.8-1.0左右，加入0.04％-0.05％的Silwet-77(GE，美国)；

将拟南芥初花期花序提前1d去除果荚，然后浸泡在上述重悬菌液中30-60s，用手轻捏花序；

侵染完成后，暗培养24h，然后恢复正常培养条件，可于7d后再次侵染，从而提高阳性率。

(3)转基因阳性拟南芥的筛选

待植株成熟后收获T₀代种子，对种子进行转基因阳性筛选，具体步骤如下：10mL离心管中加入少量种子，用消毒液(70％乙醇+0.5％Triton-X)洗，在种子快速下沉时，用滴管将干组织等残渣吸出；再加入8mL洗涤液，室温，旋转摇床上40rpm消毒5min，将液体、残渣吸出；加入8mL无水乙醇，室温，旋转摇床上40rpm消毒5min，在超净工作台中将液体一并吸出；在超净工作台中将无水乙醇吸出，加入无水乙醇将种子和乙醇一起吸出倒在滤纸上；待滤纸和种子上的乙醇蒸发后，轻轻将种子均匀撒在1/2MS培养基上(含50μg mL^-1卡那霉素+70μg mL^-1特美汀)，将培养基放4℃冰箱春化4d，在移至组培室。其中消毒液配方：500mL消毒液＝350mL无水乙醇+150mL ddH₂O+2.5mL Triton X-100。

之后对叶片进行DNA提取，具体方法如下：取1/2指甲盖大小的叶片到2.0mL离心管中，装1个钢珠，加入800μL TPS溶液(1L TPS：1M Tris-HCl；0.5M EDTA；KCl 74.5g；1％PVP40)，研磨机70Hz研磨2min；75℃水浴锅中加热1h，每20min翻转1次；水浴完成后将离心管12000rpm，离心10min，取上清500μL转移至新的1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下倒置几次混匀，-20℃静置1h；12000rp m，离心10min，弃上清，加入600μL 75％乙醇离壁清洗；吸干残留的乙醇，风干后加入50μL ddH₂O溶解DNA，-20℃保存备用。

(4)转基因拟南芥PCR鉴定：以提取的转基因拟南芥DNA为模板，进行PCR鉴定。反应体系为：2×Taq Master Mix(Dye)12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板1μL，ddH₂O 9.5μL，反应程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min、35个循环，72℃1min，阳性鉴定引物序列如下：

正向引物：5’-CACTGACGTAAGGGATGACGCA-3’(SEQ ID NO:11)；

反向引物：5’-CGCGACATATAGGGAAGAGGACCAGAGATTTCAATG GCTTTGA-3’(SEQ IDNO:10)；

以未做侵染转化的拟南芥叶片DNA作为阴性对照，以PpHsp20-26质粒为阳性对照。

(5)转基因拟南芥中PpHsp20-26表达水平鉴定

按上述方法提取转基因阳性拟南芥植株叶片RNA，反转录成cDNA，以此cDNA为模板进行半定量检测PpHsp20-26表达水平。所用引物序列如下：PpHsp20-26-qPCR:

正向引物:5’-GATTGGAAGGAGACCCCGGA-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物:5’-CCTGTGCCACTTGTCGTTCT-3’(SEQ ID NO:6)；

内参引物AtACTIN:

正向引物:5’-CCACATGCTATTCTGCGTTTGGACC-3’(SEQ ID NO:13)；

反向引物:5’-CATCCCTTACGATTTCACGCTCTGC-3’(SEQ ID NO:14)；

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix(Dye)12.5μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸15s、28个循环，72℃2min，

结果分析:通过蘸花法将过表达载体pK7lic8.1-PpHsp20-26和pK7lic8.1空载(对照)转化进拟南芥Col-0中，提取转化后幼苗的基因组DNA进行PCR鉴定，其中L1、L2和L3均为阳性转基因系(图4A)。进一步采用半定量阳性植株的PpHsp20-26表达量进行分析，结果显示相比于转化空载，基因PpHsp20-26在3个转基因系中均得到了超量表达(图4B)。

