CN115887621A - 调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物制剂技术领域,具体为调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体及其制备方法。本发明的共递释脂质体,以磷酸钙为内核包载两种药物:一为调控系统性免疫应答的小分子药物,二为调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子,通过调控肿瘤宿主的系统和局部免疫应答来增加免疫荒漠型肿瘤中浸润的T细胞,提高免疫治疗的抗肿瘤效果。小分子药物优选大麻二酚,细胞因子优选肿瘤坏死因子LIGHT蛋白。本发明构建的共递释脂质体适用于免疫荒漠型肿瘤,原位移植瘤模型试验表明,有助于提高患者体内的T细胞免疫应答,改善肿瘤患者对ICIs的响应率,共递释脂质体可显著增强ICI的抗肿瘤疗效。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域,具体涉及调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体及其制备方法。
背景技术
癌症是危害人类健康、破坏家庭及社会和谐最严重的疾病之一。目前,临床上用于肿瘤治疗的主要手段有手术治疗、放射治疗和化学治疗,虽然在一定程度上改善了癌症患者的生存状况,但患者的生存期依然较短,无法达到疗效的效果。近年来,随着免疫学及生命科学的发展,癌症免疫治疗成为一种新兴的治疗手段,是继手术治疗、放疗和放疗后的第四种重要手段。
免疫治疗主要有免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)、肿瘤疫苗、嵌合抗原受体T细胞疗法、溶瘤病毒和细胞因子疗法等。其中ICIs是过去十年中,肿瘤免疫治疗领域中取得的最重要的研究进展。最具代表性的免疫检查点分子是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4,CTLA-4)和程序化细胞死亡蛋白1(Programmed cell death protein 1,PD-1),相应的抗CTLA-4抗体和抗PD-1抗体在一些肿瘤中取得了较好的治疗效果。然而,在大多数肿瘤上,ICIs的响应率依然不到20%,在“免疫荒漠型”肿瘤上响应率甚至不到10%。因此,单独的ICIs疗效有限,需要根据肿瘤的特点寻求提高ICIs响应率的治疗方案。
区别于传统疗法,ICIs主要靶向免疫细胞而非肿瘤细胞,主要依赖于机体预先存在的抗肿瘤T细胞免疫应答。然而,大多数“免疫荒漠型”肿瘤内缺乏T细胞浸润,从而降低了肿瘤对ICIs的响应率。“免疫荒漠型”肿瘤缺乏效应T细胞浸润主要源于两方面原因:系统性免疫抑制和局部免疫抑制。首先,肿瘤是一种系统性疾病,随着肿瘤的慢性生长,通常会诱导系统性免疫的功能和组成异常变化,导致系统性树突状细胞(Dendritic cells,DCs)减少,粒-单核细胞祖细胞显著增加,而循环的T细胞显著减少。其次,肿瘤微环境(Tumormicroenvironment,TME)内呈高度免疫抑制,会诱导肿瘤内的抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APCs)功能异常,例如TME内的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associatedmacrophages,TAMs)和DCs诱导免疫抑制而不发挥抗原呈递作用,抑制局部免疫应答,阻碍肿瘤特异性T细胞的产生。以上两方面因素均导致了“免疫荒漠型”肿瘤特异性T细胞产量的降低。此外,由于肿瘤的快速生长,血管功能异常,大量新生的血管内皮细胞缺乏功能性粘附因子ICAM-1和VCAM-1等,对T细胞浸润造成了物理屏障作用,导致血液循环中的T细胞无法顺利浸润肿瘤实质。且由于TME中的免疫抑制导致T细胞招募的趋化因子,例如CXCL9、CXCL10、CCL21、CXCL13等处于较低水平,进一步降低了肿瘤对外周T细胞的招募作用。综上所述,对于“免疫荒漠型”肿瘤,系统性免疫抑制和肿瘤的局部免疫抑制共同造成了肿瘤内T细胞的缺乏。因此有必要寻找新的治疗药物增强宿主的系统性免疫力,同时提高肿瘤内的局部免疫应答水平,增加宿主体内的特异性T细胞产量,从而提高“免疫荒漠型”肿瘤对ICIs的响应率。
大麻二酚(Cannabidiol,CBD)是大麻中的非致幻性成分,是研究者们1940年最初从大麻中分离得到,随后在1963年鉴定其化学结构。CBD在神经精神系统疾病、心血管和肿瘤等疾病领域展现出潜在的临床应用价值。虽然近年来有众多研究关注CBD在抗肿瘤上的应用,但目前大多数的研究都集中在CBD对肿瘤细胞的调控和杀伤上,对于CBD调控免疫系统的作用鲜有报道。本发明利用CBD来增强系统性免疫,考虑到CBD的水溶性较差,体内生物利用度仅为10%左右,为此本发明将CBD构建成磷酸化前药CP。CP在体内能有效增加荷瘤小鼠体内的T细胞数量,与促炎细胞因子LIGHT联用后,可有效增加“免疫荒漠型”肿瘤内的T细胞浸润,提高ICIs的疗效。本发明发现的CBD及其前药的新作用,将其应用于“免疫荒漠型”肿瘤的辅助治疗,在临床上有助于提高患者体内的T细胞免疫应答,改善肿瘤患者对ICIs的响应率,具有很好的临床转化价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强系统免疫的磷酸化前药和改善局部免疫微环境细胞因子的共递释系统,用于提高免疫荒漠型肿瘤对ICI的响应性。通过磷酸钙脂质体技术共递送磷酸化前药和质粒,从而增加免疫荒漠型肿瘤中效应T细胞浸润的目的。具体地,即提供一种调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体及其制备方法。
