CN115894537A - 一种基于氟硼二吡咯染料的高选择性硫化氢比率荧光探针及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测硫化氢的氟硼二吡咯类新型比率荧光探针，其分子结构式如式(I)所示。本发明基于氟硼二吡咯染料，通过连续亲核反应增强分子共轭性设计策略构建硫化氢比率荧光探针，该探针高选择性地识别硫化氢，探针的荧光发射强度在594nm处逐渐增强，在542nm处逐渐减弱，二者强度比值与硫化氢浓度在一定范围内呈线性关系，并能够在细胞内对硫化氢实现双通道比率荧光成像。

Description

一种基于氟硼二吡咯染料的高选择性硫化氢比率荧光探针及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种比率荧光传感及其应用，具体涉及一种基于荧BODIPY的高选择性硫化氢比率荧光探针的制备与应用，属于有机荧光传感技术领域。

背景技术

硫化氢(H₂S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三个气态递质，由于其在生物学进展中的多重特征，硫化氢(H₂S)受到更多关注。细胞内H₂S是由半胱氨酸γ-裂解酶(CSE)和半胱氨酸β合酶(CBS)等酶由含硫氨基酸催化的酶产生的，在调节血管张力、神经调节、炎症和细胞凋亡等多种生理活性方面进一步起重要作用。H₂S浓度异常通常与多种疾病相关，包括糖尿病、阿尔茨海默氏症和肝硬化。因此，监测细胞内H₂S水平对于彻底了解H₂S在活细胞中的功能作用具有重要意义。

荧光探针因其高灵敏度、高选择性、高时空分辨率，是生物系统中最有力的检测方法之一(Chem.Soc.Rev.2015,44,6143–6160)。在众多荧光团中，氟硼二吡咯(BODIPY)染料因其高吸收系数、优异的荧光量子产率和高光稳定性而在荧光传感和成像中得到了广泛的应用。迄今为止，已有很多基于BODIPY荧光探针用于活细胞中内源性硫化氢的监测和成像，并具有高灵敏度和低检测限值。然而，这些报道的荧光探针检测硫化氢大部分都是通过荧光强度增强或减弱的检测模式，但也存在一些检测上问题，如单一荧光强度的变化也容易收到环境因素、激发光源和探针浓度的干扰上，从而导致检测误差。比率荧光探针通过两个通道波长处的荧光强度比值来检测硫化氢的浓度变化，从而表现出更好的检测精度，避免了生物成像中的系统误差。此外，H₂S荧光探针设计策略主要是探针与硫化氢的反应，包括亲核反应、迈克尔加成反应、硝基或叠氮化物的还原、金属离子配合物型等。其中，硫化氢与探针的亲核加成反应通过改变探针分子内电荷转移或阻断光诱导电子转移过程来实现荧光恢复。然而，这种亲核反应很容易被细胞活性硫源(半胱氨酸和谷胱甘肽)干扰，导致传感选择性差。因此，需要开发基于氟硼二吡咯染料，对硫化氢有比率荧光强度变化并具备优异检测选择性的荧光探针。

发明内容

本发明提供了一种氟硼二吡咯类比率荧光探针、其制备方法及其对硫化氢进行高效的荧光检测技术。

本发明所述得比率型荧光探针化学结构式如式(I)所示：

本发明的氟硼二吡咯荧光探针，通过与硫化氢发生连续亲核取代反应导致分子共轭性增强，荧光发射光谱红移，从而高选择性和精准识别检测硫化氢。在测试体系DMSO/PBS缓冲溶液(v/v,1/1,pH 7.0)中，探针在542nm处有强绿色荧光，在与硫化氢响应后，荧光发射红移至594nm，实现双波长比率荧光检测，并具有强检测选择性和检测灵敏度，并可用于裸眼定性鉴别和荧光定量检测。

本发明还提供了一种所述比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

根据合成不对称氟硼二吡咯的方法，2,4-二甲基-3-乙基吡咯和5-氯-2-醛基吡咯在三氟乙酸以及三氟化硼乙醚/三乙胺作用下合成得到3-氯取代氟硼二吡咯化合物2，此化合物在一氯化碘中反应得到化合物3，最后，化合物3与2-甲醛苯基硼酸在Pd催化剂下发射Suzuki偶联反应，反应结束后经过后处理得到比率荧光探针。

制备化学反应式如下

本发明还提供了一种所述的新型比率荧光探针对NaHS的光谱响应和细胞成像方面的应用。

本发明所述的比率荧光探针，在DMSO/PBS(v/v,1:1,pH 7.4)中，呈现最大发射峰为542nm荧光，在加入NaHS后，发生连续亲核取代反应后，探针的吸收和发射光谱明显红移，此时542nm处荧光减弱，产生最大发射为594nm的荧光，从而实现了比率荧光检测硫化氢，如图3和4所示，其中探针的荧光强度比(I_594nm/I_542nm)在NaHS(0-75μM)浓度范围内显示线性关系变化，可确定本发明所述的荧光可以定量检测硫化氢浓度，如图5所示。