为了研究过表达PpHsp20-26是否能增强拟南芥对苯甲酸胁迫的耐受性，对转基因株系及对照株系EV(转空载pk7lic8.1)进行苯甲酸处理，观察处理前后的表型，同时测定相关生理指标。

首先探究苯甲酸处理下过表达PpHsp20-26对拟南芥种子萌发的影响，我们检测了转空载拟南芥种子和转基因拟南芥种子在1/2MS培养基、1/2MS培养基添加200μM和300μM苯甲酸处理下的种子萌发率。转基因株系和空载各选少量种子经过消毒后，均匀平铺到上述3种平板上，每个处理设置3个重复，每个重复30颗种子，在4℃条件下春化3d，然后放置在23℃室温环境下，并保持每天光照16h、黑暗8h，待种子萌发7d后拍照，统计萌发率。发现经过7天处理后，1/2MS培养基中的空载和过表达PpHsp20-26转基因拟南芥株系种子几乎全部萌发；虽然对照和转基因系在200μM培养基上7d内的发芽率都达到了96％以上，但是经苯甲酸处理后长势明显弱于1/2MS培养中的拟南芥(图5A)。在300μM苯甲酸处理下，空载和转基因拟南芥株系种子萌发率都明显下降，而过表达PpHsp20-26转基因拟南芥株系种子萌发率明显高于对照，且转基因系的拟南芥发芽率能达到80％左右，对照的发芽率仅仅达到25.6％(图5B)。

进一步探究苯甲酸胁迫对PpHsp20-26转基因拟南芥幼苗的生长影响，将空载和3个转基因拟南芥株系种子进行消毒处理后播种于1/2MS固体培养基，4℃条件下春化3d后放置在23℃室温环境下，并保持每天光照16h、黑暗8h，生长5d后，选取大小基本一致的幼苗在无菌环境下转移到1/2MS培养基、1/2MS培养基添加50μM、75μM和100μM苯甲酸处理下固体培养基上。在23℃室温环境中生长11d后拍照记录生长状态，并统计主根长度。图6A为苯甲酸胁迫下转基因和转空载拟南芥的根系表型。如图6B所示，在1/2MS培养基中，空载幼苗和过表达PpHsp20-26转基因拟南芥株系的生长基本一致，而在50μM、75μM和100μM苯甲酸处理下，空载幼苗和转基因拟南芥的根系生都受到了抑制，但与空载相比，过表达PpHsp20-26转基因拟南芥株系的主根长度大于对照，且有显著差异。

进一步，使用20天苗龄的转化空载的拟南芥(对照)及PpHsp20-26超表达拟南芥进行苯甲酸抗性鉴定。将空载和3个转基因拟南芥株系的20d苗龄的幼苗转移至含有0mM BA和0.4mM BA的溶液中培养3d，每个处理3个重复，每个重复20棵苗。结果如图7A所示，在无苯甲酸条件下，超表达拟南芥与对照相比没有明显的表型差异。但是经0.4mM苯甲酸处理3d后，虽然所有处理材料都受到了不同程度的伤害，但是对照组较转基因拟南芥受伤程度更加严重，叶片出现明显的白化。叶绿素荧光成像结果显示，无苯甲酸处理时，超表达拟南芥和对照组的叶绿素荧光都呈现深蓝色。而经苯甲酸处理后，对照组拟南芥的蓝色部位面积显著小于超表达拟南芥(图7B)。叶绿素荧光参数Fv/Fm可在一定程度上用于表征植物光合效率。通过测定发现，超表达拟南芥与对照组的Fv/Fm值在正常培养条件下均为0.77左右，两者无显著差异。而苯甲酸胁迫后3个转基因株系Fv/Fm分别为0.76、0.74和0.76，均显著高于对照组的0.64(图7C)。上述结果说明超表达PpHsp20-26可以提高拟南芥在苯甲酸胁迫下的光合性能。