本发明提供的调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体,以磷酸钙为内核,其中包载有两种药物;其中一种药物为调控系统性免疫应答的小分子药物,另一种药物是调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子,通过调控肿瘤宿主的系统和局部免疫应答来增加免疫荒漠型肿瘤中浸润的T细胞,提高免疫治疗的抗肿瘤效果。
所述调控系统性免疫应答的小分子药物,选自具有免疫增强作用的天然产物,调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子选自炎性细胞因子或T细胞趋化因子。
进一步地,所述调控系统性免疫应答的小分子药物,优选为大麻二酚(CBD);利用大麻二酚的羟基将其磷酸化,制备成磷酸化前药CP,利用CP与钙离子的络合性,从而将CP包载到磷酸钙内核中。
进一步地,所述调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子,优选肿瘤坏死因子超家族第14个成员(TNFSF14),又称为LIGHT蛋白。并采用编码LIGHT蛋白的质粒(pLIGHT),利用静电作用将其包载于磷酸钙内核中。
进一步地,所述共递释脂质体粒径为20~80nm,编码LIGHT蛋白的质粒的载药量为0.1~0.5%,磷酸化前药CP的载药量为1~2%,包载的质粒与CP质量比为1:2~1:20。
进一步地,所述编码LIGHT蛋白的胞外段序列,该序列包括信号肽Flt3l序列、异亮氨酸拉链ILZ序列和LIGHT胞外段序列三个部分。
进一步地,所述磷酸钙内核采用两亲性磷脂1,2-油酰磷脂酸(DOPA)分散剂,其磷酸极性头部在油水界面与内核络合,疏水性尾部分布在油相,在内核表面形成具有稳定功能的疏水层。
所述磷酸钙内核外层采用磷脂包覆,磷脂选用(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP),甲氧基封端聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)和靶向肽修饰的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。其中聚乙二醇增加纳米粒的长循环性。
所述共递释脂质体上修饰有肿瘤靶向肽。
所述肿瘤靶向肽选自载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白E及其相应的合成多肽。
所述肿瘤靶向肽选自载脂蛋白E多肽(ApoE),多肽序列为CWG-(LRKLRKRLLR)2-NH2,并与马来酰亚胺封端的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG2000-DSPE)连接,得到ApoE多肽修饰的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(ApoE-PEG2000-DSPE),便于修饰到脂质磷酸钙纳米粒表面。
本发明还提供所述共递释脂质体的制备方法,具体步骤为:
(1)通过反相微乳法制备荷载细胞因子(如LIGHT蛋白质粒)和小分子药物的磷酸钙脂质体核心;具体是将含有压缩后细胞因子(如LIGHT蛋白质粒)的油包水型乳液加入到含有磷酸化小分子药物的油包水型乳液中,充分反应形成核心后,进行离心、洗涤;
(2)将磷酸钙纳米材料与脂质体材料混合,采用薄膜分散法制备磷酸钙脂质体;具体是把包载细胞因子(如LIGHT蛋白质粒)和磷酸化小分子药物的磷酸钙核心与脂质材料进行薄膜分散,再通过水化法在磷酸钙核心上包覆不对称的脂质层。
进一步地,步骤(1)的具体流程为:
将两份20mL的油相室温搅拌15~30min,其中,一份作为钙相,加入200~300μL2.5MCaCl2和60~600μg pLIGHT,室温搅拌15-20min;将100~300μL 12.5mM的CP溶液和100~300μL 12.5mM的Na2HPO4溶液混合均匀,加入至另一份油相中,作为磷相,搅拌15-20min。将两相混合,加入100~300μL DOPA氯仿溶液,搅拌45~90min。搅拌结束后,加入无水乙醇破乳,4℃下12,500g离心20min,将沉淀用无水乙醇继续洗涤2遍,最后用氯仿重悬,得到的磷酸钙纳米粒核心,-20℃保存待用。
步骤(2)的具体过程为:
将步骤(1)得到的磷酸钙纳米粒核心与DOTAP、mPEG2000-DSPE、胆固醇和ApoE-PEG2000-DSPE分散于氯仿中,旋蒸成膜,用5%葡萄糖或PBS水化薄膜,超声分散后得到共递释脂质体ApoE-pLIGHT@CaCP。
所述的共递释脂质体可以单独或与T细胞为基础的免疫疗法联合,用于免疫荒漠型肿瘤的治疗。
本发明所采用的共递释技术主要为磷酸钙脂质体技术,通过在外层掺入PEG化脂质延长制剂在体内的循环时间,同时借助正电荷性的DOTAP增加质粒的转染效率。