本发明所述的比率荧光探针在活细胞中对硫化氢检测成像应用。探针(5μM)在HeLa细胞中孵育30分钟后，绿色通道(510-560nm)中有强荧光信号，而红色通道(570-630nm)中几乎没有信号。在细胞培养基中加入NaHS(300μM)并孵育60分钟，绿色通道中的荧光信号减弱，而红色通道中的发射信号显著增强，表明探针能够通过双通道荧光信号变化监测活细胞中硫化氢，如图8所示。

本发明的有益效果为：该比率荧光探针可高选择性检测硫化氢。随着硫化氢浓度的增加，探针的荧光发射强度在594nm处逐渐增强，在542nm处逐渐减弱；二者荧光比值与硫化氢浓度在一定范围内呈线性关系。该比率荧光探针不仅有优异的选择性和灵敏度，而且能够用于活细胞中硫化氢的双通道比率荧光成像。

附图说明

图1为本发明比率荧光探针的合成路线。

图2为本发明比率荧光探针对NaHS的响应传感机制。

图3为本发明比率荧光探针对不同浓度NaHS作用后的吸收变化谱图。

图4为本发明比率荧光探针对不同浓度NaHS作用后的荧光发射变化谱图。

图5为本发明比率荧光探针对不同浓度NaHS(0-75μM)作用后的荧光比值变化(I_594nm/I_542nm)谱图。

图6为本发明比率荧光探针与NaHS(500μM)作用后荧光发射随时间比变化谱图。

图7为本发明比率荧光探针对不同物种作用后的荧光比值变化(I_594nm/I_542nm)谱图。

图8为本发明比率荧光探针在Hela细胞的荧光成像图。

具体实施方式

实施例1

将5-氯-吡咯-2-甲醛(0.39g，3mmol)和2,4-二甲基-3-乙基吡咯(0.36g，3mmol)溶解在CH₂Cl₂(80mL)溶液中，在N₂加入三滴三氟乙酸，搅拌反应过夜。依次加入Et₃N(3mL)和BF₃Et₂O(3mL)，并持续搅拌反应2小时。然后，用盐水洗涤混合物，有机层用硫酸钠干燥，过滤，并在真空下浓缩。通过柱色谱法纯化残余物，得到化合物2(0.36g,43％).¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.98(s,1H),6.79(d,J＝3.6Hz,1H),7.25(d,J＝3.2Hz,1H),2.58(s,3H),2.43-2.37(m,2H),2.17(s,3H),1.08(t,J＝3.6Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:163.9,140.9,136.9,136.0,135.3,131.6,125.4,122.1,115.1,17.2,14.2,13.3,9.4。

实施例2

将化合物2(0.28g，1mmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺和甲醇(5mL/10mL)的混合溶液中。室温下缓慢滴加一氯化碘(0.19g，1.2mmol)，搅拌反应1小时。用硫代硫酸钠溶液(20mL)淬灭反应，并进一步用二氯甲烷(40mL*2)萃取，有机层用硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并通过硅胶柱色谱进一步纯化，得到红色固体化合物3(0.3g,74％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:6.92(s,1H),6.88(s,1H),2.58(s,3H),2.40(q,J＝7.6Hz,2H),2.18(s,3H),1.08(t,J＝7.6Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:166.1,142.0,138.9,136.3,132.5,130.3,120.9,77.0,17.3,14.0,13.3,9.4。

实施例3

将化合物3(50mg，0.12mmol)、化合物4(32mg,，0.13mmol)在THF(10mL)中的溶液鼓泡氩气10分钟，然后加入Pd(PPh3)₄(7mg，6μmol)和K₂CO₃(2M，0.2ml)。氮气保护下，混合物在80℃下加热反应8小时。冷却至室温后，将乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)倒入混合物中。收集有机层，用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到呈橙色固体的探针(32mg,68％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:10.06(s,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.63-7.65(m,1H),7.47-7.52(m,2H),7.06(s,1H),6.85(s,1H),2.63(s,3H),2.42-2.47(m,2H),2.22(s,3H),1.12(t,J＝8Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ:192.0,166.2,141.7,136.3,134.0,133.7,131.4,130.7,128.2,127.6,125.1,121.8,17.3,14.1,13.6,9.5；MS(ESI):calculated for C₂₀H₁₈BClF₂N₂O[M+Na]⁺409.1065,found 409.1060。

实施例4

探针对不同浓度的硫化氢的光谱变化图：探针加入到DMSO/PBS(pH 7.4,20mM,v/v1:1)测试溶液中配置成浓度为5μmol/L的溶液，而后滴加不同浓度的NaHS水溶液(由于硫化氢为气体，采用NaHS作为模型进行测试)，待平衡后，分别测定吸收和荧光发射光谱，结果见图3和图4。