此外，对超表达拟南芥中台盼蓝染色情况、相对电导率和丙二醛(MDA)含量和进行分析，结果显示无苯甲酸处理时，超表达拟南芥中相对电导率、MDA含量和台盼蓝染色程度与对照相比均无明显差异(图8)。而与对照相比，PpHsp20-26超表达拟南芥中的MDA含量更低，台盼蓝染色程度更浅，表明超表达拟南芥在苯甲酸胁迫下细胞膜受损程度较轻，死亡细胞较少(图8A和8C)。此外在苯甲酸处理后，对照组中相对电导率更高，说明苯甲酸胁迫下对照组的拟南芥细胞膜受损严重，膜透性增加，电解质大量泄露(图8B)。综上所述，拟南芥中超表达PpHsp20-26增强了转基因植株对苯甲酸的耐受性。

当植物处于自毒胁迫时体内将产生大量活性氧(ROS)，ROS的过度积累是引起自毒作用的一个重要原因。自毒胁迫后植物体内ROS含量可以作为衡量植物受损程度的重要指标。如图9A和图9B所示，DAB和NBT染色结果显示，苯甲酸处理下超表达拟南芥与对照相比的染色程度较浅且分布范围较小，说明拟南芥超表达系中的过氧化氢和超氧阴离子含量较少。为进一步了解植株内ROS水平，定量分析了超表达和对照组中过氧化氢含量和抗超氧阴离子活力(与超氧阴离子含量成反比)。结果显示，超表达和对照组的拟南芥中过氧化氢含量和抗超氧阴离子活力在无苯甲酸处理的条件下没有显著差异，而经苯甲酸处理后，超表达拟南芥中过氧化氢含量较低而抗超氧阴离子活力较高(图9C和9D)。以上结果说明，在苯甲酸胁迫下，PpHsp20-26超表达有利于维持植株内ROS的稳态。

实施例4PpHsp20-26在提高毛桃耐苯甲酸性中的功能鉴定

病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced Gene Silencing，VIGS)是一种不依赖转基因技术的基因功能缺失研究方法，具有不需要遗传转化、实验周期短、研究成本低及应用植物范围广等特征。由于桃中尚未建立成熟的遗传转化体系，故利用VIGS进行基因功能研究。之前的试验表明PpHsp20-26超表达可以有效提高拟南芥对苯甲酸的抗性，为了进一步深入鉴定PpHsp20-26在桃响应苯甲酸胁迫中的功能，我们通过构建VIGS载体，利用农杆菌介导的瞬时转化，降低桃苗中PpHsp20-26的表达量。

(1)载体构建

以pEASY-PpHsp20-26质粒(见实施例1)为模板，设计引物扩增PpHsp20-26基因的特异330bp片段，所用引物序列为：

正向引物：5’-GGATCCCAGCTTTCCTGAACACCAGA-3’(SEQ ID NO:15)；反向引物：5’-CCCGGGTTTCAATGGCTTTGACATCGGC-3’(SEQ ID NO:16)；

PCR反应体系为：2×Phanta Buffer 25μL，正向引物2μL，反向引物2μL，dNTP Mix1μL，模板1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，ddH₂O 18μL，PCR反应程序：95℃预变性3min，95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸20s、35个循环，72℃5min。

扩增完成后产生单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用生工生物工程股份有限公司胶回收试剂盒按照使用说明，回收特异性目的条带，测定回收产物浓度。选择BamHI和SmaI作为限制性酶切位点对回收产物和pTRV2载体(购自柯雷生物科技有限公司)进行双酶切，酶切体系为：BamHI 1μL，SmaI 1μL，10x FastDigest Buffer 2μL，pTRV2载体(或PpHsp20-26)2μg，反应程序为：37℃，10min；80℃，5min。酶切产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(生工，中国)进行纯化回收，使用T4 DNA连接酶(Invitrogen，美国)将纯化后的目的片段与载体连接，连接体系为：5x Ligase Reaction Buffer 2μL，T4 DNA Ligase0.5μL，PpHsp20-26目的片段250ng，pTRV2 100ng，金属浴25℃孵育2h。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态，挑取单克隆进行菌落PCR检测，方法同之前，所用引物序列为：