本发明采用肿瘤靶向肽来增加共递释脂质体在肿瘤部位的聚集,作为优选,采用ApoE多肽。ApoE多肽通过共价键连接于Mal-PEG2000-DSPE末端,具有较好的肿瘤靶向性。
本发明采用反相微乳法结合薄膜分散法制备包载两种药物的共递释脂质体,并在脂质材料中混入肿瘤靶向肽材料ApoE--PEG2000-DSPE,作为优选,LIGHT质粒的包封率为51.7%,载药量为0.21%,CP的包封率为53.4%,载药量为1.45%,脂质体中包载的LIGHT质粒与CP的质量比为1:7。
附图说明
图1为大麻二酚前药合成路线和质谱表征。其中,(A)为磷酸化大麻二酚(CP)合成路线示意图,CBD代表大麻二酚,POCl3为三氯氧磷,THF为四氢呋喃,TEA为三乙胺,rt为室温;(B)正离子模式下质谱图;(C)负离子模式下质谱图。
图2为CP核磁共振氢谱图(1H-NMR)。
图3为CP核磁共振碳谱图(13C-NMR)。
图4为共递释脂质体的制备过程示意图。
图5为共递释脂质体的制剂学表征。其中,(A)编码LIGHT质粒的示意图;(B)
ApoE-pLIGHT@CaCP的粒径分布、多分散系数(PDI)和表面电势,制剂外观照片;(C)ApoE-pLIGHT@CaCP的透射电镜图,标尺50nm;(D)EGFP-ApoE-pLIGHT@CaCP体外转染GL261细胞荧光显微镜照片,以市售的Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent作为阳性对照,标尺为100μm;(E)ApoE-pLIGHT@CaCP体外转染GL261细胞,以市售的Hieff TransTMLiposomal Transfection Reagent作为阳性对照,采用ELISA检测转染细胞分泌的细胞因子LIGHT,数据以平均值±SD(n=5)表示,ns表示无显著性差异;(F)ApoE-pLIGHT@CaCP体内转染LIGHT蛋白的分泌水平,数据以平均值±SD(n=3)表示,**p<0.01。
图6为CP转化为原药大麻二酚。其中,(A)前药试验转化方案示意图;(B)高效液相色谱分析结果。
图7为ApoE-pLIGHT@CaCP的体外和体内脑靶向验证。其中,(A)体外Transwell试验示意图;(B)体外Transwell定量结果,数据以平均值±SD(n=3)表示,***p<0.001;(C)健康C57BL/6小鼠离体大脑成像图;(D)离体大脑成像半定量数据,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05;(E)荷原位胶质瘤C57BL/6小鼠的活体成像图;(F)荷原位胶质瘤C57BL/6小鼠活体成像的半定量数据,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。(G)荷胶质瘤大脑体外成像图;(H)荷胶质瘤大脑体外成像半定量数据,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05。
图8为ApoE-pLIGHT@CaCP促进抗原呈递细胞活化。其中,(A)ApoE-pLIGHT@CaCP对BV2细胞摄取香豆素6标记纳米粒的半定量数据,数据以平均值±SD(n=6)表示,***p<0.001;(B)ApoE-pLIGHT@CaCP对RAW264.7细胞摄取香豆素6标记纳米粒的半定量数据,数据以平均值±SD(n=6)表示,***p<0.001;(C)ApoE-pLIGHT@CaCP对BMDC细胞摄取香豆素6标记纳米粒的半定量数据,数据以平均值±SD(n=3)表示,**p<0.01;(D)
ApoE-pLIGHT@CaCP对BMDC细胞成熟度的影响,数据以平均值±SD(n=3)表示,***p<0.001;(E)ApoE-pLIGHT@CaCP对BMDC细胞呈递OVA抗原的影响,数据以平均值±SD(n=3)表示,***p<0.001。
图9为ApoE-CaCP的体内抗胶质瘤和免疫调控作用。其中,(A)不同剂量ApoE-CaCP给药示意图和设计方案;(B)荷瘤小鼠的肿瘤生物发光图;(C)生物发光半定量图,数据以平均值±SD(n=5)表示,ns,无显著性差异;(D)各组小鼠的脾脏解剖照片图;(E)各组荷瘤小鼠的脾指数,数据以平均值±SD(n=5)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(F)各组荷瘤小鼠脾脏中的脾细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(G)各组荷瘤小鼠的胸腺解剖照片图;(H)各组荷瘤小鼠的胸腺指数,数据以平均值±SD(n=5)表示,**p<0.01,***p<0.001;(I)各组荷瘤小鼠胸腺中的胸腺细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,***p<0.001;(J)各组荷瘤小鼠胸腺中的T细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(K)各组荷瘤小鼠脾脏中的CD8+和CD4+T细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01;(L)各组荷瘤小鼠脾脏中的CD8+和CD4+初始T细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(M)各组荷瘤外周血中的CD8+和CD4+T细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05;(N)各组荷瘤小鼠外周血中的CD8+和CD4+初始T细胞数量,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