从图3和4得知，加入NaHS后，探针的光谱明显红移，最大吸收峰红移到568nm，溶液颜色从橙色到紫色。同时，探针在594nm处荧光发射显著增强，而在542nm荧光减弱，因此探针可以作为硫化氢的比率型荧光探针实现对其定量检测。

实施例5

探针加入到DMSO/PBS(pH 7.4,20mM,v/v 1:1)测试溶液中配置成浓度为5μmol/L的溶液，然后加入500μmol/L的NaHS，记录不同时间的荧光光谱，如图6所示。

结果由图6可知显示，随着时间的增加，探针的荧光强度I_594nm增强，且I_542nm减弱，直至60分钟稳定，说明探针可以作为检测硫化氢的比率型荧光探针。

实施例6

测试比率荧光探针检测选择性：探针加入DMSO/PBS(v/v，1:1，pH 7.4)试溶液中配置成浓度为5μmol/L的溶液，再加入各种干扰物质，包括Ala，Glu，GSH，Cys，Hcy，H₂O₂，S₂O₃ ^2-，Cl^-，Br^-，NO₂ ^-，SO₄ ^2-，ClO^-，Mg²⁺和K⁺，测试其荧光强度比(I_594nm/I_542nm)的变化。

由图7可知，探针的荧光强度比值仅对硫化氢有很大的变化，其他物种影响很弱，表明探针对硫化氢的选择性高于其他物种。

实施例7

细胞内荧光成像测试：将Hela细胞转移到共聚焦成像用的玻璃瓶中孵化24h后，实验组用该探针(5μM)溶液孵化30分钟，然后PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。对照组在探针(5μM)细胞培养30分钟后，再加入NaHS(300μM)溶液孵化60分，接着用PBS洗涤三次进行共聚焦细胞成像检测。在510-560nm和570-630nm的发射范围内收集探针的绿色通道和红色通道发射，分别在488nm和543nm激发。如见图8。

由图8可知，探针在HeLa细胞中绿色通道中有强荧光信号，而红色通道中几乎没有信号；一旦细胞在培养基中进一步与NaHS(300μM)孵育60分钟，绿色通道中的荧光信号减弱，而红色通道中的发射信号显著增强，表明探针能够监测活细胞中的细胞内硫化氢。

Claims (8)

1.一种基于不对称氟硼二吡咯染料的比率荧光探针，其特征在于，所述比率荧光探针的结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的比率荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)2,4-二甲基-3-乙基吡咯和5-氯-2-醛基吡咯通过不对称氟硼二吡咯方法得到化合物3-氯取代氟硼二吡咯；

(2)步骤(1)得的化合物进行一氯化碘的碘化反应，接着与2-甲醛苯基硼酸的Suzuki偶联反应，反应结束后处理得到所述的比率荧光探针。

3.一种如权利要求1所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述比率荧光探针应用于硫化氢的光谱响应或细胞成像。

4.根据权利要求3所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述的荧光探针是对硫化氢的光谱响应。

5.根据权利要求3或4所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述的荧光探针对硫化氢的光谱响应的检测，具体方法如下：

将所述的荧光探针配置成测试溶液，然后加入待测样品，测定测试溶液前后的吸收光谱，如果吸收光谱明显红移，溶液颜色从橙色变为紫色，则说明待测样品中存在硫化氢。

6.根据权利要求3或4所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述的荧光探针对硫化氢的光谱响应的检测，具体方法如下：

(1)将所述的荧光探针配置成测试溶液，然后加入待测样品，观察其荧光光谱变化；

(2)计算得到荧光强度比值I_594nm/I_542nm，根据荧光强度比值I_594nm/I_542nm确定硫化氢的浓度，根据3σ/k方法，计算检测限。

7.根据权利要求6所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述测试溶液的配制方法如下：

将DMSO/PBS(v/v,1:1,pH 7.4)加入到所述荧光探针中，配置成浓度为5μmol/L的测试溶液。

8.根据权利要求3或4所述的比率荧光探针在硫化氢检测中的应用，其特征在于，所述的荧光探针用于细胞内荧光成像测试，具体方法如下：将待测细胞用包括探针的新鲜无FBS培养基进行孵化，然后PBS洗涤三次，进行共聚焦细胞成像检测；

共聚焦细胞成像检测时，激发波长分别为488nm和543nm，绿色通道收集波长为510-560nm，红色通道收集波长为570-630nm；

将探针在HeLa细胞中孵育30分钟后，绿色通道(510-560nm)中具有强烈的荧光信号，而红色通道(570-630nm)中几乎没有信号；此外，细胞在培养基中进一步与NaHS(300μM)孵育60分钟，路色通道中的荧光信号减弱，而红色通道中的发射信号明显增强。

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