正向引物：5’-ATTCACTGGGAGATGATACGCT-3’(SEQ ID NO:17)；

反向引物：5’-CGCCGATCTCAAACAGTCTATACAC-3’(SEQ ID NO:18)；

获得阳性克隆后，将阳性克隆进行测序(由武汉擎科生物科技公司完成)。测序正确的克隆摇菌并用北京全式金生物科技有限公司质粒小提试剂盒提取TRV2-PpHsp20-26质粒备用。

(2)农杆菌转化和侵染

将构建好的载体质粒以冻融法转入农杆菌GV3101中备用，具体方法同前文。VIGS侵染以10d左右，长势健壮且均匀一致的桃苗为试验材料，具体步骤如下：

菌液复苏：用无菌枪头蘸取-80℃冰箱中保存的pTRV1(购自柯雷生物科技有限公司)、pTRV2和pTRV2-PpHsp20-26农杆菌菌液，划线于含LB固体培养基上(含50μg mL^-1卡那霉素和10μg mL^-1利福平)，28℃恒温培养箱中暗培养2-3d至有单克隆长出；

菌体活化：挑取一个单克隆至3mL LB液体培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素和10μgmL^-1利福平)，28℃摇床中220rpmin振荡培养过夜，菌液浑浊后，吸取1mL菌液接种至50mL LB液体培养基中(含50μg mL^-1卡那霉素、10μg mL^-1利福平、0.04mM AS和10mM MES)继续培养16h至菌液再次浑浊；

收集菌体：浑浊的菌液于室温下4000rpmin离心10min，去除上清；

菌液重悬：使用悬浮液IM(含0.04mM AS和10mM MgCl₂)重悬菌体，并调节菌液OD₆₀₀至1.0左右，将pTRV1与pTRV2或pTRV2-PpHsp20-26菌液等体积混合，于室温下静置3h；

注射桃叶片：用1mL一次性医用注射器吸取菌液，轻轻注射桃叶背面，注射完成后避光培养过夜，然后移入22℃光照培养箱中培养。

VIGS侵染后约10-12d后剪去少量新生叶片(非注射叶)，经液氮研磨成粉末后使用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱，中国)提取RNA，具体方法同前。RNA经反转录获得cDNA，反转录体系和程序同前文。进一步使用qRT-PCR检测目的基因表达量，所用引物序列同前文。选择沉默效率较高的植株进行后续实验。

(3)首先为验证TRV(烟草脆裂病毒)载体在桃上的沉默效率，我们通过构建pTRV2-PpPDS载体在桃中沉默PDS基因(NCBI上的登录号为：XP_007222459.1)，PDS基因编码八氢番茄红素脱氢酶，该酶是植物类胡萝卜素合成途径中的一个关键性限速酶，当其功能受到影响时，植物体由于类胡萝卜素合成受阻会表现出白化症状。与注射空载相比(pTRV1+pTRV2，记为pTRV)，注射pTRV1与pTRV2-PpPDS(记为pTRV2-PpPDS)菌液混合液的桃苗在10-12d后叶片呈现出白化症状(图10)，表明TRV介导的VIGS系统在桃中具有沉默效果。进一步我们提取了注射pTRV1与pTRV2-PpHsp20-26植株(记为pTRV::PpHsp20-26)的RNA，利用qRT-PCR技术对植株中PpHsp20-26表达量进行检测，结果显示在随机挑选的11棵桃苗中PpHsp20-26的表达水平分别得到了13.35％-74.86％的抑制(图11)。

(4)PpHsp20-26-VIGS桃苗苯甲酸胁迫抗性分析

为了鉴定沉默PpHsp20-26对桃苗在苯甲酸胁迫下抗性的影响，我们选取约20d大的PpHsp20-26-VIGS桃苗(即注射pTRV1+pTRV2-PpHsp20-26的植株，标记为pTRV::PpHsp20-26的植株)作为沉默植株进行外源苯甲酸处理。pTRV::PpHsp20-26沉默植株与对照植株(注射空载pTRV1+pTRV2的植株，标记为pTRV的植株)在清水处理(MOCK)下的表型并无明显的区别。经5mM苯甲酸(BA)处理一个月后，沉默植株和对照植株相比正常培养条件下都表现出长势弱、植株矮小和叶片发黄的症状，且沉默植株较对照植株生长受到了更加明显的抑制作用，其中株高净增长量比对照显著降低(图12A和12B)。进一步对处理后植株形态及生理生化指标进行分析显示，正常培养条件下，沉默植株和对照植株的生长情况无显著差异。而在苯甲酸处理下，沉默植株的地下部鲜重、地下部干重、总根长和根体积均显著低于对照植株(图12C和12D；图13A-C)。