图10为ApoE-CaCP对胶质瘤内T细胞浸润影响。其中,(A)不同ApoE-CaCP给药剂量下胶质瘤内CD8+T细胞比例变化,数据以平均值±SD(n=3)表示,ns,无显著性差异;(B)不同ApoE-CaCP给药剂量下胶质瘤内CD4+T细胞比例变化,数据以平均值±SD(n=3)表示,ns,无显著性差异。
图11为ApoE-pLIGHT@CaCP的体内抗胶质瘤作用。其中,(A)各制剂的给药示意图和设计方案;(B)各治疗组荷瘤小鼠的肿瘤生物发光图;(C)肿瘤生物发光半定量图,数据以平均值±SD(n=5)表示,ns,无显著性差异;(D)各制剂治疗荷瘤小鼠的生存曲线图(n=6);(E)各制剂治疗荷瘤小鼠的体质量曲线图(n=6)。
图12为ApoE-pLIGHT@CaCP调控局部和系统性免疫应答。其中,(A)肿瘤内高内皮微静脉免疫荧光染色图,MECA79+CD31+阳性区域为高内皮微静脉;(B)高内皮微静脉阳性区域比例,数据以平均值±SD(n=6)表示,*p<0.05,***p<0.001;(C)肿瘤内B淋巴细胞和T淋巴细胞的免疫荧光染色图;(D)肿瘤内的T淋巴细胞半定量图,数据以平均值±SD(n=6)表示,*p<0.05,***p<0.001;(E)流式细胞术分析肿瘤微环境内各免疫细胞比例,数据以平均值±SD(n=3)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(F)ELISA分析肿瘤内淋巴细胞趋化因子和免疫抑制细胞因子水平,数据以平均值表示;(G)各组荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数,数据以平均值±SD(n=5)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(H)荷瘤小鼠脾脏中的CD8+和CD4+T细胞比例,数据以平均值±SD(n=5)表示,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(I)荷瘤小鼠外周血中CD8+和CD4+T细胞比例,以及肿瘤特异性CD8+T细胞比例,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001;(J)荷瘤小鼠淋巴结中CD80+CD86+DC细胞比例,以及CD8+和CD4+T细胞比例,**p<0.01,***p<0.001。
图13为ApoE-pLIGHT@CaCP协同αPD-1治疗原位胶质瘤。其中,(A)各制剂的给药示意图和设计方案;(B)各治疗组荷瘤小鼠的肿瘤生物发光图;(C)肿瘤生物发光半定量图,数据以平均值±SD(n=6)表示,ns,无显著性差异;(D)各制剂治疗荷瘤小鼠的生存曲线图(n=6);(E)各制剂治疗荷瘤小鼠的体质量曲线图(n=6);(F)肿瘤的HE染色和Ki-67免疫组织化学染色;(G)肿瘤细胞二次接种挑战示意图;(H)小鼠接受肿瘤细胞二次接种挑战后生存曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步的说明。在具体的实施例中,增加了很多细节描述来使得本发明更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由其他元件、材料、方法所替代。
实施例1:大麻二酚前药合成。
由于大麻二酚的水溶性较差,口服生物利用度低。因此,为了改善大麻二酚的生物利用度和给药方式,首先合成了大麻二酚前药,选择将大麻二酚的羟基磷酸化。
合成:将600μM大麻二酚溶于10mL的无水四氢呋喃(THF)中,加入500μL的三乙胺(TEA)。将180μL的三氯氧磷(POCl3)分散于10mL无水THF中,然后将其逐滴加入到大麻二酚的THF溶液中,反应在0℃进行30min。结束后,继续将反应在氮气保护下,室温反应6h。加入三蒸水20mL,旋蒸除去THF,加入5%NaOH调节pH至10.0,用乙酸乙酯萃取除去未反应的大麻二酚。最后往萃取后的水溶液中加入6M浓盐酸,沉淀出磷酸化大麻二酚(CP)。用无水乙醇溶解CP,除去多余的氯化钠,旋蒸除去无水乙醇。用水和叔丁醇混合溶液溶解纯化的CP,冻干得到粉末状CP。通过质谱和核磁共振表征产物。
结果显示:如附图1(B)、(C)所示,在质谱的正离子模式中检测到CP的[M+H]+和[M+Na]+峰,负离子模式中检测到[M-H]-峰。如附图2所示磁共振氢谱,解析后各氢峰化学位移与CP吻合:δ=6.91(s,2H),5.11(s,1H),4.45(s,1H),4.39(s,1H),3.87(d,J=12.1Hz,2H),2.91-2.82(m,1H),2.48-2.40(t,2H),2.20(s,1H),1.60(s,6H),1.52(s,2H),1.31(s,4H),1.26-1.18(m,2H),0.87(t,J=6.9Hz,3H)。如附图3所示磁共振碳谱,解析后各碳峰化学位移与CP吻合:δ=147.91,140.29,130.78,124.24,122.20,114.48,110.50,45.14,44.25,36.05,34.73,30.83,30.20,29.65,28.67,28.59,23.30,21.79,18.55,13.75,8.71。
综上,表明该方案成功合成前药磷酸化大麻二酚CP。
实施例2:包载大麻二酚前药CP和质粒pLIGHT共递释脂质体的制备和表征。
合成得到大麻二酚前药CP后,为了实现对系统性的免疫调控和脑肿瘤的局部免疫调控,我们选择静脉注射的给药方式,同时为了增加CP在脑肿瘤中的聚集,将CP包载在磷酸钙纳米粒中,对纳米粒修饰脑靶向多肽ApoE,以此达到系统性和局部免疫调控的目的,同时解决大麻二酚低生物利用度的问题。
对于单独包载CP的磷酸钙脂质体ApoE-CaCP的制备:将两份20mL油相(环己烷:CO-520=70:30,v/v)室温搅拌15min,其中一份作为钙相,加入300μL 2.5M CaCl2,室温搅拌20min。将200μL 12.5mM的CP溶液和100μL 12.5mM的Na2HPO4溶液混匀,加入至另一份油相中,作为磷相,搅拌20min。将两相混合,加入300μL DOPA氯仿溶液,搅拌45min。搅拌结束后,加入无水乙醇破乳,4℃下12,500g离心20min,将沉淀用无水乙醇继续洗涤2遍,最后用氯仿重悬。将得到的核心与DOTAP、mPEG2000-DSPE、胆固醇和ApoE-PEG2000-DSPE分散于氯仿中(其中ApoE多肽可促进制剂的脑靶向性),旋蒸成膜,用5%葡萄糖水化薄膜,超声分散后得到磷酸钙脂质体ApoE-CaCP。采用动态光散射表征ApoE-CaCP的粒径和电位,并检测CP包封率。
对于单独共载CP和质粒pLIGHT的磷酸钙脂质体ApoE-pLIGHT@CaCP的制备:将两份20mL油相(环己烷:CO-520=70:30,v/v)室温搅拌15min,其中一份作为钙相,将180μg的pLIGHT与300μL 2.5M的CaCl2混匀,加入25μL 8mg/mL的环八肽压缩质粒,室温搅拌20min。将200μL 12.5mM的CP溶液和100μL 12.5mM的Na2HPO4溶液混匀,加入至另一份油相中,作为磷相,搅拌20min。其余步骤同上,制备得到共递释脂质体ApoE-pLIGHT@CaCP。检测CP和pDNA的包封率。
体外:取对数生长期的GL261,种于共聚焦培养皿中,待细胞生长至融合度达到70%,给予Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent和EGFP-ApoE-pLIGHT@CaCP培养6h,PBS洗3次后,无血清培养基(Opti-MEM)继续培养24h后分别进行拍照,共聚焦观察EGFP的表达情况,采用ELISA检测LIGHT蛋白的表达水平。
体内:建立原位GL261胶质母细胞瘤模型,第0天接种30w个GL261细胞,接种后的第10天,隔2天注射一次ApoE-pLIGHT@CaP或ApoE-pLIGHT@CaCP,CP注射剂量为10mg/kg,pDNA注射剂量为30μg/只,共注射2次。在第二次注射24h后,解剖分离血清、心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺和肿瘤,采用ELISA检测各组织脏器中LIGHT蛋白的表达水平。
结果显示:共递释脂质体的制备过程示意图如图4所示,ApoE-CaCP的粒径为34.3±5.0nm,多分散系数为0.262±0.011,zeta电位为15.8±1.7mv,CP包封率为52.08±3.62%。质粒的构建示意图如图5A所示。ApoE-pLIGHT@CaCP的粒径分布和制剂外观如图5B所示,粒径为35.9±1.5nm,多分散系数为0.250±0.021,zeta电位为13.1±2.1mv;透射电镜如图5C所示,可见圆形球形粒子。CP包封率为53.39±5.46%,pDNA包封率为51.7±4.8%。
如图5D所示,ApoE-pLIGHT@CaCP组转染后,EGFP的荧光强度与市售的转染制剂相当,这一点与图5E中ELISA检测的结果相一致。此外,如图5F所示,相比单独包载pLIGHT的磷酸钙脂质体,共递释脂质体可显著增强其在肿瘤中的蛋白表达水平。
实施例3:包载前药CP在体外细胞上的转化。
为了验证合成的CP能在细胞内转为原药大麻二酚,将ApoE-pLIGHT@CaCP与细胞孵育后,检测细胞内CP是否能转化成大麻二酚原药。
将GL261和DC2.4细胞种于6孔板中,完全培养基贴壁过夜,将培养基更换为含ApoE-pLIGHT@CaCP的无血清培养基(CP浓度为50μg/mL),孵育4h后,收集培养基和细胞,超声破碎细胞,冻干悬液,采用500μL甲醇溶解冻干产物,14,500rpm离心除去不溶物,取上清液用高效液相色谱仪检测。
结果显示:如图6所示,ApoE-pLIGHT@CaCP与GL261、DC2.4、RAW264.7和BV2细胞孵育4h后,即可在细胞内检测到大麻二酚。综上,CP可在细胞内被转化成原药大麻二酚。
实施例4:ApoE-pLIGHT@CaCP的脑靶向评价。
取对数生长期的bEnd.3细胞,按20,000每孔细胞数种于24孔Transwell小室中,当跨内皮电阻达到200Ω·cm2时可用于后续试验。分别将DiI标记的pLIGHT@CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP置于Traswell小室中,37℃培养4h后,分别取小室下层培养基检测DiI的荧光强度,计算纳米粒的跨内皮效率。为了验证ApoE所介导的跨内皮作用,在竞争性试验中,预先采用100μg/mL的ApoE多肽孵育1h后,再加入ApoE-pLIGHT@CaCP。