此外，我们测定了沉默植株与对照植株的总叶绿素含量，结果显示正常培养下，两者无明显差异。而经苯甲酸处理后沉默植株中总叶绿素含量比对照显著减少了6.9％(图14A)。进一步对沉默植株和对照植株进行分析发现，正常培养条件下，沉默植株中的MDA含量与对照植株无明显差异，经苯甲酸处理后沉默植株中的MDA含量显著高于对照植株(图14B)。ROS水平定量分析结果显示，沉默植株在苯甲酸胁迫下过氧化氢含量相比于对照显著增加，而抗超氧阴离子活力相比于对照显著降低(图14C和14D)。

综合分析表明，将PpHsp20-26基因转入拟南芥后鉴定其功能，发现转基因超表达株系与对照相比对苯甲酸胁迫抗性有了很大提升，转基因拟南芥中的过氧化氢和丙二醛的含量均比对照要低，而抗超氧阴离子活力比对照好，植株体内活性氧残留更少，细胞损伤更小。而当桃中PpHsp20-26基因倍沉默后，这些指标出现相反的结果。这些数据表明：过表达PpHsp20-26基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的耐苯甲酸胁迫能力。

叶绿素荧光的测定：测定前先将处理后的桃苗置于完全黑暗的环境中放置30min进行暗适应，然后使用IMAGING-PAM叶绿素荧光测定仪(Walz，Effeltrich，德国)进行拍照测定，并计算光系统Ⅱ最大光合效率值Fv/Fm＝(Fm-F0)/Fm。

叶绿素含量测定：叶绿素含量测定方法参考戴文珊博士论文《金柑转录因子FcWRKY40抗逆功能鉴定及作用机制解析》。

相对电导率测定：相对电导率测定方法参考Dahro等(Two AT-Hook proteinsregulate A/NINV7 expression to modulate sucrose catabolism for cold tolerancein Poncirus trifoliata.New Phytologist,2019)。

MDA含量、总蛋白含量、H₂O₂含量、抗超氧阴离子活力的测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。

组织化学染色：分别采用DAB(diaminobenzidine，二氨基联苯胺)、NBT(nitrotetrazolium blue chloride，氯化硝基四氮唑蓝)和台盼蓝对样品进行组织化学染色，操作方法参考耿晶晶博士论文《甜橙bHLH家族转录因子发掘及CsbHLH18抗寒功能鉴定与作用机制解析》。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (7)

1.桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：20所示。

2.桃小分子热休克基因PpHsp20-26在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，其特征在于，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26能够编码权利要求1中所述的蛋白质。

3.桃小分子热休克基因PpHsp20-26在提高植物耐苯甲酸胁迫中的应用，其特征在于，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。

4.含有权利要求2所述的桃小分子热休克基因PpHsp20-26的表达盒、表达载体、重组菌在提高植物耐甲酸胁迫中的应用。

5.桃小分子热休克基因PpHsp20-26、桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质或含有桃小分子热休克基因PpHsp20-26的表达盒、表达载体、重组菌在培育耐苯甲酸胁迫植物中的应用，所述桃小分子热休克基因PpHsp20-26编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO：20所示。

6.一种提高植物耐苯甲酸胁迫的方法，其特征在于，所述方法包括将桃小分子热休克基因PpHsp20-26导入到植物中或在植物中过表达桃小分子热休克基因PpHsp20-26。

7.根据权利要求6所述的提高植物耐苯甲酸胁迫的方法，其特征在于，所述植物包括但不限于拟南芥、桃。

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