取健康6~8周龄C57BL/6小鼠,尾静脉注射DiR标记的pLIGHT@CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP,DiR的注射剂量为1mg/kg,在注射24h后,分离解剖大脑进行离体成像,并进行半定量分析。
采用C57BL/6小鼠构建原位GL261胶质母细胞瘤模型,在种瘤后的第10天,尾静脉注射DiR标记的pLIGHT@CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP,DiR的注射剂量为1mg/kg,在注射后的1、2、4、8、12和24h采用活体成像拍摄,在24h拍摄活体结束后,解剖获得离体大脑进行成像,并进行半定量分析。
结果显示:如图7A所示进行Transwell试验考察,结果如图7B所示,在ApoE多肽的作用下,可显著增加磷酸钙脂质体的跨BBB能力。如图7C和D所示,在健康小鼠上,ApoE也可显著增加磷酸钙脂质体的脑靶向性。如图7E-H所示,在活体和离体成像中发现,ApoE肽可显著增加磷酸钙脂质体对胶质瘤的体内靶向性。综述,ApoE多肽具有较好的脑靶向性,并可增强制剂对胶质瘤的靶向性。
实施例5:ApoE-pLIGHT@CaCP对抗原呈递细胞的活化作用。
通过体外试验证明,ApoE-pLIGHT@CaCP在细胞内可被成功转化为原药大麻二酚。因此,下面进一步考察ApoE-pLIGHT@CaCP对抗原呈递细胞的活化作用。
吞噬能力评估:分别将5000个RAW264.7和BV2细胞种于96孔板中,完全培养基贴壁培养过夜。将培养基换成DMEM或含有ApoE-CaCP、ApoE-pLIGHT@CaP和ApoE-pLIGHT@CaCP(CP=4.0μg/mL,pLIGHT=0.58μg/mL)的培养基,继续培养24h。接着将上清弃去,加入无血清培养基稀释的香豆素6标记的mPEG-PLA纳米粒,继续孵育2h。结束后,将上清弃去,采用PBS洗3遍,加入4%多聚甲醛固定15min后,PBS洗3遍,加入Hoechst染核10min后,PBS洗3遍,高内涵药物筛选系统检测各组细胞的香豆素6荧光强度,评估大麻二酚对各种RAW264.7和BV2细胞吞噬能力的影响。对于BMDCs细胞,以5×105个每孔的密度将其种于12孔板中,加入上述制剂孵育24h后,将培养基更换成无血清培养基稀释的香豆素6标记的mPEG-PLA纳米粒,继续孵育2h。结束后,采用PBS洗3遍,抗体anti-mouse eFluor-CD11c染色后,流式细胞仪检测香豆素6荧光强度。
细胞活化和抗原呈递评估:将BMDCs细胞种于12孔板中,加入DMEM或含有ApoE-CaCP、ApoE-pLIGHT@CaP和ApoE-pLIGHT@CaCP(CP=4.0μg/mL,pLIGHT=0.58μg/mL)的培养基,孵育24h后,将培养基更换为含100μg/mL OVA,孵育12h,收集细胞用PBS洗3遍,加入anti-mouse eFluor-CD11c、anti-mouse APC-CD86和FITC-CD80染色,评估DC细胞活化程度;加入anti-mouse APC-SIINFEKL-MHC-I和anti-mouse eFluor-CD11c抗体染色,PBS洗3遍后流式上机检测抗原呈递情况。
结果显示:吞噬能力考察结果见附图8A-C,经过ApoE-CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP孵育后,各抗原呈递细胞对纳米粒的吞噬能力显著增强。如附图8D所示,ApoE-CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP孵育后,CD80+CD86+阳性细胞显著增加,表明ApoE-CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP可显著促进DC细胞的成熟。如附图8E所示,ApoE-CaCP和ApoE-pLIGHT@CaCP孵育后,DC细胞对OVA抗原的呈递作用显著增加,表明ApoE-pLIGHT@CaCP可增强DC对OVA抗原的交叉呈递作用。
综上,磷酸化大麻二酚同样可促进抗原呈递细胞的活化。
实施例6(1):ApoE-CaCP的体内抗胶质瘤和免疫调控作用。
建立GL261原位胶质母细胞瘤模型,并考察ApoE-CaCP的抗肿瘤疗效和免疫调控作用,并初步筛选给药剂量。在接种原位胶质瘤的第6天开始给药,共给药5次,期间用生物发光监测肿瘤进展。在给药结束后,称定小鼠体质量,取出小鼠外周血、脑肿瘤、脾脏和胸腺。称定脾脏和胸腺,计算脾指数和胸腺指数。采用流式细胞术分析小鼠外周血和肿瘤内免疫细胞变化。
结果显示:如附图9a-c所示,在各ApoE-CaCP给药剂量下,无显著抗肿瘤作用,表明单独ApoE-CaCP的抗胶质瘤作用较弱。如附图9d、9e、9g和9h所示,胶质瘤导致荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数显著降低,而ApoE-CaCP显著提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数。如附图9f和9i所示,ApoE-CaCP治疗后,脾脏和胸腺中的细胞数量显著增加。如附图9j所示,ApoE-CaCP显著增加胸腺内T细胞数量。分析脾脏和外周血发现,如附图9k和9m所示,CD8+和CD4+T淋巴细胞数量显著增加。如附图9l和9m所示,脾脏和外周血中初始CD8+和CD4+T淋巴细胞也显著增加,与胸腺指数和胸腺内T细胞变化趋势一致,提示ApoE-CaCP治疗后增加了胸腺输出细胞。如附图10所示,ApoE-CaCP对肿瘤内浸润的CD8+和CD4+T细胞无显著影响。
综上,ApoE-CaCP可增强荷胶质瘤小鼠的系统性免疫,其中10mg/kg剂量最显著,但对肿瘤内浸润的CD8+和CD4+T细胞无显著影响,可能是导致其抗肿瘤疗效较弱的原因。
实施例6(2):ApoE-pLIGHT@CaCP的抗胶质瘤作用。
鉴于ApoE-CaCP可增强系统性免疫,但对局部肿瘤浸润T细胞量增加有限,下面将CP与T细胞招募的细胞因子LIGHT联用,考察其抗肿瘤疗效。建立GL261原位胶质母细胞瘤模型,并考察ApoE-pLIGHT@CaCP的抗肿瘤疗效,其中给药方案如附图11A所示。通过生物发光监测肿瘤进展,评估ApoE-pLIGHT@CaCP对胶质瘤的抑制作用。通过荷瘤小鼠生存期和体质量监测来进一步评估抗肿瘤药效。
结果显示:如附图11B-E所示,经过5次给药后,相比对照组和单药治疗组,ApoE-pLIGHT@CaCP显著抑制原位胶质瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存期,且可有效缓解荷瘤小鼠体质量的损失,表明CP联用细胞因子LIGHT能显著抑制原位胶质瘤生长。
实施例7:ApoE-pLIGHT@CaCP的体内免疫调控作用。
ApoE-pLIGHT@CaCP在体内可显著抑制GL261原位胶质瘤的生长,因此,我们进一步考察其对肿瘤局部和系统性免疫的影响。在原位GL261种瘤后的第6天,连续5次给药后的一天,解剖分离大脑,用4%多聚甲醛固定48h,依次用15%蔗糖溶液和30%蔗糖溶液脱水沉底,OCT包埋和冰冻切片,接着进行免疫荧光染色。给药结束后分离脑肿瘤,过70μm筛网获得单细胞悬液,PBS洗3遍后,分布进行流式抗体染色,结束后用4%多聚甲醛固定,流式细胞仪上机检测。称定小鼠体质量,收集脑肿瘤、脾脏、胸腺、引流淋巴结和外周血,采用ELISA检测肿瘤中的CCL21、CXCL13、IL-10和TGF-β细胞因子水平,称定脾脏和胸腺质量,计算脾指数和胸腺指数,并采用流式细胞术分析脾脏中的CD8+和CD4+T淋巴细胞、分析外周血中CD8+和CD4+T淋巴细胞以及肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞、分析淋巴结中CD80+CD86+阳性DC细胞以及CD8+和CD4+T淋巴细胞。
结果显示:如附图12A和B所示,经过ApoE-pLIGHT@CaCP给药治疗后,在LIGHT细胞因子作用下诱导肿瘤内形成高内皮微静脉(MECA39),肿瘤内浸润T细胞显著增加(图12C和D)。肿瘤中DC和活化DC比例显著增加,CD8+T、CD4+T、肿瘤特异性CD8+T细胞、B淋巴细胞比例显著增加,而免疫抑制细胞如髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Treg)和M2表型巨噬细胞比例显著降低(图12E)。与肿瘤内免疫细胞变化趋势一致,肿瘤内招募T和B淋巴细胞的趋化因子CCL21和CXCL13显著下调,而免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β则显著下调(图12F)。此外,经过ApoE-pLIGHT@CaCP治疗后,荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数显著增加(图12G),脾脏中CD8+T和CD4+T淋巴细胞比例显著增加(图12H),同样的趋势也在淋巴结和外周血中观察到(图12I和J),外周血中肿瘤特异性CD8+T细胞比例显著增加,表明对肿瘤的特异性免疫应答增强(图12I),而淋巴结中活化DC细胞比例的增加,也进一步验证免疫应答的增强。
综述,经过ApoE-pLIGHT@CaCP给药治疗后,显著增强了荷瘤小鼠体内的肿瘤局部和系统性免疫应答。
实施例8:ApoE-pLIGHT@CaCP与αPD-1抗体联用治疗胶质母细胞瘤。
ApoE-pLIGHT@CaCP可显著增强了荷原位胶质瘤小鼠体内的局部和系统性免疫应答,肿瘤内浸润的T细胞显著增加。因此,考察ApoE-pLIGHT@CaCP与ICB的联用疗效,以期为临床提供治疗方案和实际应用价值。
在原位GL261种瘤后的第6天开始给药,各组详细给药方案和时间点见附图13A所示,其中5%葡萄糖给药剂量为10mL/kg,TMZ给药剂量为20mg/kg,CP给药剂量为10mg/kg,LIGHT质粒给药剂量为1.5mg/kg,αPD-1抗体给药剂量为5mg/kg。采用生物发光监测肿瘤进展,并评估联用策略对荷瘤小鼠生存时间的改善情况,考察荷瘤小鼠的体质量变化。在最后一次给药后,解剖取得小鼠进行HE染色和Ki-67免疫组织化学染色。对于联用组长期存活的小鼠,在其对侧脑部再次接种GL261细胞,考察免疫记忆,以未做治疗的正常健康小鼠作为对照组,观察接种后小鼠的生存期。
结果显示:如附图13B和C所示,各给药组均显著抑制了原位胶质瘤的生长,其中ApoE-pLIGHT@CaCP+αPD-1对肿瘤的抑制作用最强,且可显著延长荷瘤小鼠的生存时间(图13D),在给药期间,ApoE-pLIGHT@CaCP+αPD-1组荷瘤小鼠的体质量无明显损失,在给药结束后荷瘤小鼠体质量稳步增加。如附图13F所示,HE染色结果表明5%葡萄糖组肿瘤生长旺盛,而ApoE-pLIGHT@CaCP+αPD-1组小鼠脑部肿瘤生长活性最弱,Ki-67染色也表明ApoE-pLIGHT@CaCP+αPD-1组肿瘤的增殖程度最弱。从附图13D可知,ApoE-pLIGHT@CaCP+αPD-1组中有5只小鼠长期存活,肿瘤二次挑战(图13G)试验表明,这5只小鼠可耐受肿瘤的二次接种,表明治疗后诱导了免疫记忆的形成。
Claims (9)
1.一种调控系统和局部免疫应答的共递释脂质体,其特征在于,以磷酸钙为内核,其中包载有两种药物:一种药物为调控系统性免疫应答的小分子药物,另一种药物为调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子,通过调控肿瘤宿主的系统和局部免疫应答来增加免疫荒漠型肿瘤中浸润的T细胞,提高免疫治疗的抗肿瘤效果;
所述调控系统性免疫应答的小分子药物选自具有免疫增强作用的天然产物,调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子选自炎性细胞因子或T细胞趋化因子。
2.根据权利要求1所述的共递释脂质体,其特征在于,所述调控系统性免疫应答的小分子药物为大麻二酚;所述调控肿瘤局部免疫应答的细胞因子为肿瘤坏死因子超家族第14个成员,又称为LIGHT蛋白;
所述小分子药物采用磷酸化的大麻二酚前药;所述LIGHT蛋白采用质粒形式,质粒为可编码LIGHT蛋白胞外段的序列。
3.根据权利要求2所述的共递释脂质体,其特征在于,其粒径为20~80 nm,编码LIGHT蛋白的质粒pLIGHT的载药量为0.1~0.5%,磷酸化前药CP的载药量为1~2%,包载的质粒与CP质量比为1:2~1:20。
4.根据权利要求2所述的共递释脂质体,其特征在于,所述可编码LIGHT蛋白胞外段序列,该序列包括信号肽Flt3l序列、异亮氨酸拉链ILZ序列和LIGHT胞外段序列三个部分。
5.根据权利要求2所述的共递释脂质体,其特征在于,所述磷酸钙内核采用两亲性磷脂1,2-油酰磷脂酸作为分散剂,其磷酸极性头部在油水界面与内核络合,疏水性尾部分布在油相,在内核表面形成具有稳定功能的疏水层;
所述磷酸钙内核采用磷脂作为包覆外层,磷脂选用(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺DOTAP,甲氧基封端聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺mPEG2000-DSPE和靶向肽修饰的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
6.根据权利要求5所述的共递释脂质体,其特征在于,所述共递释脂质体上修饰有肿瘤靶向肽;所述肿瘤靶向肽选自载脂蛋白A、载脂蛋白B、载脂蛋白E及其相应的合成多肽。
7.根据权利要求5所述的共递释脂质体,其特征在于,所述肿瘤靶向肽选自载脂蛋白E多肽ApoE,多肽序列为CWG-(LRKLRKRLLR)2-NH2,并与马来酰亚胺封端的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺连接,得到ApoE多肽修饰的聚乙二醇2000-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺ApoE-PEG2000-DSPE,便于修饰到脂质磷酸钙脂质体表面。
8.一种如权利要求1-7之一所述共递释脂质体的制备方法,其特征在于,具体步骤为:
(1)通过反相微乳法制备荷载细胞因子和小分子药物的磷酸钙脂质体核心;具体是将含有压缩后细胞因子的油包水型乳液加入到含有磷酸化小分子药物的油包水型乳液中,充分反应形成核心后,进行离心、洗涤;
(2)将磷酸钙纳米材料与脂质体材料混合,采用薄膜分散法制备磷酸钙脂质体;具体是把包载细胞因子和磷酸化小分子药物的磷酸钙核心与脂质材料进行薄膜分散,再通过水化法在磷酸钙核心上包覆不对称的脂质层。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于:
步骤(1)的具体流程为:
将两份20 mL的油相室温搅拌15~30 min,其中一份作为钙相,加入200~300 μL 2.5 MCaCl2和60~600 μg pLIGHT ,室温搅拌15-20 min;将100~300 μL 12.5 mM 的CP溶液和100~300 μL 12.5 mM 的Na2HPO4溶液混匀,加入至另一份油相中,作为磷相,搅拌15-20 min;将两相混合,加入100~300 μL DOPA氯仿溶液,搅拌45~90 min;搅拌结束后,加入无水乙醇破乳,4℃下12,500 g离心20 min,将沉淀用无水乙醇继续洗涤2遍,最后用氯仿重悬,磷酸钙纳米粒核心,-20℃保存待用;
步骤(2)的具体流程为:
将步骤(1)得到的磷酸钙纳米粒核心与DOTAP、mPEG2000-DSPE、胆固醇和ApoE-PEG2000-DSPE分散于氯仿中,旋蒸成膜,用5%葡萄糖或PBS水化薄膜,超声分散后得到共递释脂质体ApoE-pLIGHT@CaCP。
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